Todos los experimentos se realizaron manipulando el voltaje (y por consecuencia el campo eléctrico) para lograr el atrapamiento de las proteínas con el mínimo campo eléctrico aumentando gradualmente su intensidad hasta observar la Dielectroforesis atrapante. Se realizó un barrido del voltaje para poder encontrar el mínimo campo eléctrico para atrapar la proteína. En primer lugar se aplicó un campo eléctrico de 100 V/cm y se observó el microdispositivo previamente llenado con el medio de suspensión y la proteína; al no observar ningún cambio en el sistema se aumentó el campo eléctrico en incrementos de 100 V/cm hasta observar algún cambio en el sistema como un detenimiento en el flujo de la proteína (si en ese campo eléctrico aplicado se observa un atrapamiento significativo se puede considerar como el campo eléctrico mínimo necesario para lograr el atrapamiento de proteínas); si aún no se ha manifestado un atrapamiento suficientemente contundente, en ese momento se incrementa el campo eléctrico de 50 V/cm hasta que se aprecie con mayor fuerza el atrapamiento de las proteínas y ese valor de campo eléctrico se considera el mínimo necesario para lograr el atrapamiento de la proteína.
Durante los experimentos se cuidó que la altura de la proteína en la pipeta de entrada fuera la misma que la del medio de suspensión, ya que una diferencia en esas alturas podía provocar flujo hidrostático lo cual afectaría la observación de la Dielectroforesis; además, al atrapar las proteínas, el líquido de suspensión seguía fluyendo hacia el reservorio de salida provocando una diferencia en el nivel de la proteína y el medio de suspensión (entrada y salida del microcanal) que a su vez provocaba que el líquido se comenzara a regresar, ese campo eléctrico también indicaba que arriba de él ya no se podían atrapar proteínas.
También fue importante durante la experimentación cuidar que no se formaran burbujas de aire en el microcanal provocando electrólisis y dicha electrólisis se podía provocar de dos maneras, la primera de ellas era que al llenar el microcanal quedaran burbujas de aire
dentro y la segunda forma consistía en que al aplicar un alto campo eléctrico (superior al del atrapamiento) el líquido comenzaba a calentarse provocando la ebullición y por ende la formación de burbujas de aire que actuaban como aislantes al aplicar el campo eléctrico, lo cual afecta a los resultados experimentales. En los experimentos se debe de cuidar también que no se sature el sistema ya que si se aplica el campo eléctrico por mucho tiempo se corre el riesgo de que se comience a llenar el microcanal de proteína, se sature el sistema y provoque que no se pueda observar un buen atrapamiento. La carga de la proteína es negativa y el electrodo positivo es el de la entrada por lo que la proteína tendrá una fuerza de atracción hacia la derecha (entrada del reservorio) que es donde está el electrodo con carga positiva.
6.3
GEOMETRÍA 1, PH 8, CONDUCTIVIDAD 27 µS/CM.
Se atraparon proteínas a 2150 V con una conductividad de 27 µS/cm y pH 8 en el microcanal de vidrio número 5 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se observa que la fuerza electrocinética domina ya que las partículas fluyen a lo largo del microcanal (Figura 25 a) y que al aplicar un campo eléctrico de 2150 V la Electroforesis domina por lo que la proteína se atrapó (Figura 25 b).
a) b)
Figura 25. Atrapamiento de proteína a 2150 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 470 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra la proteína fluyendo libremente
en el microcanal (domina la Fuerza Electrocinética) y en la Figura b) se observa que al aplicar un campo eléctrico de 2150 V se comenzaron a concentrar las proteínas repeliéndose de la región de mayor intensidad de campo eléctrico.
6.4
GEOMETRÍA 1, PH 8, CONDUCTIVIDAD 50 µS/CM.
Se atraparon proteínas a 1500 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 8 en el microcanal de vidrio número 6 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se observa que al aplicar 1500 V/cm se observa cómo se concentra la proteína (
Figura 26 a y b).
a) b)
Figura 26. Atrapamiento de proteína a 1500 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 470 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. En la Figura a) se observa cuando apenas se comienzan a concentrar las proteínas inmediatamente al aplicar 1500 V/cm, en la Figura b) se observa que al transcurrir algunos segundos con el mismo campo eléctrico (1500 V/cm) la proteína se comienza a concentrar más fuertemente repeliéndose de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico.
6.5
GEOMETRÍA 1, PH 8, CONDUCTIVIDAD 75 µ/CM.
Se atraparon proteínas a 650 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 8 en el microcanal de vidrio número 5 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se observa cómo la proteína está suspendida por lo que la fuerza electrocinética domina (Figura 27 a) y posteriormente al aplicar 650 V/cm se empieza a concentrar la proteína (Figura 27 b).
a) b)
Figura 27. Atrapamiento de proteína a 650 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 470 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. En la Figura a) se observa la proteína suspendida fluyendo en líneas de corriente lo cual implica que la Electrocinética domina parcialmente el movimiento de las proteínas pero en la Figura b) se observa que al aplicar 650 V/cm la proteína comienza a concentrarse observándose una repulsión de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico que es la región entre los postes.
6.6
GEOMETRÍA 2, PH 8, CONDUCTIVIDAD 27 µS/CM.
Dentro de los resultados del atrapamiento de proteínas empleando la dielectroforesis con aisladores en microdispositivos de vidrio se tiene el atrapamiento de proteínas a 1300
(geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se aprecia cómo la proteína está concentrada (Figura 28 y Figura 28 b).
a) b)
Figura 28. Atrapamiento de proteína a 1300 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. En las Figuras a) y b) se observa la concentración de proteínas mostrando DEF negativa, es decir, las proteínas van a alejarse de las regiones con mayor concentración de campo eléctrico (el centro de los postes), es decir, las proteínas se alejan de la región formada entre los postes que fungen como trampas dielectroforéticas.
6.7
GEOMETRÍA 2, PH 8, CONDUCTIVIDAD 50 µS/CM.
Dentro de los resultados del atrapamiento de proteínas empleando la dielectroforesis con aisladores en microdispositivos de vidrio se tiene el atrapamiento de proteínas a 1100 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 8 en el microcanal de vidrio número 7 (geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, en las imágenes se observa cómo la proteína empieza a concentrarse (Ver Figura 29 a ) y en otro experimento se atrapó la proteína aglomerada al aplicarse el campo eléctrico (Figura 29 b).
a) b)
Figura 29. Atrapamiento de proteína a 1100 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra un experimento donde la proteína comienza a concentrarse observándose DEF negativa. La Figura b) muestra un segundo experimento donde la proteína está aglomerada y al aplicarse 1100 V/cm la proteína se comienza a atrapar repeliéndose de la región de mayor intensidad de campo eléctrico.
6.8
GEOMETRÍA 2, PH8, CONDUCTIVIDAD 75 µS/CM.
Dentro de los resultados del atrapamiento de proteínas empleando la dielectroforesis con aisladores en microdispositivos de vidrio se tiene el atrapamiento de proteínas a 500 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 8 en el microcanal de vidrio número 7 (geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se observa que la proteína está atrapándose (Figura 30 a) al aplicarse 400 V/cm y se logra observar un mayor atrapamiento de las proteínas al aplicarse los 600 V/cm (Ver Figura 30 b).
a) b)
Figura 30. Atrapamiento de proteína a 500 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra un experimento en el cual al aplicarse 400 V/cm la proteína comienza a atraparse y en la Figura b) se observa una concentración de proteínas a 600 V/cm las cuales buscan ser repelidas de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico.
6.9
GEOMETRÍA 1, PH 9, CONDUCTIVIDAD 27 µS/CM.
Se atraparon proteínas a 2950 V/cm con una conductividad de 27 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 5 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, en las imágenes se observa cómo se concentra la proteína a 2900 V/cm aglomerada de ASB repeliéndose de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico y posteriormente liberándose (Figura 31 a y b) y la Figura 31 c muestra otro atrapamiento a 3000 V/cm bajo las mismas condiciones.
c)
Figura 31. Atrapamiento de proteína a 2950 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 470 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra el atrapamiento de las proteínas al aplicar 2900 V/cm. En la Figura b) se deja de aplicar el campo eléctrico y esas proteínas (aglomeradas) son liberadas y en la Figura c) se observa otro experimento a 3000 V/cm donde la proteína está concentrándose repeliéndose de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico observándose DEF negativa.
