GENES 1
1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA CELULAR 800
a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS 802
b) AMPLIFICACIÓN POR CLONACIÓN 803
c) BIBLIOTECAS DE GENES 806
d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS 806
e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) 808
f) SECUENCIACIÓN DEL DNA 813
2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES 814
a) RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restricción 815
b) VNTR (Variable Number Tandem Repeats) o Reticiones en Tandem (una tras otra) de Número Variable 816
c) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) o DNA Polimórfico Amplificado al Azar 818
d) AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism ) Polimorfismo en el Largo del Fragmento Amplificado 818
e) STS (Sequence Tagged Site) o Sitio Marcado por la Secuencia 819
f) EST por Expresed Sequence Tag o Expresión de la secuencia marcadora 819 g) MARCADORES MICROSATÉLITES 821
GENES 2
3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR 823 a) MUTACIONES 825
b) CARIOTIPO 828
c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO 829 d) MAPEO DE LOS GENES 829
e) MAPEO LIGADO A MARCADORES 830
f) EMPLEO DE RFLP POR RESTRICTION FRAGMENT POLYMORPHISM O POLIMORFISMO EN EL LARGO DE LOS FRAGMENTOS 831 g) MAPEO DE UN GEN 833
h) EMPLEO DE VNTRS POR VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS O REPETICIONES EN TANDEM DE NUMERO VARIABLE 834
i) MAPAS FISICOS O MAPAS DE ADN 837 j) MAPA CITOGENETICO 837
k) LA HIBRIDACIÓN IN SITU 838
l) FISH POR FLUORESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION 839 m) MAPEO TOP-DOWN 840
n) MAPEO BOTTOM-UP 841
1) HERRAMIENTAS DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
La Medicina Molecular se caracteriza por estudiar las enfermedades y su curación a nivel molecular. Para ello emplea las herramientas de la Biología Molecular y la Bioquímica aplicadas tanto en el estudio de las Proteínas como de los Ácidos Nucleicos.
Entre estas herramientas podemos empezar por aquellas enzimas denominadas Endonucleasas de Restricción. Estas enzimas son originalmente empleadas por las bacterias para defenderse de las infecciones causadas por Fagos, es decir las bacterias restringen a los Fagos.
Fig. 1 - 16. Secuencias de corte reconocidas por distintas Endonucleasas de Restricción.
Así, cuando aparecen secuencias de DNA que el fago ha introducido en la bacteria, se produce el corte de estas mientras que las secuencias similares, propias de la bacteria se metilan para no ser reconocidas por la misma enzima.
A su vez los sitios de corte, se caracterizan por estar flanqueados por secuencias cortas de simetría bicatenaria. Una vez ocurrido el corte, ambos extremos pueden formar lados asimétricos o cohesivos. Sin embargo, otras enzimas de restricción cortan en el mismo sector en ambas hebras quedando ambos lados romos.
Eco R1 5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’Hae III 5’ G G C C 3’
3’ C C G G 5’
Hind III 5’ A A G C T T 3’
3’ T T C G A A 5’
Bam H1 5’ G G A T C C 3’
3’ C C T A G G 5’
: Sitios de corteFragmento cortado por Hind III
Vector cortado por
Hind III
Unión entre DNA del vector y fragmento Empleando la enzima Ligasa
Cromosoma
Bacteriano
Molécula de DNA Recombinante
DNA
Recombinante
Recombinante introducido a la bacteria
DNA del Vector
Las Endonucleasas de Restricción son más de 400 y reconocen y cortan cerca de 100 sitios diferentes. Algunos de estos sitios, se encuentran frecuentemente o cada unos cuantos cientos de pares de bases, mientras que otros se hallan esporádicamente, cada 10.000 pb
En promedio las enzimas de restricción cortan en sitios reconocidos que tienen 4, 6 y 8 pares de bases (fig. 1 – 16), produciendo segmentos sucesivos de 256, 4000 y 64.000 bases de largo en el genoma humano.
Las endonucleasas de restricción hicieron posible la tecnología del DNA recombinante (fig. 2 – 16), ya que con estas enzimas se pueden cortar segmentos de DNA que tengan distintos orígenes y posteriormente juntarlos y proceder a ligarlos, empleando una enzima denominada Ligasa, que produce la unión 3´, 5´ Fosfato o en otras palabras, forma el Fosfodiester. Posteriormente, bajo las condiciones adecuadas (alta
concentración de CaCl2 , etc) las moléculas de DNA recombinante pueden entrar a las bacterias y replicarse, autónomamente o bien pueden integrarse al cromosoma celular. Volver al inicio a) EMPLEO DE ALGUNAS ENZIMAS
Algunas enzimas de E.Coli se emplean para el manejo de los fragmentos de DNA con que se trabaja en la Medicina-Molecular. Así tenemos que el DNA puede ser sometido a varios tratamientos, se puede marcar con grupos Fosfatos como P32 (así se lo ubica en una radioautografía), se puede amplificar con los cebadores adecuados (para aumentar
Tabla 1 - 16
Enzima Actividad Uso
Transcriptasa Inversa DNA polimerasa RNA dependiente de origen viral
Se emplea para convertir RNAm en su copia complementaria de DNAc continuo
DNA Ligasa Une covalentemente la unión Fosfodiester 5´ Fosfato al grupo 3´ Hidroxilo
Se emplea en los
procedimientos donde se requiere DNA recombinante Fosfatasa Alcalina Elimina fosfatos del extremo 5´
del DNA
Se emplea para reemplazar el fosfato 5´ por otro
radiactivo Polinucleótido kinasa Introduce el γ Fosfato de ATP en
el extremo 5´ del DNA Tac (Thermophylus
Acuaticus) DNA polimerasa
DNA polimerasa termoestable que resiste los cambios de temperatura para abrir
(desaparear ambas hebras) y cerrar (aparear hebras complementarias) el DNA
Técnica PCR (Polymerase Chain Reaction) Amplifica ambas hebras de
un segmento de DNA, a partir de unos cebadores
sintéticos (de secuencia conocida) que se aparean
con su parte
complementaria. Al repetir el proceso en ciclos de frío
(apareamiento) y calor (desapareamiento) de las
hebras Endonucleasas de
Restricción
Reconocen sitios de simetría bicatenaria de 4, 6 y 8 pbs cortan dejando lados cohesivos y romos
DNA recombinante, mapeo, etc.
su número de copias), transcribir desde RNA a DNA (se emplea una Transcriptasa Inversa de un retrovirus) o se puede cortar en lugares específicos (con Endonucleasas de Restricción). Algunas de estas enzimas se observan en la Tabla 1 - 16.
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b) AMPLIFICACION POR CLONACION
Uno de los vectores (fig. 3 – 16), que se emplea para introducir DNA exógeno o foráneo a la bacteria es el Plásmido, mientras que el DNA foráneo puede ser DNAc (Ver Glosario al final), obtenido de un RNAm (por Transcriptasa Inversa) o DNA genómico (fragmentos de DNA al azar de un organismo). Es posible aquí sintetizar una segunda hebra al DNAc con una DNA pol I y luego se pueden insertar ambas hebras en un Plásmido o un vector Lambda, para ser posteriormente amplificado por clonación. La clonación se lleva a cabo en vectores contenidos en levaduras, bacterias y partículas virales. El empleo de uno u otro dependerá del tamaño del fragmento a clonar.
