UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SINALOA UNIDAD REGIONAL NORTE
ESCUELA SUPERIOR DE AGRICULTURA DEL VALLE DEL FUERTE
MANUAL DE PRÁCTICAS DEL LABORATORIO DE FITOPATOLOGÍA
ELABORADO POR:
Ing. Jesús G. Loredo Vega
Ing. Jorge Daniel Mena Adriano
INTRODUCCIÓN ... 3
1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS ... 3
1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO ... 4
1.3 MATERIAS QUE APOYA ... 4
2. CONDICIONES DEL LABORATORIO ... 5
2.1 INFRAESTRUCTURA ... 5 2.2 PERSONAL ADSCRITO ... 5 2.3 EQUIPO ... 6 2.4 MATERIALES ... 6 2.5 REACTIVOS ... 6 2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD ... 7 3. REGLAMENTO ... 7 3.1 ORGANIZACIÓN ... 7 3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES ... 8 3.2.1 LABORATORISTAS ... 8 3.2.2 PROFESORES ... 8 3.2.3 ESTUDIANTES ... 9 3.2.4 TESISTAS ... 9 3.2.5 PERSONAS EXTERNAS ... 9 3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS ... 10 3.4 SANCIONES ... 10 4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS ... 11 4.1 Nematología VI semestre ... 11
4.1.1 PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO. ... 11
4.1.2 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS) ... 13
4.1.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS) ... 16
4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS ... 18
4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS ... 20
4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS ... 22
4.2 Bacteriología y virología, VII semestre. ... 24
4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO ... 24
4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ... 26
4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS ... 28
4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR ... 31
4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD ... 32
4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH ... 34
4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA ... 35
4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS ... 37
4.3 Fitopatología General. IV semestre. ... 40
4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO ... 40
4.3.2 PRÁCTICA 2. AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS ... 44
4.3.3. PRÁCTICA 3. ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE
HONGOS FITOPATÓGENOS ... 47 4.3.4 PRÁCTICA 4. SÍNTOMAS CAUSADOS POR HONGOS FITOPATÓGENOS ... 51 4.3.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD DE HONGOS
FITOPATÓGENOS ... 53 4.3.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE PHYCOMYCETES ... 56 4.3.7 PRÁCTICA 7. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE DEUTEROMYCETES. ... 58 4.3.8 PRÁCTICA 8. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE ASCOMYCETES. ... 60 4.3.9 PRÁCTICA 9. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE IMPORTANCIA AGRÍCOLA DE LA CLASE BASIDIOMYCETES. ... 62 4.3.10 PRÁCTICA 10 ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO ... 64 4.3.11 PRÁCTICA 11. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS ... 66 4.3.12 PRÁCTICA 12. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA,
TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR ... 69 4.3.13 PRÁCTICA 13. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD ... 70 4.3.14 PRÁCTICA 14. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO. ... 72 4.3.15 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS) ... 73 4.3.16 PRÁCTICA 16. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS) ... 76 4.3.17 PRÁCTICA 17. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS ... 78 4.3.18 PRÁCTICA 18. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS ... 80 INTRODUCCIÓN
1.1 IMPORTANCIA DE LAS PRÁCTICAS
La vinculación teoría-práctica es una necesidad ineludible en el proceso de enseñanza-aprendizaje de cualquier rama de las ciencias biológicas, premisa que se reproduce para el caso particular de las asignaturas que están estrechamente relacionadas con el departamento de parasitología.
El presente manual se ha elaborado con fines didácticos y aplicaciones prácticas para que los estudiantes que estén cursando las materias afines, tengan las herramientas básicas para trabajar en el manejo de microorganismos, manejo de equipo y otros materiales en el laboratorio de fitopatología. De tal manera que se incluyen los procedimientos para el análisis de muestras de vegetales en la identificación y/o detección de agentes fitopatógenos, también se incluyen los pasos a seguir en la esterilización del material a utilizar por ejemplo cristalería y medios de cultivo, así como el manejo del material vegetal para lograr aislar al agente causal, pruebas para evaluar su patogenicidad e identificación, además se incluyen las diferentes fórmulas para la elaboración de medios de cultivo para tal fin.
En el presente trabajo, siempre serán bien recibidas las críticas constructivas por parte de colegas y estudiantes para mejorarlo y/o actualizarlo de manera constante.
1.2 DEFINICIÓN DEL MARCO DE ACCIÓN DEL LABORATORIO
El Laboratorio de Fitopatología de la Escuela de Agricultura del Valle del Fuerte, es un espacio donde se llevan a cabo distintas actividades como trabajos de investigación de tesitas, prestadores del Servicio Social, se les brinda apoyo a investigadores que imparten cursos de áreas afines con prácticas de laboratorio, se atiende a otras instituciones educativas sobre el funcionamiento del mismo, señalando que su actividad principal es atender las necesidades de enseñanza del plan de estudios de la E.S.A.V.F., para que los alumnos puedan realizar experimentos prácticos necesarios para comprobar los conocimientos teóricos que se les imparte en el aula y proporcionarles las herramientas para realizar aplicaciones reales de los conocimientos adquiridos.
En el Laboratorio de Fitopatología se imparten prácticas relacionadas con la observación e identificación de microorganismos patógenos como: hongos, bacterias, nematodos, virus, etc. También se observan e identifican microorganismos no patógenos de cultivos que forman parte de la microflora del suelo.
1.3 MATERIAS QUE APOYA Plan 2
• Bacteriología y Virología
• Conservación de Granos Almacenados • Cultivos I • Cultivos II • Dinámica de Enfermedades • Fitopatología Económica • Fruticultura Especial • Fruticultura General • Horticultura General • Micología • Microbiología de Suelos • Nematología • Protección Vegetal Plan 3
• Cultivos Básicos y Oleaginosas • Fitopatología General
2. CONDICIONES DEL LABORATORIO 2.1 INFRAESTRUCTURA
El laboratorio de fitopatología cuenta con la infraestructura necesaria y el equipamiento suficiente para la observación e identificación de hongos, bacterias y nematodos fitopatógenos, y para cubrir las necesidades del mismo.
AREA DE PRACTICAS PRINCIPAL
Cuenta con cinco mesas de trabajo con cubierta de acero inoxidable cada una y un total de 45 sillas y 17 bancos de laboratorio, con un pintarrón, un televisor para presentación de imágenes, un herbario fitopatológico, cajonera para el resguardo de muestras del herbario, el laboratorio tiene una capacidad para 50 personas, un espacio apropiado para la campana de flujo laminar, con capacidad para cinco personas. Señalando que esta área cuenta con suministro de gas el cual se requiere para trabajos de muchas de las prácticas.
ÁREA DE NEMATOLOGÍA
Cuenta con tres mesas de acero inoxidable, dos lavamanos, una columna de Collman, centrifuga, una autoclave, archivero, vitrina para el resguardo de material, estante para libros y documentos, dos escritorios y una computadora. Con capacidad para 30 personas.
ÁREA DE PREPARACIÓN DE PRÁCTICAS
Cuenta con una mesa para preparación de prácticas, una vitrina para el resguardo de cristalería y microscopia, un lavamanos, una incubadora, una estufa Arnold, un microboy, un congelador, una vitrina para resguardo de reactivos, tres vitrinas chicas y un escritorio. Capacidad para 20 personas.
2.2 PERSONAL ADSCRITO
LABORATORISTA (Turno matutino) Ing. Jesús G. Loredo Vega.
Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresado de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte generación 2002-2007. Profesor adscrito a esta área cubriendo el turno respectivo por el Ing. Hugo Beltrán Peña, quien se encuentra realizando un posgrado en el Colegio de Posgraduados Campus Montecillo, en Texcoco estado de México. LABORATORISTA (Turno vespertino) Ing. Julia E. Hernández Luna.
Ingeniero agrónomo Parasitólogo egresada de la Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte, generación 1991-1996. Profesora adscrita a esta área cubriendo el turno vespertino.
2.3 EQUIPO
MICROPLATE READER FOTOCOLORIMETRO PARA ELISA MODELO-STAT FAX 3200
SERIE 3200-2155
MARCA – AWARENESS TECHNOLOGY 08040952 51563 WESCO 52905 WESCO 52906 WESCO 52907 WESCO 72891 LEYCA 51559 WESCO 51562 WESCO 30123 ZEISS (1411J229923) 72890 LEYCA 141122970 ZEISS MICROSCOPIOS DE DISECCION 8615243 SWIFT 52901 WESCO 52903 WESCO 52902 WESCO 51561 WESCO 52904 WESCO
MICROSCOPIO CON CAMARA DE VIDEO DIJI PLUS LABOMED
También se cuenta con el equipo necesario para el aislamiento y purificación de microorganismos como campana de flujo laminar, microboy, y el equipo para la esterilización de materiales usados en las distintas prácticas de laboratorio.
2.4 MATERIALES
El laboratorio de Fitopatología cuenta con el material suficiente para la realización de las prácticas de las asignaturas afines, algunos ejemplos de estos son:
2 Campanas de secado (p/nematodos) Vidrios de reloj
Tubos de ensayo
Matraces Erlen Meyer de varias medidas Pipetas Mecheros de alcohol Cajas Petri Vasos de precipitado Probeta graduada 2.5 REACTIVOS
Agar nutritivo Alcohol
Lacto fenol claro Lacto fenol azul Agar bacteriológico Agar papa dextrosa Agar agar
Aceite de inmersión
2.6 MEDIDAS DE SEGURIDAD
El laboratorio de fitopatología de la E.S.A.V.F., cuenta con las siguientes medidas de seguridad: 1 extintor 2 regaderas de emergencia 1 botiquín Señalamientos de seguridad 3. REGLAMENTO 3.1 ORGANIZACIÓN
• La Escuela Superior de Agricultura del Valle del Fuerte dentro de su organización académico-administrativa cuenta con laboratorios para la docencia y la investigación. Estos son coordinados por el Coordinador de Prácticas y bajo su cargo se encuentran los responsables de cada laboratorio; podrán nombrarse becarios o brigadistas de servicio social como personal de apoyo.
• Para cada uno de los laboratorios pueden estar como responsables profesores adscritos a la Institución; éstos desarrollarán actividades de docencia, investigación y difusión afines a las funciones del laboratorio que se le haya encargado. A su vez, los encargados deberán organizar sus actividades con el Coordinador de Prácticas.
• Las tareas prioritarias de los laboratorios son la docencia e investigación; en el caso de difusión, esta deberá estar coordinada entre el Departamento de Difusión y la Coordinación de los Prácticas.
3.2 DERECHOS Y OBLIGACIONES 3.2.1 LABORATORISTAS
• Los Responsables de laboratorio tendrán a su cargo el resguardo del material, equipo y reactivos; deberán mantener actualizados los inventarios correspondientes. • Es obligación del laboratorista portar la bata y otros accesorios definidos para su
laboratorio.
• El Responsable de laboratorio deberá preparar con la debida oportunidad los materiales, equipos y reactivos que sean necesarios para las actividades programadas de los laboratorios, con excepción de aquellas actividades destinadas exclusivamente para los tesistas.
• El Responsable de laboratorio deberá inspeccionar, limpiar y guardar adecuadamente el equipo y materiales a su cuidado. De igual forma llevará el control para la reposición oportuna de material y equipos dañados, destruidos o faltantes.
• Los Responsables de laboratorio podrán permitir la entrada a los laboratorios sólo a aquellos alumnos o profesores investigadores que presenten el programa de trabajo de laboratorios autorizado por el Coordinador de Prácticas y el Coordinador Académico.
• Los Responsables de Laboratorio deberán coordinar y supervisar las actividades del los auxiliares de laboratorio (becarios y prestadores de Servicio Social) y otras personas externas.
3.2.2 PROFESORES
• Es responsabilidad del profesor programar las prácticas y otras actividades que se desarrollarán en el(los) laboratorio(s) que corresponde(n) a cada uno de los grupos y/o tesistas que atiende, al inicio de cada semestre.
• Cada profesor deberá portar la bata y otros accesorios correspondientes cuando realice actividades en el laboratorio.
• Es responsabilidad del profesor, dar las instrucciones y la orientación de la actividad de laboratorio programada a los alumnos, tan clara y detalladamente como lo requiera la seguridad de los participantes y el alcance de los objetivos de la misma. • El profesor deberá estar presente en el laboratorio durante el desarrollo de las
actividades que haya programado.
• Las actividades de laboratorio para una asignatura determinada serán controladas y evaluadas por el profesor a cargo.
• Los profesores que requieran para alguna actividad equipo especializado, deberán solicitarlo al Coordinador de Laboratorios y a la Coordinación Académica, quienes decidirán sobre su uso.
3.2.3 ESTUDIANTES
• Los alumnos podrán entrar a los laboratorios exclusivamente dentro de la fecha y hora programada para la actividad y con la presencia del profesor responsable de la asignatura o del trabajo de investigación, salvo que exista un acuerdo entre el profesor y el laboratorista.
• El alumno deberá realizar el trabajo de laboratorio con estricto apego a las disposiciones previamente establecidas por el asesor, el profesor, y/o el laboratorista responsable. Queda prohibido realizar cualquier otra actividad fuera del trabajo indicado y la indisciplina.
• Es obligatorio para los alumnos:
3.2.3.1. Dejar su mochila en el sitio predestinado para ello.
3.2.3.2. Portar bata y ropa adecuada al ingresar a los laboratorios. 3.2.3.3. No fumar dentro de los laboratorios.
3.2.3.4. No introducir ni ingerir alimentos y/o bebidas en los laboratorios.
3.2.3.5. No utilizar celulares ni aparatos de sonido que perturben el desarrollo de la práctica.
• Los alumnos realizarán el manejo de los materiales, equipo y reactivos con el cuidado y la responsabilidad necesarios para mantener su seguridad y la de los demás, así como para la mejor conservación de los mismos.
• Los alumnos deberán entregar el material y equipo empleados en perfectas condiciones, limpio y funcional. En el caso de deterioro o faltante, se obliga a reponer el mismo en un plazo máximo de 15 días.
• Los alumnos deberán entregar su reporte de prácticas en el lapso de cinco días hábiles al Responsable del Laboratorio.
3.2.4 TESISTAS
• Los tesistas podrán realizar sus trabajos de investigación y/o actividades relacionadas en los laboratorios, siempre que tengan asignado un asesor y que se hayan programado sus actividades al inicio del semestre.
• Los tesistas se obligan a preparar, utilizar adecuadamente, lavar, limpiar y guardar el material que requieran en el desarrollo de sus actividades.
• Los tesistas podrán emplear el equipo especializado únicamente para estudios previamente autorizados por el responsable del laboratorio y/o del coordinador de laboratorios. Además el alumno será supervisado continuamente por el asesor y/o el profesor del estudio en cuestión.
3.2.5 PERSONAS EXTERNAS
• En los laboratorios de la ESAVF podrán programarse actividades de docencia e investigación, previa autorización del Coordinador Académico, para personas externas a la institución tales como: tesistas, investigadores, profesores y estudiantes de intercambio, prestadores de servicio social, practicantes, residentes y visitas.
• Las personas externas deberán ajustarse a la programación de sus actividades y tendrán todas las obligaciones relativas al uso, conservación y resguardo de los materiales utilizados.
3.3 PROGRAMACIÓN DE PRÁCTICAS
• El profesor responsable de cada materia realizará la programación de sus prácticas al inicio de cada semestre ante el Coordinador de Prácticas. Para ello se tomarán en cuenta alguno o más de los siguientes criterios:
• Horarios . Los horarios se definirán en función de las condiciones particulares de cada laboratorio y a las necesidades propias de las prácticas a desarrollar.
