Mutaciones en el codón 12 de K-RAS

Utilizando los primers K-RAS-12-FWD1 y K-RAS-12-REV1 se amplifica por PCR un fragmento de 109 pb que incluye el codón 12 de K-RAS. El primer forward incluye una sustitución de una G por una C para crear un sitio de restricción para el enzima BstN1 y el primer reverse se encuentra marcado con el fluorocromo FAM-6 en su extremo 5´ (tabla 16).

K-RAS-12-FWD1 ACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGACCT (30pb)

K-RAS-12-REV1 (FAM-6)-CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC (25pb)

Tabla 16. Secuencia de los primers para PCR del codón 12 de K-Ras (5´ 3´). En el primer KRAS-12-

FWD1 se sustituyó una G por una C y el primer KRAS-12-REV1 se encuentra marcado con el fluorocromo

FAM en su extremo 5´.

La mezcla de reacción de PCR contiene: BioTaq DNA Polymerasa 5 U/l (Bioline), buffer reacción de PCR 10xNH4 (Bioline), MgCl2 50 mM (Bioline), dNTPs 200 M cada

uno (Applied Biosystems) y primers 10 pmol/l cada uno (Sigma-Aldrich). La PCR se llevó a cabo con los siguientes tiempos y temperaturas: 94ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 58ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. El correcto funcionamiento de la PCR se comprueba en un gel de acrilamida al 6 %.

Del volumen restante de PCR se utilizan 5 l para llevar a cabo la restricción enzimática en la que se utiliza 1,5 l de BstN1 (New England Biolabs), 1,5 l de buffer 2 (New England Biolabs) y 2 l de agua. La mezcla de reacción se incuba durante 3 horas a 37ºC en termobloque. Del producto de PCR-RFLP se realiza una dilución 1:3 en formamida y se añade 0.8 l de marcador de peso molecular GeneScan 500(-250) LIZ (Applied Biosystems).

Las muestras se desnaturalizan a 95ºC durante 15 minutos y se mantienen a 4 ºC durante 5 minutos. Se someten a una electroforesis capilar con polímero POP7 usando el analizador genético ABI 3100 y el programa de análisis de fragmentos GeneMapper versión 4.0 (Applied Biosystems).

El hecho de presentar la mutación heterocigota para el codón 12 de K-RAS implica que, en la hebra de DNA mutada, desaparece la diana de restricción para el enzima BstN1 (New England Biolabs) por lo que en el analizador de fragmentos observamos dos picos uno de 109 pb y otro de 80 pb que corresponden a la hebra de DNA con secuencia mutada y a la hebra de DNA con secuencia WT respectivamente. Por el contrario, en las muestras con secuencia WT para el codón 12 la diana de restricción para el enzima se mantiene con lo que es capaz de actuar sobre las dos hebras de DNA y en consecuencia aparece un único pico de 80 pb (figura 17).

Figura 17. Imagen del programa GeneMapper. En la parte superior, muestra de CPNM que no presenta mutación en el codón 12 de K-RAS y en la parte inferior, muestra de CPNM que presenta mutación en el

codón 12 de K-RAS. 4.8.2.2. Mutaciones en el codón 13 de K-RAS

Se utilizan los primers K-RAS-13-FWD1 y K-RAS-13-REV1 para amplificar por PCR un fragmento de 106 pb que incluye el codón 13 de K-RAS. El primer forward incluye una sustitución de una G por C para eliminar un sitio de restricción para el enzima HaeIII y se encuentra marcado con el fluorocromo TET-6 en su extremo 5´. El primer reverse incluye una sustitución de una C por una G para crear un sitio de restricción para el enzima HaeIII (New England Biolabs) (tabla 17).

K-RAS-13-FWD1 (TET-6)-TAACGCCTGCTGAAAATGACTG (22pb)

K-RAS-13-REV1 GTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTAGG (26pb)

Tabla 17. Secuencia de los primers para PCR del codón 13 de K-RAS (5´ 3´). En el primer

K-RAS-13-FWD1 se sustituyó una G por una C y se encuentra marcado en su extremo 5´ con

fluorescencia y en el primer K-RAS-13-REV1 se sustituyó una C por una G.

Tanto la mezcla de reacción como las condiciones de la PCR son las mismas que las descritas para el codón 12 de K-RAS. El correcto funcionamiento se comprueba en un gel

de acrilamida al 6 %. Del volumen restante de PCR se utilizan 5 l para llevar a cabo la restricción enzimática añadiéndoles 1,5 l de HaeIII (New England Biolabs), 1,5 l de buffer 4 (New England Biolabs) y 2 l de agua. La mezcla de reacción se incuba durante 3 horas a 37ºC en termobloque. Del producto de PCR-RFLP se realiza una dilución 1:3 en formamida y se añade 0.8 l de marcador de peso molecular GeneScan 500(-250) LIZ (Applied Biosystems).