El Plásmido (fig. 3 –16), es normalmente conocido por ser un DNA doble hebra circular extracromosómico y autoreplicante de la bacteria, es distinto al genoma normal y no es esencial para la sobrevivencia de la célula. Son conocidos por conferir ventajas selectivas a la bacteria (resistencia a antibióticos).
Fig. 3 - 16. Características del vector pBR322
Los Plásmidos pueden ser transferidos de célula en célula y algunos de ellos se pueden integrar al genoma de la bacteria. Una célula huésped puede tener muchas copias de un plásmido. En la actualidad existe una serie de plásmidos artificialmente construidos, que cuentan con sitios específicos para cargar DNA foráneo y se pueden seleccionar al entregar a la bacteria resistencia a algún antibiótico. Esto permite separar aquellas
bacterias que han adquirido el Plásmido de las otras que no. Algunos de estos plásmidos, pueden también ser replicados en levaduras.
Otros Plásmidos constituyen lanzaderas que son capaces de replicar tanto en E. Coli como en levaduras y son conocidos por las siglas YIP o Yeast Integrating Plasmid, YRP
Resistencia a la
Ampicilina
Resistencia a la
Tetrac iclina
Ori C
PLASMIDO
Vector
pBR322
de YCP por Yeast Centromer Plasmid. El uso de cualquiera de ellos depende del tamaño del segmento de DNA que se quiera amplificar.
Mediante los plásmidos se puede crear una biblioteca genómica o colección no ordenada de clonos formada por fragmentos superpuestos de DNA amplificado, perteneciente a un organismo cualquiera. La relación de unos con otros de los
fragmentos se puede establecer posteriormente por mapeo físico, hasta poner orden en la biblioteca, es decir tener una colección de fragmentos amplificados, pero contiguos. Esto significa que donde termina la secuencia de uno empieza la del otro. Esta colección debe corresponder en total, a un sector específico de un gen.
Los clonos individuales (fragmentos amplificados) se colocan en placas de
microtitulación en dos dimensiones con múltiples pocillos en el plano, donde la ubicación de cada uno es conocida por el número de la fila y columna, fig. 35 - 16.
Otro vector a emplear, puede ser una partícula viral o un bacteriófago como el fago Lambda que contiene 40kb de DNA doble hebra (fig. 4 – 16). A este se puede integrar DNA humano de un tamaño que bordea las 15 a 25kb. Esto se logra por acción de la misma endonucleasa de restricción y posterior unión mediante la enzima Ligasa. Posteriormente al infectar una bacteria y entrar en la etapa lítica se generan nuevas copias del fago que se amplificará junto con el DNA humano, produciendo tantas copias como partículas virales existan.
Otro bacteriófago, es el conocido como P1, que puede acomodar más DNA que el Lambda y constituye el tipo P1- PAC por P1- Plasmid Artificial Chromosome o cromosoma artificial de plásmido.
Forma lineal Bacteriópfasgo Lambda
Secuencia de cabeza y cola Región b2. No esencial para sobreviven cia Genes Rec. Implica dos en recombi nación Genes de Regulación
RS: Lísis del huesped OP: Sints. DNA
RS OP RS OP Secuencia de cabeza y cola Región b2 no esencial para la sobrevivencia Genes de Regulación son genes que inician y terminan el proceso Genes Rec. Implicados en Recombinación Cos: Lados Cohesivos Cos: Lados Cohesivos. La hebra es complementaria
al otro extremo Lados Cohesivos
Forma circular del Bacteriófago Lambda
Un vector aún, de mayor capacidad que los anteriores se denomina Cósmido, y se encuentra construido artificialmente de forma quimérica o mixta con genes del plásmido, para resistencia a antibióticos y otros del Fago Lambda como transportador. Contiene el gen cos (Cohesivo) del fago, cuya actividad promueve el empaquetamiento del DNA foráneo en la partícula viral para posteriormente infectar una bacteria tipo E. Coli, lo que permite la replicación del DNA foráneo con fragmentos de 30 Kb a 45 Kb de largo. Continuando con la descripción de los vectores, tenemos a los YAC, por Yeast Artificial Chromosome (fig. 5 – 16) o cromosoma artificial de levadura. Contiene todos los
elementos que un DNA necesita para funcionar como cromosoma en el organismo huésped y se puede cargar con uno de los mayores fragmentos de 400 Kb a 500 Kb. Se encuentra construido con un fragmento telomérico, que entrega los extremos necesarios para la replicación, más fragmentos centroméricos y las secuencias correspondientes, que indican y promueven el sitio de origen de la replicación que es necesario en la levadura (YCP + Telómeros). También contienen genes que se emplean en la selección de las levaduras que sí han tomado el vector.
A fin de propagar estos vectores en E. Coli antes de cargarlos con DNA, se les ha incorporado un sitio denominado Ori C o de inicio u origen de la replicación bacteriana y un gen que les entrega resistencia a la Ampicilina. Este último se emplea para
seleccionar las bacterias que han tomado el YAC.
Fig. 5 - 16. Características del YAC.
En general una vez que se tiene el DNA humano integrado, mediante el empleo de las Endonucleasas de Restricción y Ligasas en un vector, se procede a amplificarlo
mediante la Clonación, proceso por el cual se producen múltiples copias exactas de un solo gen u otro segmento del DNA para así obtener suficiente material de estudio. El resultado de esta amplificación en distintos segmentos de DNA genera una biblioteca de clonos o colección de clonos hechos de una serie de fragmentos de DNA que se superponen representando el genoma entero del organismo.
SECUENCIA DE REPLICACION AUTÓNOMA CENTROMERO Telomerasa Telomerasa Marcador de Selección Sitio Ori de plasmido y gen Amp
Bam H1 Bam H1 Eco R1
Otro tipo de clonación ocurre cuando se divide una célula haciendo múltiples copias de sí misma y este es el caso de la conocida oveja Dolly. En este caso se recurrió a la
clonación produciendo animales genéticamente idénticos a la oveja donadora de los núcleos de células mamarias, los que fueron posteriormente implantados en oocitos fecundados.
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c) BIBLIOTECAS DE GENES.
El objetivo de la clonación, fuera de amplificar copias del DNA sirve para aislar genes, expresar genes y generar clonos que se emplean como sondas para el análisis genómico. Por lo tanto, para reponer los clonos se debe echar mano a la biblioteca. Durante el procedimiento de aislar genes se debe seleccionar un clono de los muchos presentes en una biblioteca, empleando para ello una sonda formada por un
polinucleótido de DNA o bien un anticuerpo. Una vez que se ha aislado un gen se debe estudiar su expresión mediante un vector de expresión, que consiste en la acción de un promotor específico para este gen y sus condiciones de cultivo en alguna célula
huésped.
Cuando se emplean clonos como sondas para el análisis genómico es posible
determinar el número de copias de un gen en el genoma, sus relaciones taxonómicas y la construcción de mapas por ligación de caracteres.
