Preincubación de la monocapa de enterocitos con microorganismos de kefir

Uno de los mecanismos a través del cual los probióticos pueden proteger al hospedador de patóge os i testi ales es edia te el de o i ado efe to arrera . Este hace referencia al proceso mediante el cual los microorganismos asociados a la monocapa impiden el contacto del patógeno con las células epiteliales evitando así su asociación e invasión.

A fin de evaluar si microorganismos contenidos en el suero fermentado con gránulos de kefir son capaces de ejercer este efecto, los mismos fueron resuspendidos en PBS,

adicionados a células Caco-2/TC7 e incubados durante 1 h a 37 °C. Durante este tiempo quedaron adheridas a la monocapa levaduras en el orden de 105 UFC/fosa y bacterias ácido lácticas en el orden de 104 UFC/fosa (ver Tabla 3.2). Luego se adicionó sobre la monocapa Salmonella Enteritidis 2713, CIDCA 101 o 261Den concentración 108 UFC/fosa y se evaluó la asociación del patógeno.

Pudo observarse que la preincubación de la monocapa con microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir no disminuyó la capacidad de asociación de ninguno de los 3 aislados de S. Enteritidis evaluados (Tabla 3.4).

Tabla 3.4: Asociación de Salmonella Enteritidis 2313, CIDCA 101 y 261D a monocapas de células Caco-2/TC7 preincubadas con microorganismos de kefir.

Tratamiento 2713 (UFC/fosa) CIDCA 101 (UFC/fosa) 261D (UFC/fosa) Control 1.0 ± 0.9 x 106 a _{4.4 ± 0.4 x 10}6 a _{3.9 ± 2.3 x 10}5 a SFG1 _{2.0 ± 1.9 x 10}6 a _{5.0 ± 2.4 x 10}6 a _{3.0 ± 2.9 x 10}6 b SFG 5x2 5.4 ± 1.4 x 106 b ND4 ND Cepas3 6.6 ± 1.5 x 106 b ND ND 1

SFG: microorganismos presentes en suero fermentado 24 h a 20 °C con 10 % p/v de gránulos de

kefir. 2 5x: concentración de microorganismos cinco veces mayor. 3 Lactobacillus plantarum CIDCA

8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 crecidos en cultivo

mixto en suero durante 72 h a 30 °C. En todos los tratamientos los microorganismos fueron separados del suero fermentado por centrifugación y resuspendidos en PBS. Luego se incubaron 1 h

sobre la monocapa antes de la infección con 108 UFC/fosa de Salmonella Enteritidis.

4 _{ND: no determinado}

Dentro de la misma columna letras distintas representan diferencias significativas evaluadas

mediante el test T de Student a un nivel de significancia de 0.05.

Los resultados hallados podrían deberse a que, tal como se describió en la sección 2, las bacterias y levaduras se hallan dispersas o formando grupos sobre la monocapa, quedando zonas descubiertas que pueden ser colonizadas por el patógeno (Figura 3.10). Otros autores han reportado que, cuando los microorganismos adheridos a células epiteliales in-vitro no forman una cubierta homogénea, no impiden la asociación del patógeno (Golowczyc y col., 2009; Martins y col., 2010).

A fin de aumentar la cantidad de microorganismos de kefir adheridos y reducir así los espacios libres para la colonización del patógeno se aumentó 5 veces la concentración de microorganismos adicionada a la monocapa. En contraposición con el resultado esperado se halló que la asociación de Salmonella Enteritidis fue significativamente mayor que en el control (Tabla 3.4). Un resultado similar se obtuvo al pre-incubar la monocapa con cepas aisladas de kefir crecidas en suero. En este caso el número de microorganismos de kefir que adhieren a la monocapa es ~ 10 veces superior que al pre-incubar la monocapa con los

microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir, ya que quedan adheridas levaduras en el orden de 106 UFC/fosa y bacterias ácido lácticas en el orden de 105 UFC/fosa (ver Tabla 3.3). Sin embargo, la cantidad de Salmonella asociada aumenta significativamente (Tabla 3.4). Este resultado podría deberse a la capacidad de Salmonella de formar agregados con algunos de los microorganismos de kefir previamente adheridos a la monocapa.

