PRÁCTICA 1 PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO

Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalas que la mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran:

1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios.

2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo.

3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave u olla Express.

4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 o_{C, pero existe}

mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo.

5. La mayoría de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungoso.

6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular.

El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es

proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible.

Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:

1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc.… se requieren en forma de extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave.

2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maíz, agar etc.… son los más usados.

3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser:

a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas.

b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante.

c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes. A continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de fitopatología en el mundo.

OBJETIVOS

Aprender a elaborar los medios de cultivo.

MATERIAL REQUERIDO EQUIPO

Autoclave Olla Express

MATERIAL Papas Agua destilada Matraces Tubos de ensayo Vasos de precipitado REACTIVOS Agar Dextrosa Carbonato de calcio Jugo V8 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

a). Elaboración de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayoría de hongos y bacterias.

Papa partida 200 gr.

Dextrosa (glucosa) 13 gr.

Agar 18-16 gr.

Agua destilada 1000 ml

1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua.

2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver. 3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle

ambos líquidos, agregue la dextrosa y homogenice.

4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la esterilización.

5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20 libras/pulgada2 _{(± 120} o_{C durante 15-20 minutos) contados a partir del}

momento en que se alcance la presión ya mencionada.

6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo. Los tubos de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar)

para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A ciertos

medios selectivos también se le pueden incorporar PCNB, Benomyl u otros fungicidas pero en dosis bajas (mg /lt).

b). Elaboración de V8-agar.

Para Phycomycetes y otros

Jugo V8 200 ml

Carbonato de calcio 3 gr

Agar 16-18 gr

Agua destilada 800 ml

Agregue 200 ml de jugo V8 a 800 ml de agua tibia, agregue el carbonato de calcio y el agar agitando la mezcla, caliente en baño Maria hasta disolver el agar. Una vez que el agar este disuelto, lleve el volumen a 1000 ml con agua destilada. Vacíe el medio en recipientes adecuados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión durante 20 minutos.

c). Elaboración de agua-agar.

Phycomycetes y otros. No crecen bacterias.

Agar 16 gr.

Agua destilada hasta completar 1000 ml

Disuelva el agar en 800 ml de agua utilizando un baño Maria, una vez disuelto, lleve el volumen con agua a 1000 ml, vacíe el medio en recipientes apropiados y esterilice en el autoclave a 15 libras de presión.

INFORME DE RESULTADOS

BIBLIOGRAFÍA

Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p.

López, A.G. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad Autónoma de Chapingo, México.

4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE