MUESTRAS TUMORALES Y NO TUMORALES

4.2.1. Obtención de las muestras de los pacientes

Una vez obtenido el listado de los pacientes preseleccionados es necesario confirmar que de cada uno de ellos se dispone, en el Banco de Tumores del HCSC, muestra congelada tanto tumoral como no tumoral. El Banco de Tumores del HCSC se rige bajo las normas establecidas por la Ley 14/2007, de 3 de julio, de Investigación biomédica y por el Real Decreto 1716/2011, de 18 de noviembre, por el que se establecen los requisitos básicos de autorización y funcionamiento de los biobancos con fines de investigación biomédica y del tratamiento de las muestras biológicas de origen humano, y se regula el funcionamiento y organización del Registro Nacional de Biobancos para investigación biomédica. Uno de los principales requisitos que cabe destacar es la obligación de información por parte del facultativo correspondiente al paciente y la consecuente firma del Consentimiento Informado por éste demostrando que está de acuerdo en que el Banco de Tumores almacene en sus instalaciones el material tumoral y no tumoral excedente del diagnóstico para destinarlo a investigación biomédica.

Desde su creación en el año 2000, el Banco de Tumores del HCSC, utiliza protocolos estandarizados para la selección, congelación y el mantenimiento de las muestras. Es el patólogo el que sobre la pieza pulmonar en fresco selecciona las muestras a congelar identificando macroscópicamente las zonas afectas, de donde obtiene las muestras tumorales y de regiones alejadas mínimo entre 7-10 cm, las muestras de parénquima pulmonar no tumoral. Posteriormente se depositan en criomoldes perfectamente identificados y se embeben en medio criosolidificable OCT compound Tissue-Tek (Sakura. Tokio, Japón) para su congelación en isopentano a -80ºC. Por último, los bloques

de tejido congelado se almacenan de manera organizada en el arcón congelador de -80ºC hasta el momento de su uso.

4.2.2. Criterios de calidad de las muestras de los pacientes

La inclusión final de los pacientes en el estudio depende de que sus correspondientes muestras congeladas cumplan los siguientes criterios de calidad respecto a la representación mínima de células para el estudio y a la integridad del RNA extraído.

▪ Representación mínima de células para el estudio. Las muestras congeladas y almacenadas en el Banco de Tumores del HCSC se someten a revisión histológica por parte de dos patólogos de manera independiente para evaluar:

-En el caso de las muestras tumorales, si poseen una representación ≥ 70% de células tumorales.

-En el caso de las muestras de parénquima pulmonar no tumoral, si poseen una representación del 100% de células normales.

▪ Calidad del RNA. El RNA extraído de las muestras congeladas, tanto tumorales como no tumorales, debía superar el criterio mínimo de calidad establecido e indicado mediante RIN (RNA Integrity Number) teniendo que ser siempre ≥ 7.5.

4.2.2.1. Muestras tumorales de CNMP: revisión histológica.

Es fundamental realizar el análisis histológico de las muestras tumorales congeladas que se van a utilizar, ya que es imprescindible que en ellas exista un porcentaje representativo de las células que queremos estudiar, en nuestro caso células tumorales de CNMP, y por el contrario, debemos evitar una elevada contaminación con parénquima pulmonar no tumoral.

Se consideró que para el estudio de microarrays únicamente se incluyeran aquellas muestras congeladas que superaran el 70% de células tumorales.

El protocolo para la revisión histológica de las muestras congeladas (figura 10) se basa en realizar en cada una de ellas un corte de 4 µm en criostato Leica Biosystems CM1850 (Wetzlar, Alemania) que se tiñe con Hematoxilina-Eosina (HE) y que se utiliza para la obtención del porcentaje de células tumorales. Si se supera el límite mínimo establecido, se recogen alrededor de 20 cortes de 25 µm en eppendorff de 2 ml para la extracción de ácidos nucleicos. Los eppendorff utilizados son estériles y libres de

DNA/RNA. Por último, se realiza un nuevo corte de 4 µm para una segunda tinción de HE en la que se valora de nuevo el porcentaje de células tumorales para así confirmar que se seguía cumpliendo con el criterio mínimo de representación tumoral exigido.