En concordancia con los resultados hallados en este estudio, Golowczyc y col. (2007) no hallaron efecto protector de la asociación ni la invasión de S. Enteritidis por lactobacilos aislados de kefir cuando estos eran incubados sobre la monocapa previamente a la infección.

3.2 Preincubación de Salmonella Enteritidis con microorganismos de kefir

Los probióticos también pueden interaccionar superficialmente con los patógenos antes de su unión al epitelio intestinal afectando su asociación por interferencia con receptores o estructuras de adhesión implicadas en el proceso. Se estudió por consiguiente si la incubación previa de Salmonella Enteritidis con microorganismos de kefir afectaba la capacidad del patógeno de asociarse y/o invadir la monocapa de células Caco-2/TC7. Para esto, se preincubó Salmonella durante 1 h a 37 °C con los microorganismos del suero fermentado y luego la mezcla se colocó sobre la monocapa, evaluándose distintas relaciones de concentración entre el patógeno y los probióticos.

Cuando se preincubó S. Enteritidis CIDCA 101 en concentración 106 UFC/ml con los

microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir (107 UFC/ml de BAL y 106 UFC/ml de levaduras) la relación fue de 1 levadura y 10 BAL por cada Salmonella. En estas proporciones no se hallaron diferencias significativas en la asociación ni la invasión del patógeno a la monocapa (Figura 3.12).

Al realizar el mismo ensayo empleando la misma multiplicidad de infección del patógeno y concentrándose 10 veces los microorganismos de kefir (108 UFC/ml de BAL y 107 UFC/ml de levaduras) la asociación del patógeno disminuyó significativamente (Figura 3.12 A). Asimismo se hallaron diferencias significativas en la invasión con esta relación probióticos/Salmonella (10 levaduras y 100 BAL por cada Salmonella) (Figura 3.12 B).

A B Control SFG SFG 10x 102 103 104 105 106 1 Salmonella 10 Levaduras 100 BAL 1 Salmonella 1 Levadura 10 BAL UF C/f osa  Salmonella Control SFG SFG 10x 100 101 102 103 104 105 1 Salmonella 10 Levaduras 100 BAL UF C/f osa  Salmonella 1 Salmonella 1 Levadura 10 BAL

Figura 3.12: Asociación (A) e invasión (B) de 1 x 106 _{UFC/ml de}

Salmonella Enteritidis CIDCA

101 a monocapas de células Caco-2/TC7 al ser preincubada con microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir (SFG) y con estos microorganismos concentrados diez veces (SFG 10x). Los valores corresponden al promedio de tres ensayos independientes. Las

barras indican desvío estándar. S. Enteritidis preincubada con PBS fue usada como control.

Se indica en cada caso la relación numérica entre el patógeno y los microorganismos de kefir.

La diferencia entre la relación patógeno/probiótico fue asimismo evidente al observar la superficie de la monocapa por microscopía de barrido. Cuando la cantidad de probiótico fue sólo 10 veces superior que la del patógeno, se observaron sobre la monocapa grupos dispersos de bacterias y levaduras (Figura 3.13 A y B). Asimismo se hallaron zonas de epitelio dañadas posiblemente colonizadas por el patógeno (Figura 3.13 C y D).

A B

C D

Figura 3.13: Microscopía electrónica de barrido mostrando la superficie de células Caco-

2/TC7 luego de la infección con Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101

preincubada con microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir. El aumento se indica al pie de cada fotografía. Las flechas rojas señalan zonas de epitelio dañadas posiblemente como consecuencia de la asociación del patógeno.

Cuando se aumentó 10 veces la concentración de microorganismos de suero fermentado se observó la formación de una cubierta compuesta por lactobacilos y levaduras sobre la monocapa (Figura 3.14) y no se observaron zonas de epitelio dañado por el patógeno.

Figura 3.14: Microscopía electrónica de barrido mostrando la superficie de células Caco-

2/TC7 luego de la infección con Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101

preincubadas con microorganismos de suero fermentado con gránulos de kefir concentrados 10 veces. El aumento se indica al pie de cada fotografía.

La observación microscópica de la morfología y del citoesqueleto de los enterocitos indicó asimismo una protección contra los daños causados por el patógeno (Figuras 3.7 B y 3.8 C y D) debido a los microorganismos del suero fermentado con gránulos de kefir concentrados 10 veces, ya que la monocapa no presentó alteraciones luego de la infección con el patógeno (Figura 3.15).

