2. Marco metodológico y planteamiento de la propuesta
2.6. Obtención de los extractos
2.6.1. Preparación del extracto
El material recolectado fue acondicionado y estabilizado en los laboratorios de la Universidad Politécnica de Chimborazo (ESPOCH), aproximadamente por una semana, para el posterior molido de la muestra con equipamiento procedentes de la misma institución.
24 b) Lavado
Luego de seleccionar la droga vegetal en buen estado. Se procedió a su limpieza con agua común, para la eliminación de residuos de tierra, polvo u otro material, se sumergió a la droga en agua común por 10 minutos repitiéndose el proceso en tres ocasiones y utilizándose agua destilada para la tercera lavada, posteriormente se colocó la droga limpia sin exceso de agua en un lugar fresco y seco, espaciándola adecuadamente sobre un periódico colocando los tallos separados unos de otros para evitar la formación de mohos durante un período de 24 horas (28).
c) Secado
De las plantas recolectadas se escogen las más propicias para el secado del exceso de agua, para ello se utilizan toallas absorbentes.
Secado a la sombra:
El secado es más lento, pero es recomendado para plantas medicinales y que contienen gran cantidad de aceites esenciales como es el caso del Pino
Amarrar varios tallos en manojo usando una liga con cuidado que las hojas queden mirando hacia abajo.
Se colgaron en un lugar con ventilación libre de humedad.
Evitar la luz del sol (29). d) Molienda
Tomar 100 a 150 gr de planta seca.
Colocar en el molino a razón de 30 gramos por molienda.
Recolectar en papel aluminio o fundas herméticas.
Guardar en lugar fresco seco y libre de humedad (28). e) Procedimiento para el tamizaje
La planta fresca, seca o el residuo de una extracción; fue sometida a tres extracciones sucesivas (Esquema 1); a cada extracto I, II y III, se le midió el volumen obtenido y se le calculó su concentración en gramos de sustancias extraídas por mL de extracto. Para ello se tomó una alícuota de 5 mL y se pasó a una cápsula previamente tarada, se evaporo a sequedad en baño de agua y se procedió a su pesaje nuevamente. Se procedió de igual forma que la técnica descrita para la determinación de sustancias solubles (30).
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Ilustración 3. Extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación de técnicas de Tamizaje Fitoquímico.
Posteriormente, en cada extracto por separado, se procedió de acuerdo a los esquemas representados en las ilustraciones 4, 5 y 6.
26 PROCESOS DE MACERACIÓN
EXTRACTO ETÉREO
Se colocaron de 50 a 60 gramos de la planta previamente seca y molida con suficiente éter en un frasco hermético.
Se dejó reposar por 48 horas.
Filtrar y guardar el extracto.
Medir el volumen y calcular la concentración.
El residuo sólido se secó y pesó. EXTRACTO ALCOHOLICO
Colocar el residuo sólido seco de la parte etérea, con tres veces el peso del residuo en volumen con etanol.
Dejar reposar por 48 horas.
Filtrar y guardar el extracto alcohólico obtenido.
Medir el volumen y calcular la concentración.
El residuo sólido secar pesar. EXTRACTO ACUOSO
Colocar el residuo sólido seco de la parte alcohólica, con tres veces el peso del residuo en volumen con agua destilada.
Dejar reposar por 48 horas.
Filtrar y guardar el extracto acuoso obtenido.
Medir el volumen y calcular la concentración del extracto.
El residuo sólido secar, pesar y desechar (31).
PROCESO ANÁLISIS FITOQUIMICO PRELIMINAR (EXTRACTO ETÉREO) Ilustración 4. Reacciones a realizar en el extracto de éter etílico
(TRITERPENOS-ESTEROIDES) ENSAYO DE LIEBERMANN-BUCHARD
5 mL (LACTONAS Y COUMARINAS)ENSAYO DE BALJET
5 mL
(ALCALOIDES) MAYER Y WAGNER
ENSAYOS DE DRAGENDORFF15 mL (dividir en 3 porciones) (ACEITES Y GRASAS)
ENSAYO DE SUDAN5 mL
DIVIDIR EN FRACCIONES EXTRACTO ETÉREO
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Ensayo de Sudan: Permitió reconocer en el extracto la presencia de compuestos grasos, para ello, a la alícuota de la fracción en el solvente de extracción, se le añadió 1 mL de una solución diluida en agua del colorante Sudán III o Sudán IV. Se calentó en baño de agua hasta evaporación del solvente.
