Muestras analizadas y cepas utilizadas

3.1.1 Cepas tipo y de referencia

En el presente estudio se utilizaron las cepas tipo de las 27 especies descritas a la fecha de realización de este trabajo de investigación, además de la cepa tipo de la especie "A. lusitana" que se encuentra en proceso de descripción. También se utilizaron cepas de referencia pertenecientes a nuestra colección así como las procedentes de otras colecciones de cultivo, que incluyeron cepas pertenecientes al género Aeromonas y a otros géneros bacterianos, como se muestra en el Anexo 1.

3.1.2. Cepas clínicas

Las 429 cepas clínicas analizadas en los estudios 4.3.5, 4.3.6 y 4.3.7, descritas en los Anexos 2A y 2B, fueron facilitadas por los siguientes hospitales: Hospital Universitario de Nagasaki (Japón, n=7), Hospital Universitario Miguel de Servet de Zaragoza (n=117), Hospital Universitario de Guadalajara (n=128), Hospital Universitario Joan XXIII de Tarragona (n= 102) y Hospital Universatio Sant Joan de Reus (n=75).

3.1.3. Muestras de agua

La muestras de agua regenerada fueron recolectadas en la EDAR de Castell d' Aro, Girona (post tratamiento secundario, post tratamiento terciario y agua de riego) y a la salida de la EDAR de Reus al entrar al proceso de lagunaje de la Comunidad de Regants del Molinet (el agua de entrada que proviene de un tratamiento secundario y post tratamiento terciario que corresponde con la salida del lagunaje). Así mismo se estudiaron muestras procedentes del canal de Poble Nou y bahía de Alfacs, ambos en la zona del Delta del Ebro, que reciben aguas residuales no tratadas. También se analizaron muestras de agua procedentes de los ríos Ter, Cardener y Llobregat.

Estas muestras fueron colectadas en botellas de polipropileno estériles de 2 L, transportadas en frío al laboratorio en donde fueron procesadas dentro del mismo día del muestreo.

Para el estudio de diversidad de Aeromonas en aguas regeneradas (4.2.2) se analizaron un total de 20 muestras, 10 de entrada del lagunaje (EL), procedentes de un tratamiento secundario de la EDAR de Reus y 10 de salida del lagunaje (SL), utilizada para el riego de hortalizas.

El procedimiento detallado a continuación es el aplicado en los estudios 4.1.3, 4.2.1 y 4.2.2. De cada muestra de agua, 100 µl fueron sembrados directamente (sin enriquecer) en tres medios de cultivo: agar dextrina ampicilina (ADA, HiMedia, India), agar almidón ampicilina (SAA, Palumbo y cols., 1985) y agar bilis irgasán verde brillante modificado (BIBG-m, Neyts y cols., 2000) e incubadas a 30ºC por 24 horas.. Paralelamente se realizó el cultivo enriquecido (10 ml de muestra) usando 90 ml de agua de peptona alcalina (pH= 8,7) suplementada con ampicilina (10mg/l), que se incubó a 30ºC por 24 horas. Finalizado este paso de enriquecimiento, 100 µl de cada muestra fue inoculado en los mismos tres medios de cultivo e incubados bajo las condiciones descritas previamente. Las colonias que presentaron morfología típica de Aeromonas fueron repicadas en TSA e incubadas bajo las mismas condiciones mencionadas anteriromente para obtener cultivos puros. Posteriormente se realizó la extracción de ADN empleando el kit Instagene™ Matrix (Biorad, Francia) y todos los aislados fueron identificados a nivel de género mediante la detección de la GCAT-PCR, que es específica para el género Aeromonas. Los aislados fueron genotipados mediante ERIC-PCR y la identificación a nivel de especie se realizó a través de la secuenciación del gen rpoD. En paralelo se realizó la cuantificación de Aeromonas mediante el método del NMP.

Además, en el estudio 4.2.2 se observó que Aeromonas es capaz de resistir el tratamento de lagunaje. Para comprender mejor este fenómeno, se realizó un estudio de recrecimiento. En este, dos tipos de agua, que diferían en la concentración de maetria orgánica, fueron utilizadas. Una pobre en nutrientes, como es el agua mineral y la otra rica en nutrientes, como es el caso del agua regenerada. Para esta última, se utilizaron muestras colectadas en dos sitios diferentes, una procedente de un tratamiento secundario de la EDAR de Reus, denominada entrada de lagunaje (EL) y la otra correspondiente al agua generada después del tratamiento de lagunaje, llamada salida de lagunaje (SL). El agua mineral fue directamente inoculada con las cepas de Aeromonas, mientras que el agua regenerada fue previamente esterilizada mediante filtración

empleando botellas estériles de 500 ml con filtros de 0,22 µm (Corning Incorporated, EEUU). Para cada tipo de muestra, tres botellas (A, B y C) que contenían un volumen final de 100 ml fueron utilizadas. Las dos cepas de Aeromonas empleadas en este estudio fueron aisladas a partir de agua regenerada. Una de ellas, Aeromonas caviae SELE10-16B fue recuperada de la entrada de lagunaje, mientras que Aeromonas veronii SSL7-15 fue aislada de la salida del lagunaje. Ambas cepas fueron previamente identificadas mediante secuenciación del gen rpoD. La concentración bacteriana inicial inoculada a acada botella fue de 3,3x108 ufc/ml para A. caviae SELE10-16B y 4,4x108 ufc/ml para A. veronii SSL7-15. La botellas fueron incubadas a dos temperaturas, 20ºC y 35ºC por 35 días. La cuantificación de Aeromonas (en los días 0, 1, 3, 6, 10, 14, 21, 28 y 35) fue realizada por triplicado mediante recuento directo en placa, usando medio ADA. Las placas fueron incubadas a 30ºC por 24 horas. Los resultados fueron expresados como el promedio de cada muestra.

Además, 400 µl de cada muestra enriquecida y sin enriquecer fueron utilizados para la extracción de ADN y detección molecular directa de Aeromonas mediante GCAT-PCR usando los cebadores y condiciones descritas en el estudio 4.1.2.

Las cepas aisladas a partir de las muestras de agua analizadas en estos trabajo son enumeradas en el Anexo 3.

3.1.4. Muestras de mariscos y vegetales

En el estudio de los moluscos bivalvos (4.2.3) se analizó un total de 11 muestras de mariscos correspondientes a una muestra de almeja y cinco muestras de mejillones y cinco muestras de ostrones. Estos fueron cultivados en la bahía de Alfacs y en el canal del Poble Nou, ambos ubicados en el Delta del río Ebro, donde son vertidas aguas residuales no tratadas. Además, tres muestras de vegetales (lechuga, tomate y perejil), regados con aguas regeneradas procedentes de la EDAR Castell d' Aro (Girona) fueron analizados en el estudio 4.2.1.

De cada muestra de alimento, 10gr fueron homogeneizados usando 90 ml de agua alcalina tamponada (pH=7,2) y 100 µl de estos fueron directamente sembrados en ADA, SAA y BIBG-m e incubados a 30ºC por 24 horas. En paralelo se realizó el cultivo enriquecido (1:10 gr/ml) empleando las mismas condiciones descritas para las

muestras de agua. Las cepas obtenidas del análisis de estas muestras son presentadas en el Anexo 4.

3.1.5. Conservación de las cepas

Tanto las cepas aisladas en este trabajo como las enviadas desde diferentes instituciones fueron mantenidas a largo plazo mediante ultra congelación, en donde las cepas fueron inoculadas en viales que contenían caldo tripticasa de soya (TSB, Difco) con un 15% de glicerol. Los viales fueron congelados a -80ºC.