A B

Figura 3.15: Tinción por la técnica de May Grünwald Giemsa (A) y marcación de

citoesqueleto (B) de células Caco-2/TC7 luego de la infección durante 1 h con Salmonella

enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101 incubada previamente con microorganismos de

suero fermentado con gránulos de kefir concentrados diez veces. Se empleó una multiplicidad de infección de 1 bacteria/enterocito. Aumento: 400x (A) y 600x (B). La barra en blanco indica 100 µm.

Se estudió asimismo, el efecto de la preincubación de S. Enteritidis CIDCA 101 con cepas aisladas de kefir crecidas en suero. Cuando se fermentó suero durante 72 h con un cultivo mixto de L. kefir, L. plantarum y K. marxianus la concentración de ambos lactobacilos en el producto fue 1 x 108 UFC/ml y la de la levadura 1 x 107 UFC/ml (Capítulo 1, Figura 1.28). Los microorganismos de este producto fueron centrifugados y resuspendidos en igual volumen de PBS. Luego esta suspensión se incubó 1 h a 37 °C con Salmonella en concentración 106 UFC/ml en PBS. La relación de concentración entre el probiótico y el patógeno fue por lo tanto de 100 bacterias ácido lácticas y 10 levaduras por cada Salmonella. Cuando se infectó la monocapa con Salmonella preincubada con las cepas aisladas de kefir tanto la asociación como la invasión disminuyeron significativamente respecto al control (p>0.05) (Figura 3.16).

A B Control SFC 104 105 1 Salmonella 10 Levaduras 100 BAL UF C/f osa  Salmonella Control SFC 103 104 1 Salmonella 10 Levaduras 100 BAL UF C/f osa  Salmonella

Figura 3.16: Asociación (A) e invasión (B) de Salmonella enterica serovar.Enteritidis CIDCA 101 a monocapas de células Caco-2/TC7 al ser preincubada con una suspensión de

Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces

marxianus CIDCA 8154 (SFC) crecidas en cultivo mixto en suero. Salmonella preincubada

con PBS fue usada como control. Los valores corresponden al promedio de dos ensayos independientes. Las barras indican desvío estándar.

Golowczyc y col., 2007 describieron que L. kefir CIDCA 8348 tiene la capacidad de co- agregar con Salmonella Enteritidis y que esta habilidad está directamente relacionada con la menor capacidad de invasión a células Caco-2 observada en Salmonella luego de ser preincubada con el lactobacilo. Es por lo tanto probable que la co-agregación de L. kefir con Salmonella esté implicada en el efecto protector de la invasión hallado en el presente estudio. Por otro lado se ha descripto que L. plantarum CIDCA 8327 no co-agrega con

Salmonella Enteritidis (Golowczyc, 2008), pero su capacidad y la de K. marxianus CIDCA 8154 de antagonizar la asociación de Salmonella a células epiteliales no ha sido previamente estudiada.

Cuando se analizaron al microscopio de barrido los enterocitos luego de su tratamiento con Salmonella Enteritidis preincubada con L. plantarum CIDCA 8327, L. kefir CIDCA 8348 y K. marxianus CIDCA 8154, se observó sobre la monocapa la misma red de microorganismos cubiertos por material extracelular (Figura 3.17) que cuando se analizó la adhesión de las cepas de kefir en ausencia del patógeno (Figura 3.11). Como se describió anteriormente este material posiblemente corresponda a proteínas del suero y cuya implicancia en el efecto protector observado sería interesante indagar.

Figura 3.17: Microscopía electrónica de barrido mostrando la superficie de células Caco-

2/TC7 luego de la adición de Salmonella enterica serovar. Enteritidis CIDCA 101

preincubada con Lactobacillus plantarum CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y

Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154 crecidas en cultivo mixto en suero. El aumento se

Mediante observaciones microscópicas no pudieron detectarse alteraciones de la morfología de los enterocitos ni de la organización del citoesqueleto luego de la infección de la monocapa con el patógeno preincubado con L. plantarum CIDCA 8327, L. kefir CIDCA 8348 y K. marxianus CIDCA 8154 crecidas en cultivo mixto en suero (Figura 3.18). Esto refuerza las pruebas de que este tratamiento protege los enterocitos contra el daño ocasionado por el patógeno sobre el epitelio intestinal.