La presencia de compuestos grasos se consideró positiva al aparecen gotas o una película coloreada de rojo en el seno del líquido o en las paredes del tubo de ensayos respectivamente (32).
EXTRACTO ALCOHÓLICO
Ilustración 5. Reacciones a realizar en el extracto alcohólico.
Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer en el extracto la presencia de alcaloides, para ello, si la alícuota del extracto estaba disuelta en un solvente orgánico se procedió a su evaporación en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 mL de ácido clorhídrico al 1% en agua. Si el extracto fue acuoso, a la alícuota se le añadió 1 gota de ácido clorhídrico concentrado, (calentado suavemente y dejado enfriar hasta acidez). Con la solución acuosa ácida se realizó el ensayo, añadiendo 3 gotas del reactivo de Dragendorff, si apareció opalescencia se consideró: (+), turbidez definida (++), precipitado (+++) (33). Ensayo de Mayer: Procediendo de la forma descrita anteriormente, hasta obtener la solución ácida. Se añadió una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y se filtró. Luego se añadieron 2 ó 3 gotas de la solución reactiva de Mayer,
EXTRACTO ALCOHÓLICO DIVIDIR EN FRACCIONES 1mL ENSAYO DE CATEQUINAS 2 mL ENSAYO DE RESINAS 2 mL ENSAYO DE FEHLING (AZ. REDUCTORES) 2 mL ENSAYO DE BALJET (LACTONAS) 2 mL ENSAYO DE LIEBERMAN-BUCHARD (TRITERPENOS-ESTEROIDES) 2 mL ENSAYO ESPUMA (SAPONINAS) 2 mL ENSAYO DE Cl 3Fe (FENOLES Y TANINOS) 2 mL ENSAYO DE NINHIDRINA (AMINOÁCIDOS) 2 mL ENSAYO DE BORNTRAGER (QUINONAS) 2 mL ENSAYO DE SHINODA (FLAVONOIDES) 2 mL ENSAYO DE KEDDE (CARDENÓLIDOS) 2 mL ENSAYO DE ANTOCIANIDINA (ALCALOIDES) MAYER Y WAGNER ENSAYOS DE DRAGENDORFF 6 ML en 3 porciones
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si se observó opalescencia (+); Turbidez definida (++); precipitado coposo (+++) (34).
Observación: En el caso de alcaloides cuaternarios y/o amino-óxidos libres, éstos solo se encontrarán en el extracto acuoso y para considerar su presencia la reacción debe ser (++) ó (+++), en todos los casos, ya que un resultado (+), puede provenir de una extracción incompleta de bases primarias, secundarias o terciarias.
EXTRACTO ACUOSO
Ilustración 6. Reacciones a realizar en el extracto acuoso.
Ensayo de Wagner: Similar a los casos anteriores de la solución ácida, se añadieron 2 ó 3 gotas del reactivo, si se observó opalescencia (+); turbidez definida (++); precipitado coposo (+++).
Ensayo de Baljet: Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular Coumarinas, aunque otros compuestos lactónico pueden dar positivo al ensayo.
Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en alcohol, debe evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 mL). En estas condiciones se adiciona 1mL del reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.
El reactivo de Baljet se preparó de la siguiente forma:
EXTRACTO ACUOSO 6 ML en 3 porciones ENSAYOS DE DRAGENDORFF MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES) 2 mL ENSAYO DE CLORURO FÉRRICO (TANINOS) 2 mL ENSAYO DE SHINODA (FLAVONOIDES) 2 mL ENSAYO DE FEHLING (AZ. REDUCTORES) 2 mL ENSAYO DE ESPUMA (SAPONINAS) 10 mL ENSAYO DE MUCÍLAGOS 1 Ó 2 GOTAS ENSAYO DE PRINCIPIOS AMARGOS DIVIDIR EN FRACCIONES
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Solución 1: Hidróxido de sodio al 10% en agua. Solución 2: Ácido pícrico al 1% en etanol.
