OBSERVACIÓN DE CORTES ANATÓMICOS CON LA TÉCNICA DE MICROSCOPIA ELECTRÓNICA

Solo para el experimento I se observaron las líneas de fusión en la zona de unión del injerto y portainjerto, se tomaron muestras de los cortes antes de realizar el injerto (día 0), al final del experimento (a los 102 días), se selecciono el injerto más desarrollado en función de los tratamientos, los cortes que se realizaron en la toma de muestras del injerto fueron corte transversal y longitudinal.

Las muestras se procesaron con la técnica de Microscopia Electrónica de Barrido (MEB), en el Laboratorio de Microscopia Electrónica del Colegio de Postgraduados Campus Montecillo. La técnica consiste en 5 procesos que fueron: a) Toma y fijación, b) Deshidratación, c) Secado, d) Montaje de la muestra, e) Almacenamiento.

4.11.1 Muestreo de material vegetal

La toma de muestras se llevó a cabo al momento de realizar el corte de los materiales a injertar (Figura 2A), y a los 102 días después de realizado el injerto, se utilizó glutaraldehido al 3% disuelto en una solución Buffer de fosfatos (0.2M, a pH 7.4), como fijador para proporcionar resistencia estructural interna (fijar las proteínas), con el objetivo de conservar las muestras hasta el momento de procesarlas (Figura 2B y 2C), para su posterior observación en el Microscopio Electrónico de Barrido (MEB), las muestras se mantuvieron en refrigeración en el Laboratorio de Nutrición Vegetal del Instituto de Recursos Naturales (IRENAT) del Colegio de Postgraduados.

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Figuras 2. Toma de muestra para su observación en el MEB; A) Corte de la muestra, B)

Colocación de la muestra en el fijador, C) Muestras colectadas de cada especie injertada.

4.11.2 Deshidratación de las muestras

Previo a la deshidratación de las muestras, estás se lavaron para eliminar la solución fijadora, posteriormente se procedió a deshidratarlas para extraer toda el agua de la muestra, para sustituir el agua por alcohol etílico.

Como el fijador utilizado estaba en un medio acuoso la deshidratación se inicio a partir del 10% de alcohol etílico y después se aumento gradualmente 10% la concentración de alcohol etílico en cada lavado, hasta llegar al 100% de alcohol, el tiempo de permanencia de las muestras fue de una hora (suficiente para la impregnación de alcohol de la muestra), tiempo en el cual la exposición de la muestra se mantuvo en refrigeración. El último lavado se realiza tres veces con alcohol al 100% (puro).

4.11.3 Secado de muestras

Las muestras se secaron en una secadora (Sauri-780A), utilizando el método de “secado de punto crítico”, dicho proceso se extrajo toda el agua de la muestra, y el alcohol absoluto en el cual estaba inmerso el material, dicho alcohol fue sustituido por bióxido de carbono en estado líquido, sin que la muestra se hubiese secado en ningún momento, posteriormente se elevó la presión y temperatura hasta alcanzar y rebasar las condiciones de punto crítico del CO2 con esto, el CO2 paso del estado líquido al gaseoso sin que la muestra se sometiera a la fuerza de la tensión superficial que actuó siempre sobre el sustrato.

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4.11.4 Montaje

El montaje de las muestras secas consiste en pegarlas mediante un adhesivo especial a la superficie de un portaobjetos o portamuestras, que es un cilindro de acero inoxidable, con una superficie útil de un centímetro de diámetro, antes de hacer el montaje los portaobjetos se pulieron con un abrasivo en pasta del tipo “polish” y se lavaron con un cepillo y detergente; después de lavarlos con agua, se enjuagaron con alcohol absoluto y se dejaron secar sobre un papel absorbente, posteriormente los portaobjetos se manejaron con pinzas para evitar dejar en ellos la grasa de los dedos al manipularlos. El adhesivo que se utilizó fue cinta adhesiva con pegamento por ambos lados, cortada en círculos de diámetro ligeramente menor que el del portainjerto.

4.11.5 Cubrimiento

Para que el Microscopio Electrónico de Barrido pueda obtener una señal electrónica de la preparación es necesario que esta tenga en su superficie una finísima cubierta metálica, para ello los electrones primarios, procedentes del catión electrónico, chocan con el metal que cubre la muestra y hacen que de él salgan los electrones secundarios, que constituyen la señal electrónica que el microscopio procesa para producir una imagen de video. Las muestras se recubrieron de oro durante 4 minutos en una ionizadora (Ion Sputter JFC-1100, Jeol, Fine Coat).

Para cubrir las muestras se colocaron alrededor de una placa de oro que se encuentra en el centro de una campana de vidrio de la ionizadora, en la que se hace vacío con una bomba rotatoria, esta campana funciona como un tubo de Geissler donde el oro es el cátodo, mientras que un anillo metálico que lo rodea es el ánodo, entre estos polos se aplica una corriente eléctrica de alto voltaje con lo que el gas residual dentro de la campana se ioniza, separándose en iones positivos y electrones.

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4.11.6 Manejo de las muestras

Después del recubrimiento de las muestras se sacaron de la campana y se colocaron con unas pinzas en una caja petri esterilizada la cual se sello con parafilm, para evitar su contaminación o daño de las muestras dado que en estos momentos eran muy quebradizas sumamente hidrófilas y prácticamente no pesaban, luego se colocaron en una cámara de vació en la cual permanecieron hasta el momento de observarlas en el MEB.

Las muestras se observaron en un Microscopio Electrónico de Barrido (Jeol 35-C) operando a 15 Kv. Las imágenes se capturaron en una película negativa blanco y negro Plus-X 125 asa 120 (Kodak profesional). Una vez revelada la película, se escaneo con un escáner (HP Scan Jet 4800) y las imágenes se pasaron de negativo a positivo con el procesador de imágenes (Gimp 2.2).