A B

Figura 3.18: Tinción por la técnica de May Grünwald Giemsa (A) y marcación de

citoesqueleto (B) de células Caco-2/TC7 luego de la infección durante 1 h con Salmonella

enterica serovar Enteritidis CIDCA 101 incubada previamente con Lactobacillus plantarum

CIDCA 8327, Lactobacillus kefir CIDCA 8348 y Kluyveromyces marxianus CIDCA 8154

crecidas en cultivo mixto en suero. Se empleó una multiplicidad de infección de 1 bacteria/enterocito. Aumento: 400x (A) y 600x (B). La barra en blanco indica 100 µm.

Se demuestra de este modo, un efecto protector de la asociación e invasión de Salmonella Enteritidis por levaduras y bacterias ácido lácticas presentes en suero fermentado con gránulos de kefir cuando su concentración es 10 y 100 veces superior respectivamente a la del patógeno. A esta misma relación de concentración se observa el efecto protector de cepas aisladas de kefir crecidas en cultivo mixto en suero. Sin embargo debe notarse que la reducción de la asociación e invasión de S. Enteritidis fue mayor (~2 órdenes logarítmicos) cuando se preincubó el patógeno con los microorganismos presentes en el suero fermentado con gránulos de kefir que con cepas aisladas de kefir (~ 1 orden logarítmico). Aún cuando se seleccionaron cepas aisladas de kefir con potencialidad para antagonizar la acción de patógenos intestinales, no se logra reproducir el efecto protector del producto

obtenido a partir de la fermentación con gránulos de kefir. El suero fermentado con gránulos contiene especies que no se encuentran en el cultivo mixto, tales como Lactobacillus kefiranofaciens, Lactobacillus parakefir, Lactococcus lactis, y Saccharomyces cerevisiae (Capítulo 1, Resultados y discusión, sección 1.2). Asimismo debe considerarse que el kefir contiene diversidad de cepas de cada especie que difieren en su capacidad antagónica contra patógenos (Golowczyc y col., 2007; Garrote y col., 2010). La multiplicidad de interacciones entre microorganismos que permite esta diversidad constituye la base del poder del kefir como probiótico, que no logró reproducirse mediante formulaciones simplificadas.

Los resultados hallados en el presente trabajo indican que la acción protectora de los microorganismos del suero fermentado sobre la asociación de Salmonella Enteritidis a enterocitos en cultivo es dependiente de la relación numérica entre el patógeno y los probióticos. Bernet y col. (1994) llegaron al mismo resultado utilizando Salmonella Typhimurium y L. acidophilus. Mientras que a una relación 1:10 de probiótico:patógeno el porcentaje de inhibición de la invasión es 9 %, el mismo asciende a 37 % cuando la relación es 1:1. Coconnier y col. (1993) también reportaron que el efecto protector de la invasión de S. Typhimurium por L. acidophilus es dosis dependiente.

Por otro lado se halló protección contra la asociación de Salmonella Enteritidis a la monocapa cuando los microorganismos de kefir fueron incubados con el patógeno previamente a la infección, mientras que no hubo efecto protector cuando los mismos se encontraron adheridos a la monocapa. Esto puede deberse a que cuando se adicionan microorganismos de kefir a la monocapa antes de la infección, solo un pequeño porcentaje (~ 0.5 a 10 %) de BAL y levaduras de kefir se adhieren a las células epiteliales, quedando

sitios descubiertos que podrían ser colonizados por el patógeno. Cuando se incuba el patógeno previamente a la infección con los microorganismos de kefir, la totalidad de microorganismos presentes y no sólo los que adhieren pueden interactuar con el patógeno (Figura 3.19).

A

B

Figura 3.19: Esquema mostrando posibles interacciones entre Salmonella, microorganismos de kefir y células epiteliales en cultivo Caco-2/TC7 en los 2 modelos experimentales evaluados en este estudio: (A) preincubando la monocapa con microorganismos de kefir y

luego adicionando el patógeno y (B) preincubando Salmonella con microorganismos de