• Número de estudiantes . Cada laboratorio determinará el número de estudiantes que pueden realizar simultáneamente una práctica. Cuando el número de estudiantes de un grupo exceda la capacidad de un laboratorio, se realizarán equipos de trabajo de manera coordinada entre el profesor y el laboratorista.
• El Coordinador de Prácticas se reunirá con cada uno de los laboratorios para definir la programación de prácticas a cubrir durante el semestre que inicia. Una vez acordado el programa, dará seguimiento para asegurar el cumplimiento del mismo. • Las prácticas externas y visitas a los laboratorios estarán sujetas a la disponibilidad
de espacios y horarios de cada laboratorio. Para ello se deberán solicitar a la Dirección de la ESAVF al menos con una semana de anticipación.
3.4 SANCIONES
• El laboratorista que incumpla con sus obligaciones recibirá las sanciones administrativas correspondientes por las autoridades de la ESAVF.
• El profesor que no programe las prácticas de su(s) materia(s) al inicio del semestre sólo podrá acceder a este servicio en los espacios que el laboratorio tenga fuera de la programación oficial.
• Cuando un profesor y/o su grupo falte injustificadamente a una práctica programada, la práctica se dará por vista.
• El alumno, interno o externo, que no cumpla con alguna de sus obligaciones, no tendrá derecho a uso del laboratorio por el tiempo que considere el responsable del laboratorio.
4.- RELACIÓN DE PRÁCTICAS Plan 2
4.1 Nematología VI semestre
4.1.1 PRÁCTICA 1. OBSERVACIÓN Y RECONOCIMIENTO DE LOS NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS EN EL LABORATORIO.
INTRODUCCIÓN
Los nemátodos son animales con una organización muy sencilla, que comprenden especies parasitas de plantas (Fitoparasitas), también existen nemátodos saprófagos (vida libre) que favorecen la descomposición de la materia orgánica, Omnívoros e incluso Depredadores, sin olvidar que hay nemátodos parásitos de animales (Zooparásitos), entre ellos los entomopatógenos que parasitan insectos y pueden emplearse en la lucha biológica contra las plagas.
Estos nemátodos los podemos encontrar en todos los lugares; el mar, agua dulce, suelo y partes aéreas de las plantas; donde nos causan serios daños a las plantas cultivadas, sin embargo a menudo pasan desapercibidos por los técnicos y agricultores o sus daños son confundidos con otros factores; como la falta de fertilidad del suelo (deficiencias de nutrientes), escaso contenido de humedad, etc. Esto se debe fundamentalmente a su tamaño microscópico y a que viven en el suelo y/o el interior de las raíces de las plantas.
OBJETIVOS: Que el alumno reconozca y aprenda a diferenciar los nemátodos fitoparásitos de los de vida libre en el laboratorio.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección Microscopio biológico MATERIAL Vidrios de reloj Pipetas Agua DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Usando los nemátodos disponibles en el laboratorio, se coloca en un vidrio de reloj una alícuota (2-5 mm) de la suspensión nemátodos-agua, enseguida se pasan al microscopio de disección para ser observados e identificar los nematodos fitoparásitos de los de vida libre. Y después se observan en el microscopio biológico.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
4.1.2 PRÁCTICA 2. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DEL SUELO (ECTOPARÁSITOS)
INTRODUCCIÓN
Las muestras traídas del campo tienen que ser procesadas en el laboratorio para obtener los nemátodos y observarlos con la ayuda del microscopio para su identificación y conteo. Hay nematodos fitoparásitos que se alimentan de las raíces como ectoparásitos, los que siempre estarán en el suelo; pero otros se introducen al sistema radical (endoparásitos) del cual se alimentan e incluso algunos se mueven hasta las partes áreas. El método de extracción será de acuerdo al tipo de nemátodos mencionados anteriormente.
OBJETIVOS: Qué el alumno se adiestre en las diferentes técnicas para la extracción de nemátodos del suelo (nemátodos de vida libre y fitoparásitos).
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
Microscopio de disección
MATERIAL
Muestras de suelo con nematodos Embudos de 10-15 mm de diámetro Tubos de goma Pinzas de presión Malla de alambre Papel filtro Etiquetas Probeta Cubeta de plástico
Tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 325 mallas por pulgada cuadrada. Tamiz de 500 mallas por pulgada cuadrada. REACTIVOS
Kaolín Sucrosa
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
La muestra que se recogió en el campo se esparce sobre un pedazo de plástico, se desmenuzan los terrones, se eliminan las piedras y separamos las raíces para procesarlas posteriormente y extraer los nemátodos endoparásitos. Una vez mullido el suelo, se procede a homogenizarlo con el fin de que las submuestras formen una muestra compuesta, finalmente se distribuye en el plástico.
MÉTODO DEL EMBUDO DE BAERMANN: Primero se coloca un tubo de goma (8-10 cm. de largo) al cuello de un embudo de 10-15 mm. de diámetro, enseguida se lavan ambos perfectamente y luego se coloca una pinza de presión en el tubo de goma para cerrar el paso del agua. Después se procede a llenar con agua hasta 1 cm. bajo del borde del embudo y se coloca el embudo en la gradilla. Enseguida se etiqueta con los datos necesarios como: # de muestra, hospedero, fecha y lugar de colecta
Una vez que se ha hecho lo anterior, se procede a preparar una tela de alambre que de antemano esté amoldada al embudo, sobre ella se coloca un papel facial (kleneex) y luego la muestra de suelo (40-50 grs.), se envuelve la muestra y se humedece con una piceta, se coloca la tela de alambre sobre el embudo cuidando que esta toque el agua del embudo. Dejamos el embudo en reposo y a las 24 horas se sacan en un vaso de precipitado unos 10 ml. de agua. En ellos van los nemátodos parásitos y saprofitos que pasaron por el papel facial y la malla.
Si se desea, se pueden observar directamente los nemátodos al microscopio de disección, esto se hace colocando unos 5 ml. de la suspensión en un vidrio de reloj, luego se observan. En caso contrario o después de realizado lo anterior, se procede a matarlos y fijarlos para su preservación por tiempo indefinido.
MÉTODO COMBINADO (TAMIZ-EMBUDO DE BAERMANN): Del suelo distribuido en el plástico, se toman muestras en diversos puntos agregándose a una probeta que contiene 200 CC de agua hasta aforar a 300 CC. El contenido de la probeta se pasa a una cubeta A, con 4-5 lts. de agua, en la cual se siguen desmenuzando los terrones hasta que se disuelva bien el suelo. Se agita la solución y la dejamos reposar durante 15-30 segundos para que se sedimente el material pesado y los nemátodos permanezcan flotando. El contenido de la cubeta A, se pasa a través de un tamiz de 100 mallas por pulgada cuadrada a una cubeta B, en la cual se agita y la dejamos sedimentar para pasarlo por un tamiz de 325 (ó 500) y lo que queda en él se pasa al embudo de Baermann.
MÉTODO DE FLOTACIÓN (TAMIZ-CENTRÍFUGA): Lo que queda en el tamiz de 325 ó 500 se pasa a un vaso de precipitado y se distribuyen los tubos de la centrifuga a los que previamente se les agregó 0.5-1.0 g de kaolín, el cual se mezcla bien y se centrifuga a 3000 rpm por 5 minutos, lo que permite la sedimentación de los nemátodos junto con las partículas de suelo (favorecido por el kaolín). Después se decanta el sobrenadante eliminando la materia orgánica suspendida.
El sobrenadante eliminado se sustituye por solución sucrosa (45 g. de solución sucrosa o azúcar refinada en 100 CC. de agua destilada) y se mezcla con la muestra. Se centrifuga a 3000 rpm durante 2 minutos y el sobrenadante se pasa por el tamiz de 325 ó 500 mallas donde los nemátodos quedan retenidos procediéndose inmediatamente a lavarlos sumergiendo el tamiz en agua para eliminar el azúcar del cuerpo de los nemátodos. Con la ayuda de una piceta se pasan a un vaso de precipitado, quedando listo los nemátodos para hacer observaciones al microscopio y/o matarlos y fijarlos para estudios posteriores de identificación y conteo.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp.