Biblioteca Genómica: Se produce cuando todo el DNA genómico se digiere y los
fragmentos sé clonan dentro de un vector apropiado. De esta manera es posible disponer de muestras de todo el genoma del organismo representando a las secuencias que codifican y no codifican.
En el caso de que se busque un gen se empleará un vector de inserción que permite amplificar un gran segmento (YAC). En otro caso cuando se necesita una fuente de sondas para mapeo por ligación se necesitaran inserciones menores en vectores (plásmidos). Idealmente una biblioteca de este tipo debe disponer de muchas copias de cada gen.
Biblioteca DNAc: Esta biblioteca se genera a partir de RNAm y Transcriptasa Inversa, de tal manera que solo se representarán los genes que solo se expresan y no aquellos que permanecen silenciosos o aquellos segmentos que separan los genes y constituyen la mayor cantidad de DNA. Por lo tanto el número de genes de que se disponga
dependerá del tejido que se esté considerando y el estado de desarrollo en que este se encuentre.
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d) ANÁLISIS DE LOS PRODUCTOS CLONADOS.
Un gen puede ser identificado mediante el empleo del DNAc (DNA complementario, sin intrones) obtenido desde su propio RNAm. De esta forma se pueden identificar los segmentos de DNA que portan sus características e incluso a cual de todos los cromosomas corresponde. Con este fin se emplea la técnica denominada Southern
Blotting y Northern Blotting. La primera de ellas consiste en separar los fragmentos de distinto tamaño producto de una digestión con Endonucleasas de Restricción en un gel de Agarosa (fig. 6 – 16). Luego se trata el gel con NaOH para denaturar el DNA (separar ambas hebras), se neutraliza este y el DNA es transferido a un filtro de nitrocelulosa o a un papel filtro de nylon, mediante difusión capilar o bajo corriente eléctrica (fig. 7 – 16). Posteriormente, se fija el DNA al papel filtro por tratamiento con UV o “baking”. El mismo papel filtro se pone luego en contacto con la sonda radioactiva o fluorescente que al reconocer su secuencia complementaria hibridiza, identificando a la hebra que después de una radioautografía (si la sonda es marcada radiactivamente), mostrará las bandas correspondientes a los segmentos del gen o exones que se encuentran presentes. En el caso del Northern blotting, se separa RNA por electroforésis (fig. 6 – 16), el que luego es transferido al papel filtro de nitrocelulosa, para ponerlo en contacto con una sonda DNAc y proceder a visualizarlo como se describió anteriormente.
Existe otro desarrollo aún, de este mismo tipo y que se denomina Western blot, en el cual se separan ahora, proteínas por electroforésis con una mezcla: detergente (Sodio Dodecil Sulfato: SDS) en un polímero de separación (Acrilamida) denominada SDS-Poliacrilamida. Las proteínas separadas por peso molecular se transfieren
electroforéticamente a papeles filtros de nitrocelulosa. Luego, se detectan mediante una reacción con anticuerpos marcados con Yodo 131 o con Fluoresceína.
Fig. 6 - 16. Serparación de ácidos nucleicos mediante electroforésis
Fig. 7 - 16. Técnica de traspaso o Southern Blotting. Los ácidos nucleicos son Suministro de energía a los electrodos Gel Hendiduras donde se pone la muestra Buffer
Capas de adsorbentes de toallas de papel Hoja de Nitrocelulosa Gel de Agarosa Buffer Hoja adsorbente
e) AMPLIFICACIÓN POR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION).
El análisis de los genes responsables de una enfermedad puede ser llevado a cabo en muestras extremadamente pequeñas como son los fibroblastos fetales extraídos del líquido amniótico. De esta manera se pesquisan posibles enfermedades genéticas antes del nacimiento, así mismo se puede detectar la identidad del DNA perteneciente a cualquier tejido, pelos, piel, sangre, semen dejado en la escena de algún crimen. Esta técnica es capaz de amplificar secuencias específicas de DNA, circunscrito a tan solo un determinado sector millones de veces, no se requiere de todo el genoma intacto. Incluso modificaciones a la misma técnica permiten detectar mutaciones puntuales de una sola base y niveles de expresión de los genes en muestras muy pequeñas de tejidos.
Fig. 8 - 16. Amplificación por medio de cebadores
La técnica presenta un solo inconveniente comparada con la amplificación por clonación, que siempre es necesaria en los trabajos preliminares y consiste en la síntesis in vitro de un segmento de oligonucleótidos complementario al segmento de DNA a amplificar. Este segmento constituye el cebador o extremo 3´ para la enzima DNA Polimerasa, que genera las hebras complementarias (fig. 8 – 16). De esta manera
subiendo la temperatura la doble hebra se desune, separándose. A continuación al bajar la temperatura, esta vez se aparea con los cebadores o primers, dejando estos el
extremo 3´ para que la DNA pol de Thermophylus Aquaticus (resistente a los cambios cíclicos de temperatura), empiece la replicación del segmento a amplificar.
Posteriormente se repite el ciclo produciéndose nuevas copias cada vez que los cebadores se unen a sus respectivas secuencias complementarias. En 5 ciclos el segmento original de DNA se puede amplificar 2, 4, 16, 256, 65536 veces.
5´ CEBADOR CEBADOR 5´ 3´ 3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 3´ 3´ 5´ 5´ HEBRA NUEVA HEBRA NUEVA UN SOLO CICLO DE REPLICACIÓ 5´ 3´ 3´ 5´ DNA Pol + dNCT + Mg
El producto amplificado se puede analizar mediante electroforésis en Agarosa, seguido de tinción con Bromuro de Etidio, que se intercala entre las bases del DNA y lo hace visible a la luz UV. Por otro lado, también se puede marcar el producto con nucleótidos radioactivos en la posición γ P32
, de esta manera el P32 se incorpora en los productos y estos pueden ser visualizados por radioautografía después de separarse por
electroforésis en Agarosa..
Variaciones de esta técnica se logran aplicándola al producto de la enzima Transcriptasa Inversa o RT-PCR, es decir a partir del RNA total producido por una célula del tejido, la enzima Transcriptasa inversa produce DNAc, el cual es un segmento continuo de solo exones. Posteriormente al agregarse los cebadores adecuados que aparean con los extremos del DNAc, es posible amplificarlo. De esta manera se puede distinguir el producto de tan solo un gen entre cientos de ellos que se encuentran expresados en un cierto tejido, en otras palabras se dice que se abre una ventana.