6.10
GEOMETRÍA 1, PH 9, CONDUCTIVIDAD 50 µS/CM
Se atraparon proteínas a 2500 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 5 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se puede apreciar en la Figura 32 a) cómo la proteína está suspendida y posteriormente se observa el atrapamiento al aplicar 2500 V/cm en la Figura 32 b.
a) b)
Figura 32. Atrapamiento de proteína a 2500 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. En la Figura a) se observa cómo la proteína está suspendida al aplicar campos eléctricos menores a 2500 V/cm (la electrocinética domina parcialmente a la DEF) y la Figura b) muestra cómo al aplicarse 2500 V/cm se concentran las proteínas generándose el atrapamiento de las mismas por lo que se puede observar la Dielectroforesis atrapante negativa ya que las proteínas muestran una repulsión de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico.
6.11
GEOMETRÍA 1, PH 9, CONDUCTIVIDAD 75 µS/CM.
Se atraparon proteínas a 1050 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 5 (geometría 1) con postes aisladores cuya abertura es de 40 micras teniendo un diámetro del poste de 470 micras y distancia de 510 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se aprecia la proteína teñida concentrada en las regiones entre los postes al aplicar 1050 V/cm (Figura 33 a y b).
a) b)
Figura 33. Atrapamiento de proteína a 1050 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 510 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a muestra cómo la proteína es concentrada al aplicarse 1050 V/cm y la Figura b nos permite observar cómo las proteínas comienzan a fluir al dejar de aplicar el campo eléctrico necesario para su concentración.
6.12
GEOMETRÍA 2, PH 9, CONDUCTIVIDAD 27 µS/CM
Se atraparon proteínas a 2400 V/cm con una conductividad de 27 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 8 (geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una, se observa que al aplicar el campo eléctrico la proteína se atrapa (Figura 34 a) y al dejar de aplicar el campo eléctrico la proteína se empieza a liberar (Figura 34 b).
a) b)
Figura 34. Atrapamiento de proteína a 2400 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 470 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a nos permite observar la concentración de proteínas al aplicar 2400 V/cm y al mismo tiempo ser repelidas de las regiones de mayor concentración de campo eléctrico y cómo al dejar de aplicar el campo eléctrico la proteína es liberada y fluye (Figura b).
6.13
GEOMETRÍA 2, PH 9, CONDUCTIVIDAD 50 µS/CM
Se atraparon proteínas a 2100 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 8 (geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una. Se observa que la proteína aglomerada se atrapa a 2000 V/cm repeliéndose de la región con mayor intensidad de campo eléctrico (Figura 35 a) y en otro experimento se aprecia la concentración de proteínas a 2200 V/cm bajo las mismas condiciones (Figura 35 b).
a) b)
Figura 35. Atrapamiento de proteína a 2100 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un en microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra proteína aglomerada concentrada al aplicar 2000 V/cm. La Figura b) muestra cómo la proteína es concentrada a 2200 V/cm formando una imagen cónica que implica que las proteínas son repelidas de las regiones de mayor intensidad de campo eléctrico presentándose la DEF negativa.
6.14
GEOMETRÍA 2, PH 9 CONDUCTIVIDAD 75 µS/CM
Se atraparon proteínas a 750 V/cm con una conductividad de 50 µS/cm y pH 9 en el microcanal de vidrio número 8 (geometría 2) con postes aisladores cuya abertura es de 80 micras teniendo un diámetro del poste de 440 micras y distancia de 520 micras de centro a centro con 8 columnas de 4 postes cada una. Se aprecia que se comienza a concentrar la proteína al aplicar 800 V (Figura 36 a) y en otro experimento bajo las mismas condiciones se aprecia cómo la proteína comienza a concentrarse al aplicarse un campo eléctrico de 700 V/cm (Figura 36 b).
a) b)
Figura 36. Atrapamiento de proteína a 750 V/cm en un canal con un diámetro de los postes de 440 micras y con una distancia de centro a centro de 520 micras en un en microdispositivo de vidrio. La dirección del flujo es de derecha a izquierda. La Figura a) muestra la proteína suspendida y cómo ésta comienza a concentrarse al aplicarse los 800 V/cm. En la Figura b) se observa otro experimento a 700 V/cm en el cual la proteína comienza a repelerse de las regiones de mayor intensidad de campo.