THORNE, G. (1961). Principles of nematology, MC. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.
4.1.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA LA EXTRACCIÓN DE NEMÁTODOS DE LA RAÍZ (ENDOPARÁSITOS)
INTRODUCCIÓN
Paralelamente al grupo de los nemátodos ectoparásitos (es decir, aquellos que se alimentan externamente de la raíz y cuyo hábitat es el suelo), existe el grupo de los endoparásitos que se han adaptado a vivir dentro de los tejidos vegetales y que ya no dependen totalmente del ambiente del suelo, sino más bien de lo que ocurre en la planta. Así pues, podemos encontrar nemátodos desde la raíz, tallos y hojas hasta en las flores, frutos y semillas, y que constituyen un serio problema para la agricultura porque son un grupo mucho más peligroso que el anterior. Para la extracción de estos nemátodos, existen algunos métodos que por su sencillez y efectividad vale la pena conocerlos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y realice los métodos de extracción más sencillos y prácticos que se conocen para extraer nemátodos endoparásitos.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
Microscopio de disección Licuadora
MATERIAL
Raíces infectadas por nematodos Navajas
Embudos
Tamiz 325 mallas por pulgada cuadrada Agujas de disección
REACTIVOS Kaolín
Sucrosa
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
OBSERVACIÓN DIRECTA: Se usa en raíces con agallamiento, se utilizan agujas de disección para desmenuzar las agallas y extraer hembras, juveniles, machos y masas de huevecillos de los nemátodos que causan agallas (Meloidogyne spp. y Nacobbus
spp.).
INCUBACIÓN: Las raíces previamente lavadas o el follaje son cortados en pequeñas piezas y se colocan en un recipiente con agua limpia dejándose reposar por unas 24-48 horas para que los nemátodos salgan de los tejidos.
LICUADORA CENTRÍFUGA: Las raíces lavadas se licuan a alta velocidad durante un minuto y el licuado se centrifuga de igual forma que en la flotación para nemátodos ectoparásitos.
EMBUDO DE BAERMANN: Se procede de igual forma que lo descrito para ectoparásitos, solo que aquí usamos en lugar de suelo, pequeñas piezas de raíces previamente lavadas.
LICUADO-TAMIZADO: Lavar el material vegetal y cortar alrededor de 5 g. de raíces; los trocitos de raíz se colocan en una licuadora en 100 ml. de agua y licuar durante un minuto. El material licuado se pasa a través de un tamiz de 325 mallas, recogiendo el material en un vaso de precipitado. Después observar al microscopio de disección. INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
GERARDO, A. M. (2002). Manual de prácticas de Micología. Juan José Ríos, Sin; México. 35 pp.
4.1.4 PRÁCTICA 4. MANIPULACIÓN DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN
La manipulación de los nematodos previo a su identificación y conteo una vez que han sido extraídos por las técnicas usadas en el laboratorio, es un proceso muy importante porque lleva implícitos el matado, fijado y pesca de estos organismos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca las técnicas de manipulación más usadas para realizar la identificación y conteo de nematodos en un análisis nematológico de una muestra. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio de disección MATERIAL Vidrio de reloj Lámpara de alcohol Pipetas Palillos de bambú Vasos de precipitado
Tubos de ensayo Portaobjetos REACTIVOS Agua Fijador FA. 4:10 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
MATADO: Existen varios métodos para realizar el matado de los nemátodos pero todos ellos lo hacen tratando de evitar su distorsión. Hay 2 formas generales para realizar esta operación, ellas son:
MATADO EN VIDRIO DE RELOJ: Se coloca en un vidrio de reloj una alícuota de la suspensión nemátodos-agua y enseguida se expone durante 12 segundos a la flama de una lámpara de alcohol. Después se observan al microscopio de disección para verificar su muerte.
MATADO EN MASA: Se pone a calentar agua en un vaso de precipitado de 500 ml., cuando alcance una temperatura de 60 ºC se retira de la flama y se introduce durante 3-4 minutos el recipiente (tubo de ensayo) que contiene 10 cc. de agua con nemátodos. También se puede matar dejando hervir el agua introduciendo el tubo de ensayo durante un minuto.
FIJACIÓN: Una vez que los nemátodos han sido matados, se deja enfriar el agua con nemátodos y se le agrega el fijador (FA. 4:10) en una porción de 1:1.
Fijador FA. 4:10
Formol al 40%... 10 CC. Acido glacial acético...10 CC. Agua destilada...10 CC.
Nota: Con este fijador los nemátodos rara vez se distorsionan, pero tienden a tornarse café y la parte posterior del estilete de los Tylenchidos se vuelven transparentes después de unos cuantos días.
PESCA DE NEMÁTODOS: Después de la extracción, matado y fijación de los nemátodos, es necesario que sean trasladados a un portaobjetos con una gota de agua para observarlos, estudiar sus características e identificación bajo el microscopio biológico. El traslado se hace siempre de uno en uno con la ayuda de una varita de bambú con la punta bien adelgazada. La técnica para pescar nematodos es la siguiente:
1.- En el centro de un portaobjetos se deposita una gota de agua.
2.- Se coloca una alícuota de la suspensión agua-nemátodos matados y fijados en un vidrio de reloj y se observan bajo el microscopio estereoscópico.
3.- Se localiza un nematodo en el fondo del vidrio de reloj y con la ayuda de la varita de bambú se lleva al nematodo hacia la superficie lentamente y una vez en la superficie, se saca rápidamente y se coloca en la gota de agua del portaobjetos.
4.- Nuevamente se busca otro nemátodos y se sigue el mismo procedimiento hasta trasladar por lo menos 5 nemátodos al portaobjetos.
5.- Se coloca un cubreobjetos a la gota de agua con nemátodos. Enseguida se observa al microscopio biológico.
6.- Se estudian las características de cada nematodo para su identificación y su posterior cuantificación.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
PACHECO, A. J. (2000). Manual de prácticas de laboratorio de Nematología. Juan José Ríos, Sin; México. 20 pp.
THORNE, G. (1961). Principles of nematology, Mc. Graw-Hill book Co, New York, Estados Unidos. 553 pp.
4.1.5 PRÁCTICA 5. PREPARACIONES PERMANENTES DE NEMÁTODOS INTRODUCCIÓN
En nemátodos fijados muchos de los detalles internos del cuerpo, especialmente gónadas, pueden ser obscurecidas por la apariencia granular del intestino. Los especimenes pueden ser aclarados procesándolos a lactó fenol ó glicerina, los cuales son medios de montaje apropiados. Además es muy importante con fines académicos o de investigación al conservar preparaciones permanentes de nemátodos.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar preparaciones permanentes de nemátodos para su conservación.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Estufa Arnold MATERIAL Campana deshidratadora Vidrio de reloj Pelo de ángel Portaobjetos
Cubreobjetos REACTIVOS Etanol 96% Glicerina Agua destilada Lacto fenol Cloruro de calcio DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Transferir nemátodos del fijador a un vidrio de syracuse o de reloj que contenga 0.5 ml. de la siguiente solución:
Solución I:
Etanol 96%... 20 partes Glicerina... 1 parte Agua destilada... 79 partes
Colocar el vidrio de reloj es una campana deshidratadora que contiene 1/10 de su capacidad con etanol 96% y déjelo cuando menos durante 12 horas en una estufa a 35-40 ºC. Esto permite que se elimine casi toda el agua y deja a los nemátodos en una mezcla de glicerina y etanol. Llene el vidrio de reloj con la solución II (5 partes de glicerina y 95 partes de etanol 96%) y parcialmente cerrado, colóquelo durante 3 horas en una estufa a 40 ºC para que se evapore lentamente el etanol hasta que los nemátodos queden en glicerina pura.