Fig. 9 - 16. Comparación entre gen normal y mutado por PCR- SSCP. La migración anormal de una sola hebra se debe a la mutación
Otra variación de estas técnicas, donde se puede aplicar PCR, es posible cuando se reconocen mutaciones puntuales en genes ya descritos o caracterizados. Esta técnica se denomina PCR-SSCP por PCR - Single Strand Conformation Polymorphism o Reacción en cadena de la Polimerasa con Polimorfismo en la Conformación de una Sola Hebra (Fig. 9 – 16), y consiste en explotar el cambio conformacional que se
produce en una sola hebra entre el segmento del DNA que posee un gen mutado comparado al segmento normal sin mutación. Para ello se amplifica una secuencia de
CCT G AG G AG G G ACT CCT C CCT G AG G AG G G ACT CCT C CCT GTG G AG G G ACACCT C CCT GTG G AG G G ACACCT C G EN β-GLOBINA NORMAL GEN β-GLOBINA MUTADO
MIG RAC IO N NO RM AL MIG RAC IÓ N ANO R M AL G EN β-GLOBINA GEN β-GLOBINA Una sola hebra Una sola hebra
Am plificación por m edio de cebadores
Material am plificado, m uchas copias a electroforésis
100 a 200 pb de un gen mutado y uno normal, empleando los cebadores que
circunscriben el sector de la mutación. Posteriormente sobre el producto amplificado, se lleva a cabo la separación de ambas hebras y la electroforésis en Poliacrilamida (medio poroso de mayor resolución que la Agarosa), se discrimina aquí la forma de las
Fig. 10 - 16. Reacción en cadena de la Ligasa.
hebras observándose una diferencia en la migración de ambas, la normal y la que posee la mutación.
Otra técnica más empleada para detectar mutaciones puntuales en genes ya conocidos y secuenciados en pacientes con alto riesgo de poseer un alelo mutante, se denomina Ligase Chain Reaction (LCR) por Reacción en Cadena de la Ligasa (Fig. 10 – 16). Consiste en emplear una Ligasa termoestable que une dos Oligonucleótidos
adyacentes siempre que estos hibridicen totalmente con la hebra complementaria. Si la hebra complementaria es la original o “wild type”, la hibridación es de 100% y ambos oligonuclótidos son ligados por la enzima, es decir se produce la unión 3´ OH con el 5´ Fosfato formando el Fosfodiester. Ahora, en el gen mutante si ambos
oligonucleótidos aparean con el resto de su longitud, pero no en el extremo 3´ de cada Oligonucleótido donde se encuentra precisamente la mutación puntual, ya que las bases normales del oligonucleótido no corresponden a las complementarias en el DNA de cada hebra mutada. Se produce aquí una joroba que impide a la Ligasa unir los extremos de los oligonucleótidos adyacentes. Por lo tanto, solo los correctos correspondientes al “wild type” serán amplificados y no los que no se unieron.
De esta manera examinando el número de copias de ambos genes original y mutante se conoce si el paciente lleva la enfermedad
C C T G A G G A G G G A C T C C T C C C T GTG G A G G G A CAC C T C G E N β -G L O B IN A N O R M A L G E N β -G L O B IN A M U T A D O C C T G A G G A G G G A C T C C T C C C T GTG G A G G G A CAC C T C N O R M A L A N E M I A F A L C I F O R M E T A T A L i g a s a t e r m o e s t a b l e O l ig o n u c l e ó t i d o s L ig a d o s U n i ó n 5 , ´ 3 ´ A p a r e o c o r r e c t o A p a r e o i n c o r r e c t o O l i g o n u c l e ó t i d o s O lig o n u c l e ó t id o s L ig a d o s O lig o n u c l e ó - t id o s N o lig a d o s N u e v o s O lig o n u -c le ó t i d o s N o L ig a d o s
La Transgénesis (fig. 11 – 16), es una técnica que consiste en introducir genes foráneos para su estudio en la línea germinal de algunos animales. Una de las primeras
experiencias se llevó a cabo al introducir en ratones el gen de la hormona del crecimiento, obteniéndose individuos con doble tamaño que el normal.
Fig. 11 - 16. Transgénesis.
Para ello se emplean vectores preparados con genes que codifican factores de
transcripción, que promuevan la expresión del gen necesario y se inyectan en el núcleo de huevos fertilizados.
E nzim a d e re s tric c ió n q ue c o rta p a rc ia lm e nte F ra g m e nto s s up e rp ue s to s U nuió n d e lo s fra g m e nto s us a nd o la e nzim a L ig a s a D N A ve c to r c o rta d a c o n la m is m a e nzim a d e re s tric c ió n
Fig. 12 - 16. Separación por electroforésis de la hebra replicada en presencia de los 4 dNTPs más un ddNTP
Los huevos a su vez, se trasplantan al útero de las hembras receptoras para el
desarrollo de las crías transgénicas. El DNA de las crías se emplea luego para detectar la presencia del gen activo.
Si el transgene posee herencia Mendeliana significa que se transfiere en la línea germinal. Esta técnica se emplea en plantas y animales de campo para introducir resistencia a enfermedades e infecciones, así como también para producir hormonas y proteínas humanas presentes en la leche animal.
Un desarrollo de esta última técnica es la Terapia Génica practicada en humanos, sin embargo, existen barreras éticas que impiden su aplicación hasta ahora. En el futuro se pretende reemplazar de esta manera genes enfermos por los correctos. Si se introducen los genes en células somáticas y no en la línea germinal se impedirá el traspaso del gen hacia los descendientes. Se ha practicado esta técnica en la médula de los huesos, fibroblastos y hepatocitos. Los vectores que se emplean en estos casos son derivados de retrovirus, que cuentan solo con las regiones promotoras transcripcionales, como LTRs (Long Terminal Repeats) para manejar la expresión del gen de interés. Se ha logrado éxito solo en células en cultivo y aún no se ha pasado totalmente a la etapa en humanos. Volver al inicio d A T P d A T P d A T P d A T P d G T P d G T P d G T P d G T P d C T P d C T P d C T P d C T P d T T P dT T P d T T P dT T P d d A T P d d G T P d d T T P d d C T P P o s illo s d o n d e s e s e p a r a n lo s fr a g m e n to s r e p lic a d o s c o n la s m e z c la s d e N uc le ó tid o s q u e s e o b s e r va n m á s a r r ib a
f) SECUENCIACIÓN DEL DNA
Para establecer que dos clonos específicos son adyacentes en el genoma se deben construir bibliotecas de clonos con fragmentos que se superpongan parcialmente. Estas bibliotecas de clonos se ordenan dividiendo los incertos en pequeños fragmentos y determinando que clonos tienen secuencias comunes.
Uno de los métodos tradicionales que aún perdura es el de Sanger y consiste en el empleo de un dideoxinucleótido trifosfato (ddNTP) durante la replicación del DNA mediante la DNA pol I. Este nucleótido carece del grupo 3´-OH por lo que la enzima se detiene después que lo adiciona por su lado 5´ al extremo 3´ del Deoxiribonucleótido anterior y no puede continuar replicando en base a la hebra molde (figs. 12 y 13 – 16). De esta manera si se agrega un ddGTP junto a un dGTP se producirá una competencia entre ellos por ocupar un lugar en la hebra naciente. Cuando la hebra madre tiene
Fig. 13 - 16. Secuencia de los fragmentos que se encuentran en cada pocillo del gel
Citosina en su secuencia, la hebra hija adicionará dGTP y una fracción adicionará ddGTP para detenerse produciendo una población de fragmentos que se detienen o siguen cada vez que en la hebra madre aparece una Citosina. Por lo tanto si contamos con cuatro mezclas de los cuatro dNTPs, más cada uno de ellos con ddNTP distinto, tendremos una población de hebras hijas o hebras nacientes que se detendrán cada vez que aparezca la base complementaria a la que tienen
como ddNTP. Por lo tanto se dispondrá de una población de fragmentos de distintos tamaños que se pueden separar por electroforésis ocupando cuatro pocillos, cada uno correspondiente al nucleótido que se encuentra como ddNTP.
SECUENCIA DE 3´ TCGATCGATCGATCGATCGA 5´
LA HEBRA MADRE:
SECUENCIA DE
LA HEBRA HIJA: 5´ AGCTAGCTAGCTAGCTAGCT3´
FRAGMENTOS EN CADA POSILLO
ddA AddG AGddC AGCddT AGCTddA AGCTAddG AGCTAGddC AGCTAGCddT AGCTAGCTddA AGCTAGCTAddG AGCTAGCAGddC AGCTAGCTAGCddT AGCTAGCTAGCTddA
Fig. 14 - 16. Técnica de Chromosome Walking
Otra técnica empleada para llenar huecos durante la secuenciación es la denominada Chromosome walking (fig. 14 – 16) o caminar sobre el cromosoma. Mediante esta, sé hibridiza un cebador de secuencia conocida a un clono al azar de una biblioteca genética y se sintetiza la hebra complementaria, posteriormente esta se aísla y su secuencia terminal 3´ , se emplea como cebador para continuar replicando la hebra complementaria o continuar caminando sobre el cromosoma. Sin embargo, debido a que los cebadores deben ser sintetizados químicamente el gran número de cebadores que se necesita para avanzar presenta una desventaja.
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2) MARCADORES MOLECULARES QUE NO SON GENES.
Se encuentran constituidos por distintas secuencias que no son parte de los genes y entre ellas tenemos:
a) sitios específicos de corte para las enzimas de restricción. b) secuencias repetidas en tandem de 8 a 16 pares de bases c) secuencias repetidas en tandem de 4 a 6 pares de bases
GEN SECUENCIADO
CEBADOR CEBADOR CEBADOR CEBADOR CEBADOR5´
3´
5´ 3´
Marcador que flanquea el gen Marcador que flanquea el genTodas estas secuencias se heredan según la genética Mendeliana, así tenemos que mientras más relacionadas se encuentren dos personas, compartirán un número mayor de fragmentos de igual tamaño como producto de las enzimas de restricción. Esta técnica es la más antigua y se llama RFLP por Restriction Fragment Length Polymorphism o Polimorfismo en el Largo del Fragmento de Restricción.
a) RFLP ( RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM) O POLIMORFISMO DEL FRAGMENTO DE RESTRICCIÓN
Esta técnica se basa en los polimorfismos que existen en la secuencia de los
cromosomas, es decir, el mismo cromosoma en dos personas distintas, presenta una variación cada 200 a 500 pb en la secuencia. Esta variación crea o hace desaparecer un sitio de restricción y se alterará con ello el tamaño de los fragmentos. No requiere de secuenciación, pero sí de una biblioteca creada a partir de fragmentos de DNA clonados en un vector. Luego se emplea una sonda basada en DNA genómico o DNAc. Se debe emplear una separación electroforética en geles de Agarosa.
El DNA del organismo que interesa se digiere con endonucleasa de restricción y luego es sondeado con una biblioteca de DNA clonado. Los apareamientos de la sonda con el DNA se observan por radioautografía o fluorescencia. Se puede detectar siempre el mismo sitio y sirve para mapeos. Los polimorfismos se detectan como diferencias en pesos moleculares manifestado por la migración en el gel de Agarosa de los fragmentos del DNA del huésped.
Fig. 15-16. Los fragmentos producidos por los sitios de corte por la enzima de restricción se visualizan mediante un Southern Blot con su respectiva sonda.
ALELO A ALELO B SITIOS DE CORTE POR LA ENZIMA DE RESTRICCIÓN ALELO A ALELO B SONDA MARCADA
*
*
*
b) VNTR (VARIABLE NUMBER TANDEM REPEATS) O REPETICIONES EN TANDEM (UNA TRAS OTRA) DE NÚMERO VARIABLE
Por otro lado, al agregar cebadores o partidores sintéticos que aparean con aquellos sectores de la hebra que flanquea a secuencias repetitivas en tandem, se logra observar que mientras más relacionadas se encuentren dos personas mayor será el número de fragmentos amplificados coincidentes, es decir con igual número de secuencias repetitivas y por consiguiente igual tamaño.
Así tenemos que esta técnica se puede aplicar a los VNTR por Variable Number Tandem Repeats o Número Variable de Secuencias Repetidas en Tandem (cabeza con cola como los carros de un tren). Estos segmentos se encuentran
inter-espaciados en el genoma humano.
El número de secuencias repetitivas en un locus (lugar particular del cromosoma) varía con las personas, es decir presenta polimorfismos (pueden tener un mayor o un menor número de repeticiones). Además, en cada persona existe un alelo paterno y otro materno de distintos tamaños o número de la misma secuencia repetitiva. Así que, mientras más emparentados se encuentren las personas los segmentos repetitivos serán cada vez más similares. Ocurre que en mellizos idénticos, al ser su DNA cortado por la misma Endonucleasa de Restricción o en el caso de que sus secuencias repetitivas sean amplificadas por cebadores
específicos ubicados en los flancos y ambos separados por Electroforésis, los fragmentos y las repeticiones deberán de ser todas iguales.
Fig. 16a - 16. Los fragmentos obtenidos por endonucleasa de restricción, que corta los sitios que flanquean a las secuencias repetitivas, se separan por tamaño mediante Electroforesis. Finalmente se visualizan aquellos que se unen
a una sonda fluorescente o marcada con P32. Esta sonda es una secuencia complementaria a la región que se repite
Fig. 16b – 16. La sonda se une a los fragmentos con distinto número de secuencias repetitivas ya que se trata de secuencias
Repetitivas de distinta naturaleza con distintos tamaños. Esta sonda es complementaria a las múltiples secuencias repetitivas (Sonda Multilocus)
a) RFLP expuesto a sonda de VNTR (aparea con solo
una secuencia repetitiva) en seis individuos
distintos
b) VNTR disperso en genoma. Sonda VNTR multilocus (aparea con distintas secuencias
repetitivas) en 5 individuos distintos
Algunas secuencias repetitivas se encuentran en un solo locus (lugar) específico en el genoma humano. Las sondas construidas en base a estas secuencias, son sondas de un solo locus (un solo tipo de secuencia repetitiva) y dejan un patrón de distribución típico cuando se usan como sondas para hibridar Southern Blots de RFLPs, es decir a como se denomina a los traspasos de RFLPs, fig. 16a - 16. En este caso, la visualización
producida por sondas de un solo locus de la VNTR previamente cortada con
endonucleasas de restricción es más fácil de interpretar, puesto que cada individuo no debe de tener más de dos bandas claras constituidas por una región no codificante con la misma secuencia repetitiva, pero en distinto número presente en el alelo paterno y materno, que puedan coincidir o diferir entre ellas para determinar su relación o
identidad.
Otras secuencias con VNTRs se encuentran en muchos loci (mezcla de fragmentos con varios tipos de secuencias repetitivas) en el genoma humano o bien la visualización de estos fragmentos mediante sondas VNTR de múltiples locus,
producen más información puesto que se sondean de 10 a 30 loci o lugares en el cromosoma donde se encuentran secuencias repetitivas, pero distintas. Estos loci se encuentran dispersos entre los cromosomas humanos como se observa en Figura 16b – 16, dando origen a muchas más bandas que se pueden comparar para identificar a los individuos.