Las soluciones se tuvieron preparadas de forma independiente y se mezclaron con igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adicionó a la alícuota a evaluar (35).
Ensayo de Hidroxamato férrico para Coumarinas: Una gota del extracto se colocó en una placa de porcelana y se añadió una gota de clorhidrato de hidroxilamina disuelto en etanol al 10%. Se añadieron unas gotas de hidróxido de potasio al 10% en etanol y se calentó a la llama hasta burbujeo, se añadieron unas gotas de ácido clorhídrico 0.5 mol/L y una gota de cloruro férrico al 1% en agua. El desarrollo de una coloración violeta (+), claro (++), intenso (+++) fue tomado como reacción positiva (36).
Ensayo de Borntrager: Permitió reconocer en un extracto la presencia de quinonas. Para ello si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1 mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5 % en agua. Se agita mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su ulterior separación. Si la fase acuosa alcalina (superior) se coloreo de rosado o rojo, el ensayo se consideró positivo. Coloración rosada (++); coloración roja (+++) (37).
Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por ambos tipos de productos poseer un núcleo del androstano, generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en cloroformo, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1 mL de anhídrido acético y se mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayos se dejaron resbalar 2-3 gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar. Un ensayo positivo se tiene por un cambio rápido de coloración: 1- Rosado-azul muy rápido.
2- Verde intenso-visible, algo rápido. 3- Verde oscuro-negro-final de la reacción.
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A veces el ensayo quedó en dos fases o desarrollo de color. Muy pocas veces pudo observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurrió cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. Es necesario tener en cuenta que para la realización de este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente.
La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para diferenciar las estructuras esteroidales de los triterpenoides, las primeras producen coloraciones azules o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes (38).
Ensayo de catequinas: Para ello, tome de la solución alcohólica obtenida una gota, con la ayuda de un capilar y aplique la solución sobre papel de filtro. Sobre la mancha aplique solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indicó un ensayo positivo (39).
Ensayo de resinas: Para detectar este tipo de compuesto, adicione a 2 mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. La aparición de un precipitado, indica un ensayo positivo.
Ensayo de Fehling: Permitió reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello, si la alícuota del extracto no se encuentra en agua, debe evaporarse el solvente en baño de agua y el residuo redisolverse en 1-2 mL de agua. Se adicionaron 2 mL del reactivo y se calentó la mezcla en baño de agua 5-10 minutos. El ensayo se consideró positivo si la solución se coloreo o apareció precipitado rojo (40).
Ensayo de la espuma: Permitió reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que, si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluye con 5 veces su volumen en agua y se agita la mezcla fuertemente durante 5-10 minutos.
El ensayo se consideró positivo si apareció espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y persistente por más de 2 minutos (34).
Ensayo del cloruro férrico: Permitió reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto de la planta se realiza con alcohol, el ensayo determina tanto fenoles como taninos. A una alícuota del
31
extracto alcohólico se le adicionaron 3 gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica (cloruro de sodio al 0.9 % en agua). Si el extracto es acuoso, el ensayo determina fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añadió acetato de sodio para neutralizar y tres gotas de una solución de tricloruro férrico al 5 % en solución salina fisiológica, un ensayo positivo puede dar la siguiente información general:
Desarrollo de una coloración rojo-vino, compuestos fenólicos en general.
Desarrollo de una coloración verde intensa, taninos del tipo pirocatecólicos.
Desarrollo de una coloración azul, taninos del tipo piro galotánicos (41). Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides en un extracto de un vegetal. Si la alícuota del extracto se encuentra en alcohol, se diluye con 1 mL de ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se espera 5 minutos, se añade 1 mL de alcohol amílico, se mezclan las fases y se deja reposar hasta que se separen. Si la alícuota del extracto se encuentra en agua, se procede de igual forma, a partir de la adición del ácido clorhídrico concentrado. Se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos (33).
Ensayo de Quede: Permitió reconocer en un extracto la presencia de glicósidos cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1 mL del reactivo y se dejó reposar durante 5-10 minutos. Un ensayo positivo es en el que desarrolla una coloración violáceo persistente durante 1-2 horas.
El reactivo de Quede se preparó de la siguiente forma:
Solución 1: Ácido 3.5 dinitrobenzóico al 2 % en metanol.