Los cortes iniciales y finales teñidos con HE de cada una de las muestras tumorales de CNMP fueron evaluados al microscopio por dos patólogos de manera independiente para evaluar si el porcentaje de células tumorales superaba el mínimo establecido en cada uno de ellos para poder incluir la muestra tumoral en el estudio.

Figura 10. Estudio histológico para la selección de muestras de pacientes con CNMP. El criterio establecido fue poseer como mínimo un 70% de células tumorales para que la muestra de ese

paciente pudiera ser incluida en el estudio.

Por otra parte, se utilizaron las secciones de tejido teñidas con HE y destinados al diagnóstico anatomopatológico de los pacientes finalmente incluidos en el estudio, para llevar a cabo el análisis de los parámetros histopatológicos de los tumores que no podían ser obtenidos del informe anatomopatológico como los descritos en la tabla 6 del presente trabajo. En la rutina de trabajo del Servicio de Anatomía Patológica, las biopsias diagnósticas se fijan en formol tamponado durante 24 horas, se tallan para ser incluidas en cassettes y se introducen en el procesador de tejidos el cual, de manera automática, va realizando diferentes pases para deshidratarlas y depositarlas en parafina. En este punto ya es posible elaborar los bloques de parafina a partir de los cuales se realizan cortes en micrótomo que se tiñen con HE y que pueden ser revisados en el microscopio de luz

óptica. Todo este proceso mantiene más intacta la histología de los tumores que el proceso de congelación al que son sometidas las muestras de Biobanco.

Ya que la evaluación de los parámetros histopatológicos que se detallan a continuación requiere una muy buena preservación de la histología de los tumores, se optó porque fueran evaluados en las secciones de tejido teñidas con HE y destinadas al diagnóstico anatomopatológico de los pacientes finalmente incluidos en el estudio.

La presencia de linfocitos intratumorales (TILs), la inflamación aguda (caracterizada por la presencia de leucocitos polimorfonucleares, PMN, entre los que se incluyen los neutrófilos, eosinófilos y basófilos), la inflamación crónica (caracterizada por la presencia de células monucleares entre las que se incluyen los macrófagos, linfocitos y células plasmáticas), la necrosis y la cantidad de estroma tumoral fueron valorados por dos patólogos de manera independiente.

Los TILs se consideraron positivos o presentes cuando aparecían más de 2 linfocitos por campo de gran aumento (CGA) en el componente epitelial del tumor. La inflamación aguda se consideró positiva o presente cuando aparecían más de 2 PMN por CGA tanto en el componente epitelial como en el estroma. Respecto a la inflamación crónica se consideró moderada/fuerte cuando, en el estroma tumoral, se identificaron células linfoplasmocitarias que representaban al menos el 10% de la población celular total. La necrosis se consideró presente cuando más del 10% del tumor mostraba áreas necróticas. La cantidad de estroma tumoral se consideró baja cuando representaba menos del 20% de todo el componente tumoral y media / alta cuando representaba más del 20% (tabla 7).

Tabla 7. Parámetros histopatológicos de las muestras del estudio.

PARÁMETRO CATEGORÍA TILs Inflamación aguda Inflamación crónica Necrosis Estroma tumoral Ausente / Presente Ausente / Presente Ausente / Débil Moderada / Fuerte Ausente / Presente Bajo Medio / Alto

4.2.2.2. Muestra de referencia o “pool”: revisión histológica

En los estudios de microarrays con hibridación doble o competitiva, todas las muestras a estudio se hibridan frente a una única muestra común denominada “muestra referencia” o “pool” que en nuestro caso consistió en una mezcla de RNAs de parénquima pulmonar no tumoral obtenido de 42 pacientes seleccionados al azar de los 84 finalmente incluidos en el estudio. Mediante la revisión histológica se confirmó que todas las muestras utilizadas para constituir la muestra de referencia o “pool” únicamente

incluyeran parénquima pulmonar sin representación de células tumorales (100% células normales). Una vez extraído y cuantificado el RNA se constituyó el “pool”

utilizando la misma concentración de RNA de cada una de las 42 muestras en un volumen final suficiente para poder llevar a cabo todas las hibridaciones del estudio.