Análisis de un solo locus por sonda VNTR o análisis por VNTR de múltiples locus se pueden usar con fines forénsicos o para determinar paternidad.
Fig. 17 - 16.Dos tipos de secuencias repetitivas visualizadas con sus respectivas sondas en distintos alelos
En la figura 17-16, se observan dos secuencias repetitivas con sus respectivos alelos junto a los sitios de corte por las Endonucleasas de Restricción. Ambas pueden ser identificadas por los fragmentos que aparecen en el Southern Blot a la derecha de la
S E C U E N C IAS R E P E TIT IV AS E N T AN D E M 1 0 K b 3 K b 9K b 6K b 10K b 9K b 6K b 3K b Alelo s d e rep etic ió n la rg a
Alelo s d e re p etició n co rta
S itios d e corte p or la E ndo nucle asa de R es tricció n
posición de las bandas, si son parientes algunas bandas tendrán igual número de repeticiones entre ellos.
Volver al inicio c) RAPD (RANDOM AMPLIFIED POLYMORPHIC DNA) O DNA POLIMÓRFICO AMPLIFICADO AL AZAR.
Esta técnica requiere de PCR, pero no de clonación ni de secuenciación. Puede detectar varios loci o sitios mediante el empleo de cebadores cortos de 10pb que tienen una secuencia al azar, es decir, se amplifican sectores del DNA también al azar y que resultan en la presencia o ausencia de polimorfismos. Los cebadores demasiado cortos pueden ser afectados por las condiciones de hibridación al DNA, en este caso se emplean bajas temperaturas para hibridizar. Los resultados pueden no ser siempre reproducibles. No es apropiada para mapeos comparativos. Solo cuando un par de cebadores se dispone correctamente, es decir, se encuentran bien orientados y lo suficientemente, cercanos los segmentos amplificados pueden ser comparados entre individuos para observar su relación.
Volver al inicio d) AFLP ( AMPLIFIED FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISM ) POLIMORFISMO EN EL LARGO DEL FRAGMENTO AMPLIFICADO.
Se encuentra basada en PCR y no requiere de enzimas de restricción o amplificación por clonación. Esta vez el cebador tiene 15 pb fijos y 2pb al azar. La porción fija entrega estabilidad al cebador y la sección al azar significa que amplificará muchos loci o sitios, los que pueden llegar a 100 con un solo tipo de cebador.
Fig. 18 – 16. Los cebadores se unen a los extremos de los segmentos que se desea amplificar. En distintos alelos los mismos cebadores amplificarán fragmentos de distinto
SECUENCIAS REPETITIVAS EN TANDEM 10 Kb 3Kb 9Kb 6Kb 10Kb 9Kb 6Kb 3Kb Electroforésis de Fragmentos Amplificados CEBADORES
largo o número de repeticiones que caracterizan a cada individuo. Mientras más emparentados, el número de repeticiones será igual
El polimorfismo se detecta como la presencia o ausencia de una banda correspondiente al DNA amplificado. Es útil para “fingerprinting” o tipificación de sospechosos, tipificación de semillas, animales finos o de pedigrí, etc. No es útil para mapeos. Por ejemplo en dos individuos tomados al azar o heterogéneos, no relacionados entre sí, se detectará la amplificación del mismo sitio, pero en uno de ellos el fragmento amplificado por los mismos cebadores es más largo o más corto que en el otro (Fig. 18 –16) y se notará la diferencia durante la visualización de los fragmentos después de una electroforésis con la respectiva sonda marcada contra la secuencia o las distintas secuencias repetitivas.
Volver al inicio e) STS (SEQUENCE TAGGED SITE) O SITIO MARCADO POR LA SECUENCIA. Los cebadores han sido diseñados para amplificar una región determinada que posee un polimorfismo entre dos o más individuos. Los elementos mapeados como clonos
individuales, contigs o regiones secuenciadas en distintos laboratorios y que pertenecen a distintas personas se pueden comparar por STS. Esta técnica
consiste en amplificar una secuencia corta reconocida de 200 a 500pb que no se repite y que sirve como secuencia marcadora de un lugar específico común a todos los genomas humanos, se le emplea como hito marcador o señal en el camino. Se puede formar el mapa sabiendo la posición de las secuencias STS en los segmentos del mismo cromosoma, pero de diferentes personas en estudio.
Mediante PCR se puede detectar esta secuencia única en el genoma. No se requiere de clonación, pero si de información sobre la secuencia. Los cebadores son de 18 a 20 pb y están diseñados para amplificar este fragmento conocido de secuencia corta y única (STS) por RAPD-PCR, al contar con ambos cebadores y en presencia de todas las otras secuencias genómicas distintas, por lo tanto las STS definen una posición dentro del mapa físico o bien se pueden obtener de un clono de RFLP y generar hitos o mojones marcadores que mapean posiciones únicas dentro del genoma. Los polimorfismos se detectan como diferencias de tamaño en productos amplificados.
El anterior es un buen método de mapeo y es confiable, todo depende de la selección de un buen par de cebadores. Con ellos se pretende crear un mapa de 100 kB de
resolución teniendo cerca de 30.000 marcadores STS distintos. Para lograrlo se procede mediante el corte del DNA en pequeños trozos o por segmentos, los que se amplifican por clonamiento fabricando innumerables copias, es decir, se implanta un plásmido cargado con el segmento a amplificar y se hace que se replique en la bacteria. Una vez amplificados, los segmentos se alinean para reflejar el orden que llevan en los
cromosomas al superponer las secuencias marcadoras.
Las STS son útiles para localizar y orientar el mapeo junto a los datos de secuencia reportados por diferentes laboratorios y a la vez sirven de hitos para desarrollar un mapa físico del genoma humano.
f) EST POR EXPRESED SEQUENCE TAG O EXPRESIÓN DE LA SECUENCIA MARCADORA.
Se emplea PCR que no requiere de clonación, pero si se requiere de información de la secuencia. Detecta una zona específica del genoma y es bueno para el mapeo. El polimorfismo se detecta como diferencia de tamaño en el producto amplificado, aunque toma tiempo crear un buen cebador representado por secuencias parciales de DNAc de 18 a 20 pb, como cebadores que proveen de marca específica para un gen.
Volver al inicio
g) MARCADORES MICROSATÉLITES.
Sirven para detectar regiones hipervariables del genoma. Los Microsatélites se
denominan por los nombres de: Simple Sequence Repeats (SSR) o Short Tandem Repeats (STR).
Estas secuencias son cortas de 2 a 5 bases y se repiten múltiples veces flanqueadas por DNA único. Se encuentran bien distribuidas dentro del genoma humano. Es posible encontrar una STR trimérica o tetramérica por cada 20Kb.
Muchos de estos loci o sitios son altamente polimórficos, varían entre individuos ya que tienen secuencias repetidas de distinto tamaño o con distinto número de
repeticiones. Es posible distinguirlas unas de otras mediante la amplificación por medio de cebadores o partidores de la técnica de PCR (previamente diseñados), que se encuentran dirigidos a aparearse, con las regiones constantes o
conservadas que las flanquean. Posterior a la amplificación se pueden visualizar estos sectores mediante una sonda complementaria a la parte repetitiva, después de su separación electroforética.