Los nemátodos así deshidratados son transferidos a una gota de glicerina pura (purificarla dejándola en un recipiente abierto en una campana deshidratadora que contenga cloruro de calcio) en un portaobjetos, se colocan 2 tiras de pelo de ángel, después se coloca un cubreobjeto y el borde de éste se sella con esmalte de uñas transparentes.
Se colocan etiquetas adhesivas al portaobjeto con los siguientes datos: 1.- Nombre científico
2.- Localidad 3.- Hospedante
4.- No. de hembras y machos 5.- Colector
6.- Fecha
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
YEPEZ, T. G. (1972). Los nemátodos enemigos de la agricultura, Imprenta Universidad de Caracas; Universidad Autónoma de Venezuela, Facultad de Agronomía. Venezuela. 220 pp.
4.1.6 PRÁCTICA 6. IDENTIFICACIÓN DE GÉNEROS DE NEMÁTODOS FITOPARÁSITOS
INTRODUCCIÓN
Los nemátodos fitoparásitos abarcan un gran número de géneros y especies de gran importancia agrícola. El conocimiento de la sintomatología, morfología, biología y control es de interés fundamental para el parasitólogo.
El control de los nemátodos fitoparásitos, se basa en una identificación correcta del nematodo en cuestión, de ahí que sea importante conocer las características morfológicas más importantes de los principales géneros de estos patógenos.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y diferencie las características morfológicas de los principales géneros de nemátodos fitoparásitos de importancia agrícola.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
MATERIAL
Suelo con nemátodos Montajes permanentes Portaobjetos
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
1.- Elaborar montajes a partir de material vegetal enfermo o suelo procesado, los montajes se harán siguiendo la metodología descrita anteriormente.
2.- Usando los montajes permanentes disponibles en el laboratorio, observar al microscopio biológico los especimenes, con los objetivos 10x y 40x.
3.- Dibujar cada espécimen cuidadosamente, resaltando las características más importantes: forma, tamaño, tipo de estilete, tipo de esófago, unión del bulbo basal con el intestino, posición de la vulva, tipo de cola, características del sistema reproductor de la hembra, etc.
4.- Se estudiarán los siguientes géneros:
-Meloidogyne -Heterodera -Globodera -Punctodera -Nacobbus -Xiphinema INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA
4.2 Bacteriología y virología, VII semestre.
4.2.1 PRÁCTICA 1. ESTERILIZACIÓN DE EQUIPO DE LABORATORIO Y DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
El microbiólogo y el fitopatólogo necesitan frecuentemente trabajar con materiales y equipos estériles, en el caso de medios de cultivo la esterilidad es obligada antes de usarlos.
La esterilización es el proceso mediante el cual se obtienen sustancias o materiales libres de organismos vivos. Los métodos de esterilización pueden ser químicos o físicos. Entre los métodos físicos se encuentra el calor, las radiaciones y la filtración. El método químico incluye el uso de gases o sustancias líquidas con propiedades biocidas.
OBJETIVOS: Que el alumno comprenda el concepto de esterilización y aprenda a utilizar los aparatos usados en el laboratorio para este fin.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Estufa Arnold MATERIAL Medio de cultivo Agua Cajas Petri Tubos de ensayo Pipetas Matraces Morteros Probetas REACTIVOS Medio de cultivo Agua
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
ESTERILIZACIÓN POR CALOR HÚMEDO
1). Revise que el agua se encuentre al nivel de la rejilla basal. 2). Introducir el material a utilizar.
3). Cierre el recipiente correctamente.
4). Abra la válvula de escape para que salga el aire seco y encienda la olla de presión. 5). Un minuto después de que empieza a salir el aire y vapor, cierre la válvula de escape. El tiempo de esterilización se empieza a contar hasta que la aguja alcance 15 libras/pulgada cuadrada.
6). Mantenga el aparato de 15-20 libras durante el tiempo deseado, regulando la flama del mechero.
7). Concluido el tiempo de esterilización, apague el aparato, espere a que baje a cero presión antes de sacar con cuidado el material caliente.
ADVERTENCIA: nunca deje el aparato encendido sin vigilancia. ESTERILIZACION CON CALOR SECO
1). Deposite el material seco y limpio en la estufa. 2). Cierre perfectamente y encienda el interruptor.
3). Ajuste el regulador a la temperatura deseada, cheque la temperatura con el termómetro y cuente el tiempo de esterilización cuando se alcance la temperatura requerida (100-180 oC).
4). Concluido el tiempo de exposición, apague el aparato.
ADVERTENCIA: no saque cristales muy calientes de la estufa, pues al contacto con el aire frío o caliente se revientan.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Echando, E. 1971 Manual de Laboratorio para Fitopatología General, Herrera Hermanos. Sucesores. 89 pp.
López, A. G. F. 1979. Manejo de hongos fitopatógenos. Departamento de Parasitología Agrícola. UACH. 135 pp.
4.2.2 PRÁCTICA 2. ELABORACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
INTRODUCCIÓN
Para el cultivo in Vitro de fitobacterias se requiere de la elaboración de un medio que proporcione todos los requerimientos nutricionales que permitan su reproducción, los cuales se les conoce como medios de cultivo.
Los medios de cultivo contienen cuatro componentes esenciales: fuentes de carbono y nitrógeno, minerales y vitaminas.
Existe una gran variedad de de fuentes de carbono que se pueden emplear en los medios de cultivo como son: alcoholes, pentosas, hexosas, disacáridos, trisacáridos, polisacáridos, ácidos e hidroxiácidos ya sean solos o en combinación.
OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a elaborar medios de cultivo para el aislamiento de bacterias fitopatógenas.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Autoclave Agitador magnético MATERIAL Agar Nutritivo Agua destilada Caseína hidrolizada Peptona Glucosa Extracto de carne Sacarosa DESARROLLO DE LA PRÁCTICA AGAR NUTRITIVO Agar nutritivo 23 g Agua destilada 1000 ml
Disolver el agar nutritivo en el agua, si desea puede dividir el líquido en dos matraces. Esterilizar en autoclave a 115 lbs/pulgada cuadrada durante 15 minutos y vaciar en cajas de Petri. Este medio generalmente se emplea para aislamientos de material vegetal. Es un medio útil para el aislamiento de especies de Xanthomonas.
MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES (TTC) Peptona 10 g Caseína hidrolizada 1.0 g Glucosa 5.0 g Agar 12 g Agua 1000 ml
Ajustar el ph a 7 y esterilizar en la forma normal, cuando el medio alcance una temperatura de aproximadamente 45-50 0C adicionar solución acuosa de cloruro de
tetrazolio al 1.0% para dar una concentración final de 0.005%. Con este medio de cultivo se pueden detectar las colonias virulentas y avirulentas de Ralstonia
solanacearum y P. s. p.v. phaseolicola. En el primer caso las colonias virulentas son
blancas, fluidas, con centro rojo y para la segunda bacteria las cepas virulentas forman colonias rojas y las avirulentas son blancas.
MEDIO PARA LA PRODUCCION DE LEVANA Extracto de carne 3 g
Peptona 10 g Sacarosa 50 g Agar 20 g Agua 1000 ml
Disuelva los ingredientes, esterilice en la forma convencional y vacíe en cajas esterilizadas. MEDIO DE GELATINA Extracto de carne 3.0 g Peptona 5.0 g Gelatina 120.0 g Agua 1000 ml
La gelatina se adiciona al agua y se deja hidratar durante 15 a 30 minutos y luego se calienta para disolver la gelatina; posteriormente agregar y disolver los otros constituyentes. Ajustar el ph a 7, vaciar a tubos y esterilizar a 120 0C durante 20
minutos.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Agrios, GN. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-288 p.
Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.