La Tabla 6 muestra un resumen de las diferentes geometrías, conductividades, pH y el campo eléctrico para lograr el atrapamiento de las proteínas.
Tabla 6. Resultados de los experimentos realizados en microdispositivos de vidrio.
CAMPO ELÉCTRICO MÍNIMO PARA EL ATRAPAMIENTO (V/cm)* TABLA DE RESULTADOS Geometría 1 Geometría 2 σ1 = 27 µS/cm 2150 1300 σ1 = 50 µS/cm 1500 1100 PH 8 σ1 = 75 µS/cm 650 500 σ1 = 27 µS/cm 2950 2400 σ1 = 50 µS/cm 2500 2100 PH 9 σ1 = 75 µS/cm 1050 750
*Estos valores son el promedio de los resultados experimentales realizados.
Con respecto a los resultados obtenidos empleando microdispositivos de vidrio, la gráfica presentada a continuación (Figura 37) muestra el campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento de proteínas ASB para la geometría 1 para un pH 8 y pH 9. Ese campo eléctrico se obtuvo en forma cualitativa ya que poco a poco se fue incrementando su
magnitud hasta que se observó mediante el microscopio el atrapamiento de las proteínas. Cada punto representa un resultado experimental para una conductividad, un pH y una geometría específica (Gemetría 1) con el objetivo de observar el efecto de las variables mencionadas anteriormente en la magnitud mínima necesaria para obtener Dielectroforesis atrapante.
Figura 37. Gráfica mostrando el campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento dielectroforético en la Geometría 1.
A continuación se presenta la siguiente gráfica (Figura 38) que muestra el campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento de proteínas ASB para la geometría 2 para un pH 8 y 9.De manera análoga se observan los resultados del campo eléctrico mínimo necesario para la concentración de proteínas mediante la Dielectroforesis empleando la Geometría 2 para dos diferentes valores de pH. Cada punto representa el valor del campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento bajo un determinado valor de pH y de conductividad.
Figura 38. Gráfica mostrando el campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento dielectroforético en la Geometría 2.
La siguiente gráfica (Figura 39) muestra los Resultados obtenidos en la Dielectroforesis para lograr el atrapamiento de la proteína ASB en las dos geometrías para dispositivos de vidrio variando las propiedades del medio de suspensión como son su conductividad y pH. En esta gráfica se muestran todos los resultados de este trabajo experimental y por ende los valores de los campos eléctricos mínimos requeridos para lograr el atrapamiento de las proteínas con dielectroforesis empleando estructuras aisladoras por lo que se logró el objetivo de este trabajo.
Figura 39. Gráfica que muestra el campo eléctrico mínimo para lograr el atrapamiento de proteínas.
A continuación se observa el valor del Factor de Claussius-Mossoti, cuya magnitud y signo son muy importantes para la comprensión de los resultados, dicho factor se obtuvo con la Ecuación 12.
Tabla 7. Factor de Claussius-Mossotti para los medios de suspensión empleados.
σ partícula (µS/cm)* σ(µS/cm) medio Factor CM 0.001 27 -0.49997 0.001 50 -0.49998 0.001 75 -0.49999 * Zheng y col., 2004.
7
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
La Figura 39 muestra que a medida que la conductividad del medio decrece, la magnitud del campo eléctrico aplicado decrece para lograr el atrapamiento de las proteínas y esta conclusión tiene su fundamento en la Ecuación de Clausius-Mossotti (Ecuación 11):
( )
m P m p K σ σ σ σ ω 2 + −= ya que la conductividad de la partícula siempre es la misma en todos los experimentos y la conductividad del medio es la que está variando, así que a medida que la conductividad del medio vaya aumentando el factor de Claussius-Mossotti aumenta su magnitud, la conductividad de la partícula es aproximadamente 1 nS/cm (Zheng y col., 2004) y todas las conductividades de los medios de suspensión son superiores a dicho valor (27, 50 y 75 µS/cm) por lo que en todos los casos presentó DEF Negativa. A mayor conductividad de medio el factor de Clausius-Mossotti aumentará en magnitud y como la fuerza fielectroforética está dada por la Ecuación 8,