HIJOS X X Y Y M ARCADORE S EN EL PADRE Crossing-over o recom binación X Y Fig. 26 - 16. El material genético del padre sé recombinó durante el proceso de espermatogénesis. La frecuencia de estos eventos de crossing-over ayudan a determinar la distancia entre los
marcadores
e) MAPEO LIGADO A MARCADORES
El Mapeo ligado a marcadores se encuentra constituido por los mapas de menor resolución y dependen de regiones expresadas del DNA (genes), como secuencias que no se expresan, pero cuya pauta de herencia (secuencia específica) puede ser reconocida y seguida (Ver marcadores moleculares en Herramientas) en los
descendientes.
Los genes se pueden analizar por sus características fenotípicas, como X e Y en la figura 26 - 16 o bien pueden ser reconocidos por sus características polimórficas, es decir las formas alternativas de un alelo o bien la presencia de distintos alelos entre los diferentes individuos de una familia, como ocurre con el color de los ojos, el pelo, la estatura. En cambio entre las secuencias que no se expresan y que pueden ser seguidas, encontramos a los polimorfismos representados por secuencias repetitivas en su DNA que pueden variar en tamaño y número de repeticiones en los distintos individuos. En el mapeo ligado a marcadores se emplean las frecuencias con que se expresan los marcadores o las características ligadas a los genes que aparecen en los descendientes para asignar las ubicaciones en el cromosoma. Este reconocimiento se lleva a cabo después de la gametogénesis cuando han pasado por la recombinación o “crossing-over”. Es así posible construir un mapa observando cuan frecuentemente dos marcadores o genes se heredan juntos o cuan frecuentemente dos marcadores o genes pasan desde los padres hacia los hijos. Mientras más juntos en el cromosoma, es menos posible que se separen y mientras más lejos es más posible que se hereden separados y aparezcan en distintos hermanos y no en uno solo de ellos.
De esta forma es posible asignar un par de genes o marcadores a un área específica del cromosoma, donde las distancias se miden en términos de Centimorgans (cM), en honor a un genetista de ese apellido. Dos marcadores se encuentran separados por 1cM cuando aparecen separados por recombinación, tan solo el 1% de todas las veces (el 99% salen juntos) y esto equivale en un mapa físico a la distancia de 1 millón de pares de bases entre los dos marcadores.
Por otro lado, dentro de los marcadores determinados por la secuencia cuya pauta puede ser seguida se encuentran ciertas secuencias con simetría bicatenaria que constituyen polimorfismos. Esto significa que la misma secuencia se ubica en distintos lugares en diferentes individuos y son reconocidas por ciertas enzimas denominadas
Endonucleasas de Restricción (Ver herramientas).
Cada una de estas enzimas es capaz de reconocer una secuencia específica, pero como esta se ubica en distintas posiciones en los distintos individuos, tanto en el DNA “de relleno” como en los genes que son de interés. Al ser cortadas generan una población de fragmentos de distinto largo o polimorfismos típicos de cada individuo. Cada
endonucleasa actúa produciendo un patrón típico de cortes para cada individuo. Estos fragmentos se pueden emplear para reconocer sectores específicos del DNA tanto en los mapas físicos como en aquellos mapas de entrecruzamiento o recombinación y la técnica derivada de esta análisis se denomina RFLP.
f) EMPLEO DE RFLP (RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIÓN
En la Fig. 27 - 16 se observa el empleo de la técnica denominada RFLP. Esta técnica es utilizada para estudiar aquellos casos donde una enfermedad genética produce un patrón típico de fragmentos polimorfos distribuido entre los progenitores y
descendientes. Esta observación se logra mediante el análisis de los productos de una digestión con una o más endonucleasas de restricción, lo que deja un patrón reconocido de cortes que se visualiza por una electroforésis.
Los fragmentos obtenidos por digestión enzimática (endonucleasa de restricción) se separan por electroforésis en un gel de Agarosa según tamaño y carga. Los fragmentos de DNA migrarán desde el Cátodo (-) hacia el Ánodo (+) de acuerdo a:
a) su carga negativa (Fosfatos), que aumenta con el largo del fragmento b) el diámetro de los poros del gel..
En aquellos individuos considerados como mellizos univitelinos o en aquellos casos en que los distintos genes poseen ambos alelos idénticos, se produce un patrón típico de homocigotos, es decir la endonucleasa de restricción cortó el DNA entregando
fragmentos del mismo tamaño y que en el gel se superponen en la misma posición (Fig. 27 – 16).
Por otro lado, los fragmentos de distinto tamaño que aparecen en el gel serán típicos de los polimorfos o provenientes de genes heterozigotos de cada padre y dan una banda superior y otra inferior (Fig. 27 – 16).
En ambos casos los fragmentos se distinguirán al visualizarlos pasando luz UV por ellos o tiñendo con Bromuro de Etidio, colorante que se intercala en el DNA y lo hace visible.
Cómo resultado de la migración de los segmentos de DNA es posible observar
innumerables bandas, sin saber cuales son las que corresponden al gen de la cadena β de la hemoglobina. Luego, para identificar al gen en esta población de fragmentos de distinto tamaño, se debe usar una sonda o hebra de DNA o RNA con marca radiactiva o inmunológica o fluorescente a la UV. Esta sonda debe corresponder a una secuencia de bases específica, complementaria al segmento del gen de la cadena β.
Ahora, para que la sonda reconozca y se una a la hebra complementaria correspondiente al gen de la cadena β, entre los fragmentos del gel. Se debe proceder a un tratamiento con una solución salina capaz de separar ambas hebras. Posteriormente se traspasa una de ellas por difusión a un papel de nitrocelulosa. Esta última técnica se denomina Southern Blot (ver herramientas) o técnica del traspaso.