4.2.3 PRÁCTICA 3. MÉTODOS PARA OBTENER CULTIVOS PUROS INTRODUCCIÓN
El cultivo puro, es una condición artificial en el crecimiento de bacterias bajo condiciones de laboratorio. Para determinar las características de una especie bacteriana en particular, es imperativo que el organismo sea aislado y multiplicado en laboratorio en cultivo puro. Existe una variedad de técnicas para el aislamiento y desarrollo de bacterias como son: técnica de estría cruzada y la de vaciado en placa. OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar las técnicas para el aislamiento y obtención de cultivos puros de bacterias fitopatógenas.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
Cámara de flujo laminar o microboy MATERIAL
Medio de cultivo Cajas Petri
Lámpara de alcohol Asa bacteriológica
Material vegetal enfermo Navajas o bisturí
Tubos de ensayo Agua destilada estéril
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
Técnica de estría cruzada. Con el asa bacteriológica previamente flameada y enfriada, se toma una gota de suspensión bacteriana del tubo de ensayo. Se procede a realizar un estriado (4 o 5 “rayas”) en la caja de Petri. A partir de la ultima “raya” del estriado # 1, se comienza a rayar el estriado # 2, esto se repite 4 ó 5 veces cuidando de no tocar mas que la ultima raya del estriado anterior. Todo esto se realiza en el microboy previamente desinfectado y con la ayuda de una lámpara de alcohol. Al terminar se sellan las cajas y se incuban a 28 grados centígrados Durante 24-48 hrs.
Técnica de vaciado en placa. Para lograr tener colonias separadas por esta técnica, primeramente se debe hacer una suspensión (que se puede lograr al suspender el material vegetal enfermo en agua esterilizada o en medio de cultivo líquido). De esta suspensión se toma una gota ó 0.5 ml y se transfieren a otro tubo ó matraz con medio de cultivo con agar líquido. Esta operación se repite 2 ó 3 veces más, teniendo cuidado de agitar los tubos antes de hacer la transferencia. Inmediatamente después de cada dilución, el contenido de cada uno de los tubos se traslada a una caja Petri estéril y después del periodo de incubación se obtendrán colonias separadas.
AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN
Uno de los requisitos para considerar a una bacteria como el agente inductor de una enfermedad, es aislarla y purificarla a partir del tejido enfermo. Para llevar a cabo esta etapa existen diferentes metodologías y la elección de cualquiera de ellas dependerá del tipo de síntoma, órgano afectado, grado de avance de la enfermedad y del material y equipo disponibles. Entre las técnicas de aislamiento más comunes, se encuentran las siguientes:
AISLAMIENTO DIRECTO (Para muestras con marchites)
PROCEDIMIENTO
1. Con una navaja flameada y enfriada, haga un corte transversal al tallo que presente flacidez incipiente, de preferencia cerca del nivel del suelo.
2. Haga una ligera presión y espere unos segundos para que de los haces vasculares salga un exudado bacteriano.
3. Con el asa previamente flameada y enfriada, tome del exudado y transfiéralo a un tubo con agua destilada estéril.
4. Agite el tubo para homogeneizar.
5. Con el asa flameada tome una gota de la suspensión y siembre una caja con medio de cultivo por el método de estría cruzada.
6. Incube a 28 0C por 24-48 horas.
INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Para muestras con manchas o tizones)
PROCEDIMIENTO
1. Al microscopio estereoscópico observe los tejidos afectados, para detectar la presencia de exudados, escamas bacterianas, micelio u otras estructuras fungosas. 2. De la zona de avance de la enfermedad haga una preparación en fresco y observe
al microscopio compuesto.
3. Si en estas preparaciones observa únicamente células bacterianas, esto le indica que el síntoma se puede deber a bacterias, por el contrario, si observa micelio, lo más seguro es que el síntoma sea ocasionado por un hongo.
4. Seleccione tejido enfermo y lávelo con agua estéril.
5. Corte pequeños trocitos y desinféctelos con una solución de hipoclorito de sodio al 1% durante 1 a 2 minutos.
6. Decante el hipoclorito de sodio y lave 3 veces con agua esterilizada.
7. Una vez transcurridos los 5 ó 10 minutos, tome una gota de la suspensión con el asa bacteriológica y siembre con estría cruzada una caja con medio de cultivo.
8. Después del periodo de incubación seleccione las colonias bacterianas que se asemejen a las del agente causal, y siémbrelas una nueva caja con medio de cultivo para obtener así, suficiente cultivo puro y continuar con las pruebas de patogenicidad.
INMERSIÓN DEL TEJIDO EN AGUA ESTERIL (Muestra con sobrecrecimiento)
PROCEDIMIENTO
1. Con un cepillo pequeño y cerdas suaves lave al chorro del agua la agalla o tejido con fasciación y luego haga unas fracciones.
2. Coloque los cortes en un tubo con 3 ml de agua destilada estéril y manténgalos así durante unos 10-20 minutos.
3. Pase 3 asadas de la suspensión anterior a otro tubo con 3 ml de agua estéril. 4. Siembre 2 cajas con medio de cultivo por estría cruzada.
5. Incube a 22-28 0C durante 2-4 días.
6. Seleccione las colonias bacterianas con características del posible patógeno y transfiera a las otras cajas con medio de cultivo.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de Chapingo.
4.2.4 PRÁCTICA 4. TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA DETERMINAR FORMA, TAMAÑO Y AGRUPACIÓN CELULAR
INTRODUCCIÓN
Como las células bacterianas son incoloras, se requiere del empleo de colorantes para hacerlas más nítidas al microscopio, para lo cual se pueden emplear técnicas de coloración simples o diferenciales.
Tinción simple. El azul de metileno de Loeffler es uno de los reactivos más valiosos que se tienen para la tinción de bacterias. Es excelente para las bacterias del género
Curtobacterium donde puede demostrar el perlado y los gránulos. En los bacilos
esporulados (Bacillus), teñidos con este reactivo, las esporas aparecen como cuerpos no teñidos dentro de células azules.
Tinción diferencial. Una de las técnicas más ampliamente utilizadas es la “Tinción de Gram.”, porque no solo permite determinar la forma y agrupación de las bacterias, sino también es de considerable valor en la identificación y clasificación, al separar a las bacterias en gram negativas y gram positivas.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a utilizar los reactivos para llevar a cabo las distintas técnicas de coloración de bacterias.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Cultivo bacteriano Asa bacteriológica Agua alcohol Azul de metileno Portaobjetos Lámpara de alcohol Cristal violeta Lugol Safranina INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA
Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.
4.2.5 PRÁCTICA 5. PRUEBAS DE PATOGENICIDAD INTRODUCCIÓN
Cuando una planta, supuestamente infectada por una bacteria, es traída al laboratorio, se procede al aislamiento en medio artificial de cultivo según la técnica usual. No obstante, los resultados del aislamiento precisan ser interpretados con cautela, pues: a) las colonias desarrolladas en la caja de Petri pueden ser bacterias saprofitas, por lo que la enfermedad puede no ser provocada por estas bacterias. b) aparecen en la caja, colonias de bacterias patogénicas y saprofitas las cuales no se diferencian por su aspecto. c) las colonias obtenidas, aunque sean de bacteria patogénica, se presentan avirulentas o perdieron por alguna razón, la patogenicidad.
La demostración de la patogenicidad de una cepa bacteriana es un procedimiento complicado que requiere mucho tiempo para que aparezcan los síntomas típicos de la enfermedad en a planta homóloga. En la mayoría de las ocasiones no siempre se dispone de este material, siendo más difícil, aún, cuando se tratan de árboles o plantas que no se encuentran en la región.
Existen pruebas de patogenicidad como la reacción de hipersensibilidad, pudrición del tubérculo de papa, inoculación a frutos verdes de peral o manzano las cuales se describen a continuación.
OBJETIVOS: Que el alumno aprenda a realizar pruebas de patogenicidad de bacterias fitopatógenas. MATERIAL REQUERIDO EQUIPO Microscopio biológico Incubadora MATERIAL
Material vegetal enfermo Agua estéril
Alcohol
Cajas de Petri Papel filtro
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
PUDRICIÓN DEL TUBERCULO DE PAPA
Para bacterias aisladas de órganos con pudrición, la patogenicidad se puede valorar con la prueba de pudrición del tubérculo de papa y los resultados se pueden observar a las 24 horas de haberse realizado.