Este procedimiento es útil en aplicaciones forénsicas y paternidades. Existen varias ventajas cuando se emplea tecnología basada en amplificación de marcadores STR comparados a los RFLP con enzimas de restricción. La amplificación, por su parte requiere de solo un par específico de cebadores para el sitio que flanquea a las secuencias repetitivas.
Fig. 19 -16 Los tres sistemas emplean marcadores que buscan diferencias entre individuos. CEBADORES RFLP VNTR STR 2-4 pb 16-70 pb SITIOS DE RESTRICCIÓN
En la figura 19-16, se observan los distintos sistemas empleados cronológicamente (RFLP, VNTR y STR) para discriminar molecularmente los individuos. El más antiguo (1980, RFLP) emplea sitios de restricción como blancos para la enzima Eco R1. Los fragmentos obtenidos son separados por electroforésis en Agarosa y detectados por Southern Blot empleando una sonda radioactiva. Ambos alelos eran detectables por variaciones en su largo. Estas, eran características heredables que resultaban de la presencia o ausencia del sitio de restricción en un locus determinado.
Luego, las VNTR empleadas desde 1985 en adelante contenían muchos alelos en cada locus individual, que no se debían a la variabilidad del sitio de corte, sino que a la
variabilidad en el número de copias de una secuencia de consenso desde 15 a 70 bases que se encontraba repetida en tandem y a la vez era flanqueada por un par de sitios de restricción.
Posteriormente, se descubrieron repeticiones con polimorfismos en di, tri y
tetranucleótidos llamados STR. Tienen la misma estructura que las VNTR, pero las repeticiones de consenso en tandem son de dos a cuatro bases y son más compatibles con la técnica de PCR, ya que se pueden emplear varios cebadores o partidores (previamente diseñados) para amplificar muchos locus repetitivos a la vez.
En la actualidad con el objeto de reconocer personas y/o tipificar exhaustivamente un DNA, sin importar que se encuentre parcialmente degradado o no, se ha recurrido al empleo de cebadores tipo Múltiplex (Fig. 20 -16). Es decir, estos cebadores tienen más de un par y se encuentran marcados con distintas moléculas fluorescentes y aparean en múltiples regiones que flanquean zonas repetitivas iguales o distintas. Se tiene cuidado en que el diseño de los cebadores o partidores no sea superponible y que se encuentren espaciados. De esta manera, es posible amplificar múltiples alelos del genoma al mismo tiempo y cada uno de ellos posee un color determinado.
La probabilidad de encontrar alelos idénticos en dos individuos disminuye con el aumento de los sitios polimórficos, haciendo el ensayo mucho más específico y discriminatorio.
Una vez hecha la amplificación se separa el DNA por electroforesis capilar, consistente en un capilar relleno con formamida bajo un campo eléctrico. Después de su separación se procede a su lectura con un láser para reconocer los distintos colores
correspondientes a aquellos cebadores apareados y que han amplificado múltiples locus. La lectura de las bandas es transformada en peaks de distintos colores correspondientes a la fluorescencias de las sondas que han amplificado un locus determinado
De esta manera cada persona distinta tendrá un número de peaks determinados y puede ser reconocida entre otras. Mientras mayor sea el número de locus amplificados mayor será la certidumbre.
Esta técnica se emplea para comparar sospechosos frente a la evidencia, test de paternidad, reconocimientos históricos, investigación de personas desaparecidas, identificación de victimas de desastres, identificación de soldados y de delincuentes. Empleando 13 sitios de secuencias STR multilocus, es posible encontrar una serie de peaks repetidos de 1 en 594 trillones.
Fig. 20 – 16. Región multilocus amplificada por una mezcla de varios cebadores fluorescentes de tres colores distintos. Si la persona es homozigoto para una región el peak es más largo y si es heterozigoto el peak es más pequeño.
3) APLICACIONES EN LA MEDICINA MOLECULAR
Una de las metas de la Medicina Molecular es predecir las enfermedades antes de que los signos y síntomas se manifiesten en el individuo. Por ambicioso que esto parezca, se pretende alcanzar tal capacidad en un futuro cercano, mediante diversas técnicas. De esta manera, es imperante explorar y analizar las unidades de información que se encuentran inmersas en el material hereditario conocido como DNA y que se identifica por el nombre de gen, junto a los factores que influyen tanto en su control como en su expresión. Al caracterizar el tipo de anomalías que pueda afectar a los genes, se espera poder predecir la susceptibilidad de las personas a este tipo de enfermedades y a la vez encontrar la forma de evitarlas y en el caso de que estas ocurran, cómo curarlas.
Este último desarrollo de la Medicina, comenzó con la revolución tecnológica que ocurrió alrededor de la década del 70, cuando se aplicaron nuevos diseños experimentales que más tarde permitieron seleccionar, identificar y amplificar los genes humanos. Desde entonces hasta el año el año 2000 se han descubierto cerca de 4000 enfermedades, cuyo origen es atribuido al mal funcionamiento de uno o varios genes, como son por ejemplo los casos de Hipercolesterolemia familiar, Fibrosis Cística, Fenil Cetonurea y distintos tipos de Hiperamonemias junto a algunos tipos de cáncer, como son el de Colon o el de Mamas.
Es también necesario considerar que a medida que progresan las técnicas y se hacen más comunes, las consideraciones éticas y morales junto a la legislación deben marchar a la par. De esta manera los resultados adversos obtenidos mediante la examinación de un paciente, deberán ser tan solo del dominio del equipo de profesionales tratante de la enfermedad y nunca entregados a los pacientes, sin el debido tacto y menos aún a las instituciones públicas o privadas. En general una persona joven, que tiene toda una vida por delante, se reciente y puede sufrir daño psicológico, al saber que debe enfrentar enfermedades para las cuales no se encontraba preparada, en vez de dejar estas al azar y al estilo de vida. Este es un tema que puede generar un intenso debate en el futuro cercano.
Regiones multilocus con 3 secuencias repetitivas de distinto tamaño
Escalera alélica: Regiones de múltiples peaks correspondiente a los distintos alelos existentes en la población y que se emplea como estándar
Alelos de una persona común
Para comprender los alcances de esta nueva medicina debemos comenzar por estudiar las unidades de la herencia o las subunidades del DNA. Estas comprenden aquellas estructuras que almacenan la información útil para generar un individuo. Bastan cerca de 30.000 genes para definir un ser humano. En ellos reside la estructura de las proteínas junto al conocimiento implícito para sus interacciones tridimensionales en su
microambiente hasta el comportamiento de un organismo entero. Sin embargo, los genes forman tan solo una pequeña parte de los cromosomas que tienen una mayor parte de DNA no codificante o de “relleno”.
