Survivina i resistència al tractament
3.1.3 Paper de p53 en la regulació de l’apoptosi
Un 60-80% dels CaOV presenta alteració molecular del gen TP53 (mutacions puntuals o delecions 17). La proteïna p53 també s’anomena “guardià del genoma” perquè és l’encarregada de coordinar la resposta cel·lular enfront un gran ventall d’estímuls tant diversos com: l’estrés produït pel trencament en una cadena de DNA, per radiacions UV, activitats oncogèniques, entre d’altres. Depenent del tipus i el nivell d’estímul, p53 pot actuar activant mecanismes d’apoptosi, senescència, aturada de cicle cel·lular, reparació del dany al DNA, metabolisme cel·lular o autofàgia (Vogelstein et al. 2000). Per portar a terme qualsevol d’aquestes accions, p53 actua com a factor de transcripció activant o reprimint la transcripció de gens essencials per cada resposta. La proteïna p53 es troba molt ben regulada per un seguit de modificacions post-traduccionals durant l’homeòstasi en cèl·lules normals i en resposta a un estímul d’estrés. L’activació de p53 consta de tres passos principals:
l’estabilització de la proteïna p53, l’antirepressió i l’activació del promotor específic. L’estabilització de p53 implica la seva fosforilació (per ATM, ATR, DNA-PK, Chk1/2) i els nivells de Mdm2; l’antirepressió per Mdm2 està regulada per l’acetil·lació i fosforilació de p53; i l’activació dels gens diana de p53 que impliquen modificacions post- traduccionals addicionals com l’acetil·lació (segons l’acetil·lació de p53 s’activaran uns gens o altres) i la concentració de cofactors (Kruse & Gu 2009).
3.1.3.1 Estructura i funció de p53
El gen TP53 es localitza al braç curt del cromosoma 17 i conté 11 exons amb dos llocs alternatius de transcripció, i diverses formes de splicing alternatiu. Hi ha fins a 9 isoformes diferents de p53, la funcionalitat de les quals està sent estudiada
(http://p53.bii.a-star.edu.sg/aboutp53/index.php). Existeixen variants polimòrfiques
de p53 que poden associar-se amb els nivells de mRNA de p53 i l’augment de càncer
(Gemignani et al. 2004); aquests polimorfismes també poden modular la resposta a la
quimioteràpia (Sullivan et al. 2004). La proteïna p53 consta de 393 aminoàcids, i mitja dotzena de dominis participen en la seva funció (Fig.34) (Olsson et al. 2007).
En la regió amino-terminal (aminoàcids 1-44) conté el domini de transactivació (TAD, Transactivation Domain) imprescindible per l’activació transcripcional dels gens diana de p53. Conté el domini acídic de transactivació i el lloc d’unió a Mdm2, el qual inhibirà la funció transcripcional de p53. El domini ric en prolines (PR, Proline-Rich domain) (aminoàcids 58-101) facilita la interacció proteïna-proteïna i que condueix la resposta de p53 induïda pel dany al DNA, activant el procés d’apoptosi. El domini d’unió a DNA (aminoàcids 102-292) és on es troben la majoria de mutacions (<90%). El 28% de les quals succeeixen en sis residus (Fig.34) (Vousden & Lu 2002). El domini d’oligomerització (aminoàcids 325-356) consisteix en una cadena beta que interacciona amb l’altre monòmer de p53 per formar un dímer, seguida d’una hèlix alfa, la qual efectua la dimerització de dos dímers de p53 per formar un tetràmer. Una p53 funcional actua de forma tetramèrica, constituïda per dos homodímers de p53. En aquest domini també se situa una de les dues senyals d’exportació del nucli (NES, Nuclear Export Signal). En la regió carboxi terminal, hi ha 3 senyals de localització nuclear (NLS, Nuclear Localization Signal). La més N-terminal (aminoàcids 316-324) que consisteix en tres residus de lisina, és la més conservada (Fig.34).
Figura 34. Dominis de la proteïna p53. El domini d’unió al DNA és la diana de més del 90% de les mutacions de p53 trobades en càncers humans (http://p53.bii.a-star.edu.sg/aboutp53/index.php; Vousden & Lu 2002).