Solución 2: Hidróxido de potasio al 5.7 % en agua.
Las soluciones se tienen preparadas de forma independiente y se mezclan igual cantidad en volumen de cada una de ellas justo en el momento de realizar el ensayo. Dicha mezcla es la que se adiciona a la alícuota a evaluar (42).
Ensayo de antocianinas: Permitió reconocer en los extractos vegetales la presencia de estas estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo de los flavonoides. Se calentaron 2 mL del extracto etanólico durante 10 min. con 1 mL de HCL, se dejó enfriar y se adicionó 1 mL de agua y 2 mL de alcohol amílico.
32
Se agitó y se dejó separar las dos fases. La aparición de color rojo a marrón en la fase amílica fue indicativa de un ensayo positivo (43).
Ensayo de mucílagos: Permitió reconocer en los extractos de vegetales la presencia de esta estructura tipo polisacárido, que forma un coloide hidrófilo de alto índice de masa que aumenta la densidad del agua donde se extrae. Para ello una alícuota del extracto en agua se enfrío a 0-5 pc y si la solución tomo una consistencia gelatinosa el ensayo fue considerado positivo (44).
Ensayo de principios amargos y astringentes: El ensayo se realiza saboreando 1 gota del extracto acuoso o del vegetal y reconociendo el sabor de cada uno de estos principios, bien diferenciados al paladar (45).
f) Obtención de extractos vegetales Materiales
Soporte universal
Pinzas Fisher
Reverbero
Mangueras de Hule
Balón de fondo plano de 500ml
Dean Stark
Balanza
Se colecta el follaje en los sitios determinados y se traslada al laboratorio para la obtención del extracto.
1. Se arma el sistema (figura 5).
2. Se agrega 300 ml. de agua en el matraz de 500 ml con 200g de muestra vegetal fresca.
3. Se coloca los núcleos de ebullición dentro del matraz generador de vapor. 4. Se colocan las mangueras para el paso del agua.
5. Se calienta el matraz y el material recolectado en el Dean stark se separa por división en fases.
6. Se realiza el cálculo del porciento de rendimiento según la siguiente fórmula:
% 𝐝𝐞 𝐫𝐞𝐧𝐝𝐢𝐦𝐢𝐞𝐧𝐭𝐨 = 𝒗𝒐𝒍𝒖𝒎𝒆𝒏 𝒅𝒆 𝒂𝒄𝒆𝒊𝒕𝒆 𝒆𝒔𝒆𝒏𝒄𝒊𝒂𝒍 𝒑𝒆𝒔𝒐 𝒅𝒆 𝒍𝒂 𝒎𝒖𝒆𝒔𝒕𝒓𝒂 ∗ 𝟏𝟎𝟎
33
% 𝐝𝐞 𝐫𝐞𝐧𝐝𝐢𝐦𝐢𝐞𝐧𝐭𝐨 = 𝟎. 𝟕
𝟐𝟎𝟎 ∗ 𝟏𝟎𝟎
Ilustración 7. Obtención de los extractos vegetales
g) Determinación de la actividad antimicrobiana por el método Agar dextrosa Sabouraud
Preparación Agar Dextrosa Sabouraud
Disolver 65,5 g de medio en 1 litro de agua destilada.
Calentar hasta ebullición, agitando para su completa disolución
Tapar el Erlenmeyer y llevar a auto clavar a 121ºC por 15 minutos o 116ºC por 10 minutos.
Dejar enfriar las placas.
Siembra de Agar Dextrosa Sabouraud
Método de difusión en agar
CANTIDAD DE
MUESTRA(g) ml
% de
rendimiento
34
Esta prueba se basó en la inhibición del crecimiento fúngico, mediante la difusión de las sustancias activas en un medio sólido y se evidencia por la formación de halos claros alrededor de las colonias.
a) Hongos
Cándida albicans (ATTCC 10231), cepa proveniente del laboratorio “BIOLAB” en la ciudad de Riobamba, sector la Dolorosa.
b) Preparación del inoculo
Para la preparación de la suspensión del inoculo, se usaron microorganismos crecidos en Agar Dextrosa Sabouraud de 48 horas para Cándida albicans. Se suspendieron los microorganismos en solución salina 0,85% estéril, hasta lograr un inoculo de 1 x 106 ufc/mL, acorde a la turbidez.