Las muestras se desnaturalizan a 95ºC durante 15 minutos y se mantienen a 4 ºC durante 5 minutos. Se someten a una electroforesis capilar con polímero POP7 usando el analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems) y los resultados se obtuvieron utilizando el programa de análisis de fragmentos GeneMapper versión 4.0 (Applied Biosystems). El hecho de presentar la mutación en el codón 13 de K-RAS implica que desaparece un sitio de restricción para el enzima Hae III (New England Biolabs) por lo que en el análisis de los resultados observamos que las muestras con mutación heterocigota para el codón 13 de K-RAS muestran dos picos, uno de 79 pb y otro de 53 pb que corresponden a la hebra de DNA con secuencia mutada y a la hebra de DNA con secuencia WT respectivamente. Por el contrario, en las muestras con secuencia WT para el codón 13 en ambas hebras de DNA, la diana de restricción para el enzima se mantiene con lo que es capaz de actuar y en consecuencia aparece un único pico de 53 pb (figura 18).

Figura 18. Imagen del programa GeneMapper. En la parte superior, muestra de CPNM que no presenta mutación en el codón 13 de K-RAS y en la parte inferior, muestra de CPNM que presenta mutación en el

codón 13 de K-RAS. 4.8.3. Estudio de mutaciones en el gen B-RAF

El análisis de la mutación T1796A (exón 15) se realizó siguiendo la técnica descrita por Cohen y cols. (2003). De manera general el diseño del estudio se basa en el análisis del tamaño de los productos generados en la PCR tras ser sometidos a restricción enzimática

53 pb WT

53 pb WT 79 pb _mut

(PCR-RFLP). Se utilizaron los primers B-RAF-Ex15-FWD1 y B-RAF-Ex15-REV en los que el primer forward fue marcado con fluorocromo FAM-6 (Tabla 18).

B-RAF-Ex15-FWD1 (FAM-6)-GCTTGCTCTGATAGGAAAATGAG (23 bases)

B-RAF-Ex15-REV1 GTAACTCAGCAGCATCTCAGG (21 bases)

Tabla 18. Secuencia de los primers para PCR de B-RAF (5´ 3´). El primer B-RAF-Ex15-FWD1 se encuentra marcado con fluorescencia en su extremo 5

La mezcla de reacción de PCR contiene: BioTaq DNA Polymerasa 5 U/l (Bioline), buffer reacción de PCR 10xNH4 (Bioline), MgCl2 50 mM (Bioline), dNTPs 200 M cada

uno (Applied Biosystems) y primers 10 pmol/l cada uno (Sigma-Aldrich).

La PCR se llevó a cabo con los siguientes tiempos y temperaturas: 94ºC durante 5 minutos, 35 ciclos de 94ºC durante 45 segundos, 58ºC durante 45 segundos y 72ºC durante 45 segundos, y una extensión final a 72ºC durante 10 minutos. El correcto funcionamiento de la PCR se comprueba en un gel de acrilamida al 6 %.

Del volumen restante de PCR se utilizan 5 l para llevar a cabo la restricción enzimática en la que se utiliza 1,5 l de TspR1 (New England Biolabs), 1,5 l de buffer 2 (New England Biolabs ) y 2 l de agua. La mezcla de reacción se incuba durante 3 horas a 65ºC en termobloque. Del producto de PCR-RFLP se realiza una dilución 1:3 en formamida y se añade 0.8 l de marcador de peso molecular GeneScan 500(-250) LIZ (Applied Biosystems). Las muestras se desnaturalizan a 95ºC durante 15 minutos y se mantienen a 4 ºC durante 5 minutos. Se someten a una electroforesis capilar con polímero POP7 usando el analizador genético ABI 3100 (Applied Biosystems) y el programa de análisis de fragmentos GeneMapper versión 4.0 (Applied Biosystems).

El hecho de presentar la mutación T1796A implica la desaparición de la diana de restricción del enzima TspR1 (New England Biolabs) obteniéndose una banda prominente de 212 pb correspondiente al alelo mutado y las bandas residuales del alelo normal (125 pb y 87 pb). Cuando la secuencia es WT, la diana de restricción del enzima no ha desaparecido, con lo que es capaz de digerir el fragmento amplificado obteniéndose únicamente los dos fragmentos de 125 pb y 87 pb (figura 19).

Figura 19. Imagen del programa GeneMapper. En la parte superior, muestra de CPNM que no presenta mutación en el exón 15 de B-RAF y en la parte inferior, muestra de CPNM que presenta mutación en el exón

15 de B-RAF.