Obtención y procesamiento de las muestras

Inmediatamente después de la perfusión se procedió a la decapitación del animal con una guillotina. Se realizó una incisión longitudinal en la piel desde la región nasal hasta el occipital. Se separaron los músculos insertados en el cráneo, y éste se desperiostizó hasta alcanzar ambos conductos auditivos externos. Se abrió con cizalla el hueso occipital por su línea media, y desde aquí se eliminaron ambos parietales. Se extrajo el contenido endocraneal y se visualizaron ambos peñascos por vía suboccipital. Para extraer el temporal es necesario seccionar la base del cráneo entre ambas bullas con cizalla o tijera fuerte, pero de forma controlada para evitar líneas de fractura que puedan afectar a ambos temporales. Esta maniobra se complica en los sujetos adultos por existir una osificación plena de las suturas y un engrosamiento óseo generalizado. Una vez individualizadas las bullas timpánicas se limpiaron de restos musculares, contenido encefálico, periostio y grasa. La apertura de la bulla se realizó con punzón o gubia, y siempre evitando la pared medial, ya que en ella se implanta la cóclea, con su eje mayor orientado anteroinferiormente.

Las cócleas se perforaron a nivel del ápex y de la espira basal o bien se perfundieron con formol (para estudio con microscopia óptica) o glutaraldehído (para estudio con MEB) lentamente a través de las ventanas redonda y oval, una vez extraído el estribo, para evitar desgarros de las estructuras membranosas por presión excesiva, y posteriormente se introdujeron en un recipiente con el mismo fijador durante toda la noche (Tabla 3.3). El objetivo de esta fase es preservar el tejido haciéndolo resistente a ulteriores cambios autolíticos o por reacción con los agentes utilizados en su procesamiento.

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La postfijación de órganos se realizó con formol al 10% para el estudio con microscopio óptico y con glutaraldehído al 25% para el estudio con microscopia electrónica de barrido.

3.8.2.1. Procesamiento de las cócleas para microscopia óptica

Cuando las cócleas se iban a observar mediante microscopio óptico se procedió conforme al siguente protocolo:

Se introducen las cócleas en ácido etilendiaminotetracético (EDTA, abreviatura inglesa de ethylenediaminetetraacetic acid) al 10% durante 7-14 días, realizando cambios diarios para mantener el pH entre 5,5 y 6,5, hasta conseguir una descalcificación adecuada. El objetivo de esta fase es la extracción de las sales de calcio presentes en los huesos y hacer posible el corte de la pieza.

A continuación se elimina el EDTA que queda en solución para evitar su reacción con el alcohol que se va a utilizar en la siguiente fase. Para esto se utiliza un tampón fosfato 0,1 M a pH 7.4.

Las cócleas se tallan seccionándolas por el modiolo y se realiza el proceso de inclusión en parafina, que tiene como objeto incluir el material de estudio en un bloque sólido que una vez endurecido pueda ser cortado en secciones.

La primera fase consiste en la deshidratación de los tejidos, que se logra al pasar la pieza sucesivamente por alcohol de graduación creciente (hasta llegar a una concentración de alcohol etílico al 100%), xilol y parafina (Merck ®, a 56-58°C). El bloque de parafina se hace en una estación semiautomática de trabajo (Oxford Trade).

Se realizan cortes de 5-7 micras de espesor con un microtomo LEITZ 1512, y se colocan en portaobjetos pretratados con albúmina como adhesivo. Se realiza una tinción

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con hematoxilina-eosina, previa desparafinización con Histolemon ®, y rehidratación con alcoholes de graduación decreciente hasta emplear agua corriente.

3.8.2.2. Procesamiento de las cócleas para microscopia electrónica de barrido (MEB) Cuando las cócleas se iban a procesar para microscopio electrónico de barrido, fue necesario abrir ampliamente el hueso para descubrir el órgano de Corti. Bajo amplificación con la lupa quirúrgica, se extrajo la pared ósea de la cóclea con una aguja de insulina. La punta de la aguja debe penetrar en la cápsula pero no introducirse en los espacios subyacentes, para evitar dañar el laberinto membranoso. A partir del orificio creado, se fue fracturando el hueso mediante movimientos dirigidos de dentro hacia fuera hasta exponer el contenido de la rampa timpánica, media y vestibular, que quedan ocultas por la cara externa del ligamento espiral. A continuación con unas pinzas de relojero se extrajo el ligamento espiral junto con la estría vascular adherida a su cara interna y, se guardó en un tubo de eppendorf con glutaraldehído, para una investigación paralela (206). Las cócleas se guardaron en glutaraldehído al 3% en buffer cacodilato sódico 0,1 M bien identificadas.

A las 24-48 horas se procedió a la deshidratación de las muestras sumergiéndolas en alcoholes de creciente graduación. Primero en alcohol de 20º, después 40º, 60º, 80º y finalmente en tres frascos en alcohol de 100º. Se sumergieron las muestras unos 15-20 minutos en cada recipiente.

A continuación se realizó el punto crítico (sistema Emitec 850). El secado de punto crítico es un método para secar tejidos sin que éstos se colapsen o se deforme su estructura original. Al secar un tejido con aire o al vacío se generan daños en las superficies que se van a observar mediante MEB. Esto se debe a las fuerzas de tensión que se crean en cavidades de pequeñas dimensiones donde hay una interfase

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líquido/gas. En el caso de muestras delicadas esto puede provocar que la estructura se colapse completamente. Se utilizó el CO2 líquido como medio de secado. Es el más utilizado porque no es caro y es ecológicamente aceptado en comparación con el Freon 113.

Posteriormente se montaron las piezas en soportes adecuados, y el tejido pudo entonces metalizarse antes de ser colocado en el microscopio electrónico de barrido (Phillips XL-30 o Hitachi S-3000N)para su observación y análisis de imagen. El metal empleado fue oro y esto se hizo mediante un recubridor BIORAD modelo SC 502 sputter.