Preparación e inoculación de las placas
En medio agar dextrosa Sabouraud previamente reconstituido, esterilizado y mantenido a 45 ºC.
Inocular con 1 ml de suspensión de inoculo (1 x 106 ufc/mL.) por cada 100mL de medio, homogenizado.
Distribuir en Placas Petri de 90 mm de diámetro a razón de 20mL por placa.
Dejar solidificar y se rotuló con el nombre del microorganismo. Preparación de los discos de papel filtro (extractos alcohólicos)
Se utilizaron discos de papel filtro con peso de 30 ± 4 mg/cm2 con un diámetro de 6.35 mm con la ayuda de una perforadora de papel.
Se separaron los discos en cuatro grupos y se cargaron los extractos alcohólicos de pino en las siguientes concentraciones.
25%
50%
75%
100%
Preparación de las concentraciones.
El presente cálculo inicia desde el volumen obtenido de solución de extracto de Pinus radiata (100 ml). Para esto se aplicó la siguiente fórmula:
C1* V1 = C2*V2
35 Despejando V1 se obtuvo:
V1= C2*V2/ C1 Donde:
C1 = equivale al 100% de la concentración inicial
C2 = concentración a la que queremos llegar, 25%, 50%, 75% y 100%
V1 = cantidad de ml de alcohol que debemos añadir para las concentraciones V2 = Cantidad inicial en ml (100 ml)
Esta ecuación fue aplicada para el cálculo de los volúmenes de alcohol según las concentraciones requeridas.
Con el uso de una micropipeta se procedió a colocar en cada papel filtro la disolución respectiva del extracto y aceite esencial.
a) Colocación de los discos de antimicrobiano
Colocar los discos máximo 15 minutos tras la inoculación en las placas.
Aplicarlos con la ayuda de una pinza como se muestra en la ilustración 8.
Realizar el procedimiento por triplicado
Observar los halos de inhibición formados tras la incubación de 24 horas a 37ºC.
Ilustración 8. Colocación de los discos de antimicrobiano
36
Ilustración 9. Colocación del extracto y aceite esencial
Fuente: Autora b) Controles
Para el ensayo se usaron como controles positivos ketoconazol y alcohol absoluto.
Las pruebas se realizaron por cuadruplicado. c) Lecturas e interpretación de resultados
Se observaron las zonas claras de inhibición de crecimiento (halos). Los diámetros se midieron en milímetros.
Se consideró actividad antifúngica significativa a un halo de inhibición mayor al de control (ketoconazol.
Pruebas de sensibilidad a antifúngicos con ketoconazol y alcohol absoluto Las pruebas de sensibilidad tienen como objetivo conocer si los microorganismos ensayados son sensibles o resistentes a los antimicrobianos, y sirven para elegir de forma óptima el tratamiento anti fúngico.
PROCEDIMIENTO DE DIFUSIÓN EN AGAR CON DISCO
Se inoculó el microorganismo en la superficie del agar.
Se depositó un disco con una concentración conocida al antimicrobiano.
Disco de ketoconazol en la parte superior y de alcohol absoluto en la parte inferior
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Observar el aparecimiento de la zona de inhibición de crecimiento alrededor del disco.
Dependiendo del tamaño de la zona se puede determinar si el microorganismo es sensible, intermedio, indeterminado o resistente al antimicrobiano.
Se utilizó el ketoconazol como prueba positiva y etanol al 86 % para descartar la interferencia del solvente.
Evaluación cuantitativa de la diversidad de especies.
Valor de Uso de las Plantas
Según Martín (46) y Phillips y Gentry (47), trabajando en la amazonia peruana propusieron un nuevo enfoque al valor de uso. Estos autores basaron sus evaluaciones de la importancia cultural en una técnica del índice de informante, relacionado con las coincidencias entre la gente local acerca de la utilidad de las distintas especies.
Martín sugiere que no todos los usos tienen igual importancia debido al significado cultural que tienen muchas plantas, sin embargo, pueden mostrar un valor de uso bajo en relación a otras, debido al poco conocimiento de sus otros