PROCEDIMIENTO
Un tubérculo de papa de preferencia de la variedad Alpha, se lava, se seca y se desinfecta superficialmente, bañándolo con etanol al 70%, seguido de un flameado (evite adicionar mucho alcohol porque al quemarse podrá dañar las capas externas del tubérculo y se correrá el riesgo de contaminación por bacterias esporuladas como
Bacillus spp. De estos tubérculos se cortan rebanadas de 5mm de grosor y se colocan
en cajas de Petri con papel filtro (previamente esterilizado) se pueden acomodar dos rebanadas por caja y una de ellas servirá de testigo.
A cada una de las rebanadas se les hace una insición superficial y solo en una de ellas se pone crecimiento de la bacteria a probar. Finalmente se le adicionan unos 2-3 mm de agua estéril solo para humedecer el papel y crear un ambiente húmedo, se incuban a 28 0C durante 24-72 horas. A partir de las primeras 24 horas, se palpa el tejido de
cada una de las rebanadas y si la que ha sido inoculada, se siente blanda, indica que la bacteria probada sintetiza enzimas pectolíticas y es muy probable que sea el agente causal de la pudrición. Al igual que la prueba anterior, también sirve para diferenciar especies y pato vares de Pseudomonas fluorescentes.
INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA
4.2.6 PRÁCTICA 6. REACCIÓN DE KOH INTRODUCCIÓN
La determinación del Gram de las bacterias, también se puede realizar de una forma más rápida y sencilla, empleando únicamente solución acuosa de KOH al 3%, la cual resulta ser una prueba rápida y muy sencilla en la que no influye la edad del cultivo con los resultados como sucede con la tinción de Gram y el procedimiento es como sigue: OBJETIVOS: Que el alumno conozca y aprenda a realizar la prueba de reacción de KOH, para diferenciar a las bacterias gram negativas de las gram positivas.
MATERIAL REQUERIDO MATERIAL Asa bacteriológica Cultivo bacteriano Portaobjetos REACTIVOS Hidróxido de potasio DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
a) En un portaobjetos limpio coloque una gota de KOH. b) Del cultivo bacteriano puro, tome una asada.
c) Mezcle el cultivo con el hidróxido durante unos segundos y levante lentamente el asa.
d) Si se forma un hilo, la reacción se considera positiva y significa que la bacteria pertenece al grupo de las gram negativas. Por el contrario si después de unos minutos no se forma el hilo, la bacteria es un miembro de las Gram positivas.
INFORME DE RESULTADOS BIBLIOGRAFÍA
Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados.
4.2.7 PRÁCTICA 7. TINCIÓN DE CÁPSULA INTRODUCCIÓN
La cápsula es una capa gelatinosa y mucoide cuyo espesor puede ser escaso o por el contrario, importante, hasta el punto de duplicar el volumen de la bacteria. Este material no solamente no existe en todas las bacterias, sino que en las especies capsuladas puede no estar siempre presente. Su desarrollo se favorece cuando la bacteria se cultiva en medios con alto contenido de carbohidratos o cuando se multiplica dentro del hospedante.
OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de utilizar los reactivos para la coloración de la cápsula bacteriana y mejorar su observación al microscopio.
MATERIALES REQUERIDOS EQUIPO Microscopio biológico MATERIAL Portaobjetos Lámpara de alcohol REACTIVOS Fuccina Etanol Mordente de Muir Azul de metileno Agua estéril DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
a) Se hace un frotis de la bacteria y se fija al aire.
b) La laminilla se cubre con fuccina fenicada fuerte y se calienta ligeramente durante 1 minuto.
c) El frotis se lava rápidamente con etanol, y después se lava perfectamente con agua. d) Se cubre con el mordente de Muir durante 30 seg.
e) Lave con agua y posteriormente con etanol durante 30 segundos ó hasta que el frotis tome un color rojo pálido.
f) Lave perfectamente con agua.
g) Tiña con azul de metileno de Loeffler durante 30 segundos. h) Lave con agua y deje secar.
i) Observe al microscopio compuesto, las bacterias se tiñen de rojo y las capsulas de azul.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Fucikovsky, Z. L. 1995 Manual de bacteriología “Bacterias fitopatógenas” INSTITUTO DE FITOSANIDAD. Colegio de Postgraduados
Rodríguez, M. M. 2001 Manual de prácticas de bacterias fitopatógenas. DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA AGRICOLA. Universidad Autónoma de Chapingo.
4.2.8 PRÁCTICA 8. OBSERVACIÓN DE SÍNTOMAS CAUSADOS POR FITOBACTERIAS
INTRODUCCIÓN
Las bacterias fitopatógenas ocasionan el desarrollo de casi tantos tipos de síntomas en las plantas que infectan como los que producen los hongos. Producen manchas y tizones foliares, pudriciones blandas de frutos, raíces y órganos almacenados, marchitamientos, crecimientos excesivos, sarnas, cancros etc. Cualquiera de estos tipos de síntomas puede ser producido por las bacterias patógenas de varios géneros y cada género contiene algunos patógenos capaces de producir diferentes tipos de enfermedades. Sin embargo, las especies de Agrobacterium, sólo producen crecimientos excesivos o proliferación de los órganos. Por otra parte, los crecimientos excesivos también pueden ser producidos por ciertas especies de Corynebacterium y
Pseudomonas. Asimismo, las dos especies fitopatógenas de Streptomyces, sólo
producen sarnas o lesiones en los órganos subterráneos de las plantas. Las especies de Rhizobium inducen la formación de nódulos en las raíces de las leguminosas.
Los síntomas pueden indicar la existencia de una enfermedad, pero ellos no son en sí la enfermedad, estos son utilizados como guías para diagnosticar la naturaleza o causa de una enfermedad en particular. Entre las enfermedades bacterianas encontramos variados tipos de síntomas, los cuales son divididos en cuatro categorías:
1. Cambios de color: Alteraciones presentes en los plastidios, vacuolas o cloroplastos dando como consecuencia:
Clorosis: Retardamiento o disminución de la clorofila por anormalidades en los cloroplastos.
Amarillamiento: Disminución de clorofila e incremento de carotenos y xantofilas.
Antocianocencia: coloración púrpura como resultado del incremento del pigmento antocianina.
2. Desintegración de tejidos: Son ocasionados por la acción enzimático o toxinas que producen los patógenos sobre la pared del hospedante y/o afectando el protoplasma celular.
Pudrición: áreas muertas debido a la maceración de tejidos con presencia de exudados bacterianos. Esta pudrición puede ser de consistencia seca o húmeda.
Cancro: Necrosis restringida en los tejidos corticales de tallos y raíz con crecimiento secundario, usualmente delimitado por tejido sano.
Necrosis: Áreas donde las células sufren primeramente plasmólisis, colapso y la muerte. En ocasiones éstas áreas presentan una coloración oscura o castaña debido a la producción de melaninas.
Tizón: Desintegración rápida de los tejidos seguida por la muerte celular, esta puede ser parcial o total del hospedante (producción de toxinas) también definida como lesiones de crecimiento indeterminado.
Mancha: Necrosis localizada en cualquier parte de la planta.
3. Desarrollo anormal del crecimiento: Ocasionado por alteraciones en las sustancias reguladoras del crecimiento ya sea aumentando o disminuyendo su concentración. Agalla: desarrollo anormal donde las células dañadas sufren el fenómeno de Hiperplasia (multiplicación excesiva de las células) o Hipertrofia (aumento de tamaño de las células).
Fasciación: proliferación excesiva de brotes como consecuencia de la Hipoplasia (poca división celular), presentándose la planta como arrosetada.