3.1.3.2 Regulació de p53 a través de la interacció amb Mdm2
Podem definir l’activació de p53 com un increment en la concentració de la proteïna i un augment en la seva activitat transcripcional cap a gens amb resposta a p53. En cèl·lules normals amb absència d’estrés i de mutacions per TP53, la proteïna p53 presenta una vida mitjana molt curta (de 6 a 20 minuts), els nivells de la qual estan molt regulats principalment per l’activitat E3 ubiqüitin lligasa de la proteïna Mdm2. Mdm2 i p53 es regulen mútuament a través d’un circuit de retroalimentació autoreguladora (Wu et al. 1993). Quan p53 s’activa i els seus nivells són alts, p53
actua com a activador transcripcional del gen MDM2 (Barak et al. 1993). Mdm2 amb
una vida mitjana molt curta degut a la seva activitat autoubiqüinitzadora, interactua amb p53 inhibeix la seva activitat mitjançant (Fig.35):
Unió al domini de transactivació de p53 (posició N-terminal) i inhibició de la seva activitat transcripcional (Momand et al. 1992; Chen et al. 1993).
Exportació de p53 del nucli al citoplasma promovent la seva degradació i la inhabilitat per accedir als gens diana.
Mdm2 té activitat E3 lligasa, promou la conjugació de p53 a poliubiqüitina. Aquesta conjugació a poliubiqüitina marca a p53 per ser degradada via proteosoma (Kubbutat et al. 1997).
Figura 35. Regulació de p53 per Mdm2. p53 i Mdm2 formen un loop de retroalimentació autoregulatori. P53 estimula l’expressió de Mdm2. Mdm2 inhibeix l’activitat de p53 bloquejant la seva activitat transcripcional, afavorint la sortida de p53 del nucli i estimulant la seva degradació. El dany al DNA o l’activació d’oncògens indueixen l’activació de p53. Els oncògens regulen positivament a ARF, que evita la degradació de p53 mitjançant la inhibició de Mdm2. De forma similar, els inhibidors de la unió p53-Mdm2 haurien d’activar l’activitat supressora de tumors de p53 a cèl·lules que expressen p53 salvatge. Aquests compostos a l’unir-se amb Mdm2 podrien afectar també les activitats de Mdm2 independents de p53 (Chene 2003).
El lloc d’interacció entre ambdues proteïnes es troba en el domini N-terminal de p53, anomenat BOX1. En la interacció Mdm2-p53, s’ha observat que hi participen un nombre limitat de residus d’aminoàcids que són fonamentals per la interacció entre ambdues proteïnes. Únicament tres aminoàcids de p53 són essencials per la unió Mdm2-p53: Phe19, Trp23 i Leu26, els quals són inserits a una butxaca hidrofòbica que es troba a la superfície de la molècula de Mdm2 (Fig.36) (Klein & Vassilev 2004; Shangary & Wang 2008).
3.1.3.3 Mecanismes d’estabilització i activació de p53
L’activació de p53 depèn de senyals d’estrés, tant intrínsecs com extrínsecs (llum UV, hipòxia, dany al DNA, deprivació de nutrients, senyals oncogèniques, etc.). Aquests estímuls estan relacionats amb mecanismes que controlen la fidelitat de la replicació del DNA, la segregació dels cromosomes i la divisió cel·lular.
Les senyals d’estrés que rep la cèl·lula són detectades ràpidament (entre 1 minut i 1 hora) per unes proteïnes que transmetran la informació a p53, i regularan la seva concentració i activitat. La proteïna p53 rep unes modificacions post- traduccionals, les quals poden donar-se a diferents llocs i impliquen: fosforilacions, acetil·lacions, metil·lacions, ubiqüinitzacions, sumolitzacions i neddilacions (Fig.37). A més, segons el tipus de dany al DNA, Mdm2 s’autopoliubiqüinitza degradant-se i incrementant els nivells de p53 (Harris & Levine 2005; Levine et al. 2006).
Figura 37. Diversitat de senyals que porten a l’activació de p53 (Harris & Levine 2005).
3.1.3.4 Dianes moleculars de p53
Existeixen gens diana de p53 implicats en l’aturada de cicle cel·lular com: CDKN1A, 14-3-3σ i GADD45. Altres estan implicats en l’apoptosi, ja sigui la via extrínseca (CD95/FAS/APO1, DR4,DR5) o la via intrínseca (BAX, NOXA,PUMA) i
altres que ajuden a l’apoptosi encara que per mecanismes desconeguts (PERP, SCOTIN, P53, AIP, i alguns PIG) (Levine et al. 2006). Existeixen altres gens diana de p53: p48 i p53R2, implicats en la reparació del DNA, que contraresten les espècies reactives d’oxigen; altres que estan implicats en la comunicació cel·lular i que donen lloc a proteïnes de secreció: IGF-BP3 (que evita que IGF-1 activi una resposta de creixement), PAI i maspin (inhibidors de proteases), trombospondina (anti- angiogènica), o TSAP-6 (augmenta la producció d’exosomes) (Fig.38).
Figura 38. Via de p53. Gens regulats i respostes cel·lulars (Harris & Levine 2005; Levine et al. 2006).