4. Daños al sistema vascular
Marchitez: Flacidez o pérdida de turgencia de la planta debido al taponamiento de los vasos que conforman este sistema, ya sea por estructuras del patógeno, sustancias que las bacterias producen o estructura del tejido vegetal.
OBJETIVOS: Que el alumno sea capaz de diferenciar la sintomatología de enfermedades de importancia en plantas causadas por bacterias.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
Microscopio biológico MATERIAL
Agua destilada estéril Portaobjetos
Material vegetal enfermo Navajas
DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
a). Identificar los distintos tipos de síntomas ya señalados, usando para ello las muestras de material vegetal enfermo que le proporcione el instructor.
b). Describir en forma sencilla al menos un tipo de síntoma característico de cada enfermedad. En cada caso, indique el patógeno y el nombre común de la enfermedad. Por ultimo señalar como diferenciar síntomas de enfermedades causadas por bacterias y hongos y discutir que tan confiable resulta la identificación de las enfermedades en base a la observación de síntomas.
INFORME DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFÍA
Agrios, G. N. 2007. Fitopatología. LIMUSA Wiley, México. pp 540-541 Bauer, L. I. 1984. Fitopatología. LIMUSA. Colegio de Postgraduados.
Plan 3
4.3 Fitopatología General. IV semestre.
4.3.1 PRÁCTICA 1. PREPARACIÓN Y MANEJO DE MEDIOS DE CULTIVO INTRODUCCIÓN
Los medios de cultivo son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos, bacterias y otros microorganismos. Cabe señalas que la mayoría de los hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera relativamente sencilla en medios adecuados. Sin embargo existen grupos de patógenos denominados parásitos obligados cuyo cultivo aún no se a logrado a menos que se inoculen en plantas vivas. Los medios de cultivo requieren de ciertas características mínimas para lograr exitosamente el desarrollo de los hongos y entre los más importantes se encuentran:
1. El medio deberá contener elementos nutritivos tales como: fuentes de carbono, nitrógeno, fósforo, potasio, magnesio, cobre y molibdeno. También pueden ser necesarias algunas vitaminas y otras sustancias que se hallan presentes en los materiales naturales o artificiales que componen los medios.
2. El medio no deberá deshidratarse fácilmente, por que se evita manejándolo en recipientes adecuados que además permitan su manejo en condiciones estériles es decir, evitando contaminaciones. El oxigeno es necesario en todos los casos por lo que deberá permitirse la aireación. Ya sea en las cajas de Petri o en tubos de cultivo.
3. La mayoría de los medios de cultivo para hongos requieren esterilización antes de usarse, lo que generalmente se logra mediante calor húmedo usando autoclave u olla Express.
4. La mayoría de los hongos crecen bien a temperatura de 20 a 32 oC, pero existe
mucha variación entre grupos o especies. La temperatura óptima para el desarrollo de la enfermedad que causen puede servir como punto de referencia para la temperatura de incubación del hongo en el medio de cultivo.
5. La mayoría de los hongos crecen bien a ph de 5 a 6, pero hay excepciones. La temperatura y/o Ph óptimo para la esporulación puede ser distinto que para el crecimiento del micelio. En ocasiones es conveniente agregar pequeñas cantidades de ácido láctico para eliminar bacterias contaminantes en el medio, pues estas generalmente no toleran la acidez, permitiendo el crecimiento fungoso.
6. El crecimiento del micelio y sobre todo la esporulación de los hongos en el medio, esta muy influido por la luz. Muchos hongos esporulan fácilmente sin necesidad de luz artificial o aun en plena oscuridad, pero otros requieren condiciones especiales de calidad y confiabilidad de luz. Este factor puede ser clave cuando se requieren altas cantidades de esporas con fines de investigación o para identificar alguna especie en particular.
El medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o sustrato natural del hongo por cultivar. La utilidad del medio es
proporcionar energía al microorganismo, para que desarrolle en la forma más normal posible.
Por su composición nutritiva los medios de cultivo pueden ser:
1. Medios naturales. Están compuestos por materiales enteramente naturales, tales como partes de plantas, malta, levadura etc.… se requieren en forma de extractos o decocciones o simplemente esterilizando las partes vegetales con calor u otro método. Aunque se usan poco, pueden ser superiores a otros medios sobre todo en el caso de hongos de difícil esporulación. Por ejemplo se pueden conseguir altas cantidades de esporas de Stemphylium, sembrando a este hongo en tallos de cartamo esterilizados en autoclave.
2. Medios semisintéticos. Están compuestos parcialmente por materiales naturales y sintéticos, el ejemplo mas común es el de papa dextrosa y agar, V8 agar, harina de maíz, agar etc.… son los más usados.
3. Medios sintéticos. Se conoce perfectamente su composición, ejemplo medio de Komada o de Awuah y Lorbeer, para Fusarium oxisporum, por su consistencia los medios de cultivo pueden ser:
a) Sólidos. Contienen agentes solidificantes principalmente el agar, proporción de 1 a 3%, el agar esta compuesto por una mezcla de carbohidratos complejos y se obtiene a partir de algas.
b) Semisólidos. Aunque generalmente se usan poco en micología, estos se obtienen bajando la concentración del agar o usando gelatina como agente solidificante.
c) Líquidos. Se preparan sin agente solidificante. Se usan principalmente para obtener altas concentraciones de esporas, ejemplo: papa- dextrosa.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
La preparación de medios de cultivo presenta distinto grado de complejidad, pero en general se tarda una o dos horas para la elaboración de las más comunes. A continuación se describe la forma de preparar el medio papa dextrosa agar, jugo V8 agar, agua agar, por ser los más comunes n la mayoría de los laboratorios de fitopatología en el mundo.
OBJETIVOS
Aprender a elaborar los medios de cultivo.
MATERIAL REQUERIDO EQUIPO
Autoclave Olla Express
MATERIAL Papas Agua destilada Matraces Tubos de ensayo Vasos de precipitado REACTIVOS Agar Dextrosa Carbonato de calcio Jugo V8 DESARROLLO DE LA PRÁCTICA
a). Elaboración de papa dextrosa agar (PDA). Crecen la mayoría de hongos y bacterias.
Papa partida 200 gr.
Dextrosa (glucosa) 13 gr.
Agar 18-16 gr.
Agua destilada 1000 ml
1. Hierva las papas partidas en 500 ml de agua.
2. En otro recipiente disuelva el agar, calentando para ayudar a disolver. 3. Cuele el caldo de papa a través de la manta de cielo o algodón. Mezcle
ambos líquidos, agregue la dextrosa y homogenice.
4. Divida el líquido en recipientes adecuados (matraces o tubos). Tapar los matraces con tapón de algodón. En caso de requerir el medio en tubos de cultivo, se vacía a estos cuidadosamente, procurando no derramar medio en la boca de los tubos. Los tubos también se tapan con algodón (al igual que los matraces); en caso de ser tubos con tapa de rosca, esta deberá quedar ligeramente floja durante la esterilización.
5. Esterilizar matraces y/o tubos en el autoclave u olla de presión de 15-20 libras/pulgada2 (± 120 oC durante 15-20 minutos) contados a partir del
momento en que se alcance la presión ya mencionada.
6. Abra la olla o autoclave hasta que la presión baje a cero. Deje enfriar el medio al contacto con el aire, cuando este se encuentre tibio se vacía a cajas de Petri en condiciones asépticas, es decir en la cámara de transferencia o al manos desinfectando una mesa y auxiliándose de mecheros de gas. Las corrientes de aire deberán evitarse al máximo. Los tubos de ensayo se colocan en posición inclinada hasta que el medio solidifique, apretando los tapones de rosca o algodón, según se trate. 7. En ocasiones se agregan 2 o 3 gotas de ácido láctico (antes de vaciar)
para prevenir el desarrollo de bacterias. en otros casos se agregan pequeñas cantidades (50-200 ppm) de antibióticos tales como la estreptomicina, penicilina, etc., también antes de vaciar, el cloranfenicol tolera la esterilización en las condiciones antes señaladas. A ciertos