Los cromosomas humanos se encuentran divididos en dos juegos de 22 autosomas más un cromosoma sexual, que puede ser X o Y (Fig. 21-16). Cada una de las células de un organismo son totipotenciales es decir, tienen la información para generar un individuo completo. Este hecho se conocía hace ya algún tiempo, desde que se logró clonar ranas a partir de núcleos de células extraídas del intestino de una rana adulta, hasta la
aparición de la famosa oveja “Dolly”. Esta última fue clonada a partir del núcleo de una célula de la glándula mamaria. Esto significa que todas las células de nuestro organismo poseen la misma información, pero los genes que se expresan son diferentes. Cada tejido es caracterizado por la expresión particular de sus genes, lo que ocurre durante un proceso denominado diferenciación celular y que acontece durante la Embriogénesis.
Por lo tanto dependiendo del balance en la expresión de las células totipotenciales algunos genes se prenden y otros se apagan, sin embargo el potencial genético para convertir un hepatocito en neurona, aún se encuentra presente en el tejido diferenciado, pero se lo encuentra silencioso.
Fig. 21 - 16. Cromosomas humanos ordenados por tamaño mostrando sus bandeos.
enzimáticas y síntesis de estructuras llevando a cabo las labores básicas, mientras que los genes inducibles se encuentran inactivos la mayoría del tiempo y solo se expresan para reacomodar el metabolismo o la estructura de la célula bajo determinadas
circunstancias. Hay que considerar que dentro de estos genes, un subgrupo fue inducido durante la embriogénesis y mantiene a la célula diferenciada en lo que ya és, sea esta una neurona, hepatocito, miocito, etc. y una vez logrado este propósito permanecen silenciosos.
Volver al inicio a) MUTACIONES
La compleja interacción entre los genes determina el funcionamiento de nuestro
metabolismo y sus defensas, sin embargo las mutaciones que se adquieren durante el curso de la vida pueden llegar a ser heredadas (Fig. 22 - 16) o “congénitas”, pasando por la línea germinal. Por otro lado también pueden ser somáticas (Fig. 23 - 16) o adquiridas, cuando en el transcurso de la vida solo pasan de célula en célula y no a los descendientes (efecto de la luz UV, tóxicos ambientales, etc.). Las primeras pueden afectarnos o predisponernos a enfermedades que van desde insignificantes, es decir, algo así como la intolerancia a ciertas dietas, hasta la inhabilitación total de la persona, como es el caso de las enfermedades congénitas del metabolismo (Hiperamonemias, Fenilcetonurea, etc.). Por otro lado, entre las mutaciones somáticas, podemos contar con la predisposición al cáncer provocado por el tabaquismo o a los melanomas provocados por el exceso de exposición a la luz solar.
Oocito Espermio Mutación + Hueso Pancreas Neurona
Fig. 22 - 16. Mutaciones en la línea germinal pueden ser heredadas.
Dentro de este último punto, ocurre que algunas personas pueden ser más susceptibles que otras a las enfermedades adquiridas, resaltando lo complejo que es su control y que parece depender de la expresión de varios genes a la vez.
Podemos citar que si una función determinada depende de los genes A, B, C y D, esta se lleva a cabo en un 100%, sin embargo, si la misma función se puede llevar a cabo en un 80% con tan solo A, B y C, debido a que D se encuentra mutado. Esta persona será más propensa a sufrir una enfermedad determinada por falta del control aportado por D. Aunque no es seguro de que así sea, no se tiene la certeza exacta de que se producirá una falla, pero es lo más probable.
Mutación
Células mutadas Células normales
Fig. 23 - 16. Mutaciones somáticas solo pasan de célula en célula y no son heredadas.
En los humanos los genes se encuentran en pares y una copia pertenece a cada padre. Cada una de estas copias recibe el nombre de alelo, los cuales pueden ser del tipo dominante o recesivo (Fig. 24a - 16). El alelo dominante (D) en las enfermedades autosómicas, se expresa y prevalece independientemente de sí su contrapartida es dominante (DD) o recesiva (Dd), mientras que el recesivo (d) se expresa si su
contrapartida es también recesiva (dd). En el caso de que una persona posea un gen recesivo con la enfermedad y otro dominante normal, prevalece el normal, siempre que este último no sea desactivado o se pierda. Sin embargo, la persona heterozigota para el gen recesivo es portadora de la enfermedad y tiene un 25% de probabilidad de pasar el gen alterado a cada individuo de su descendencia. Si ahora ambos padres son portadores, la probabilidad de producir descendencia portadora en cada embarazo es de 50% (Fig. 24a - 16). Estas probabilidades se hacen posibles, en especial en aquellos grupos étnicos cerrados, con poco intercambio genético con la población mundial.
Por otro lado, es necesario aclarar que no todos los alelos mutados pueden conducir a una enfermedad. El cáncer de mamas, cuyo responsable es un gen dominante y no el recesivo, tiene solo un 80% de riesgo y no de 100% a edades superiores a 65 años, ya que intervienen otros genes que se encuentran coludidos con el alelo mutado y de estos últimos dependerá en parte, que el mal aparezca o no. Este hecho indica que para hacer posible un cáncer, deben existir distintas mutaciones simultáneas o bien que estas sean del tipo acumulativo y que ocurran durante todo el transcurso de la vida. Por
lípidos y cuando sus niveles se encuentren alterados, constituiría la señal marcadora de la enfermedad.
Fig. 24a - 16. La persona homozigota que porta los alelos recesivos (dd) tiene un 100% de probabilidad de padecer la enfermedad.
Fig. 24b - 16. Mutaciones en distintas partes del mismo gen producen diferentes síntomas. Por otra parte, ocurre de que las mutaciones pueden caer en distintos segmentos de un mismo gen (Fig. 24b - 16), produciendo manifestaciones clínicas que van desde el rango de severas a leves e incluso silenciosas, como es el caso de la Fibrosis Cística.
En otros casos los genes mutados se pueden heredar, ya que se transportan en células reproductivas, por lo que la mutación estará presente en todos los tejidos del individuo producto de estos genes.
Así tenemos que los desórdenes hereditarios pueden ser también causados por un alelo mutante o un solo gen, como es la distrofia muscular de Duchenne, el Retinoblastoma o la Anemia falsiforme, comparados con otros desordenes que son poligénicos, es decir ocurre que más de un gen o alelo se encuentra involucrado. Se necesita aquí de la interacción de varios genes para causar la enfermedad. Entre ellas tenemos las enfermedades al corazón, diabetes y algunos tipos de cánceres.
Volver al inicio D d D d D D D d D d d d D d G e n o A le lo D o m in a n te G e n o A le lo R e c e s iv o Am b o s p a d re s p o rta d o re s H o m b re M u je r H o m b re M u je r N o rm a l P o rta d o ra P o rta d o r E n fe rm a 2 5 % 5 0 % 2 5 % H o m b re M u je r G e n d e la F ib ro s is C ís tic a N o rm a l M u ta c ió n 1 M u ta c ió n 2 M u ta c ió n 3 S in s ín to m a s S ín to m a s le v e s S ín to m a s s e v e ro s S ín to m a s d e c a rá c te r in te rm e d io b ) a )
b) CARIOTIPO
Un primer avance en la búsqueda del origen de las enfermedades genéticas, lo constituyó la obtención del Cariotipo. Mediante esta técnica se puede visualizar a los cromosomas y sus características presentes en una muestra de sangre extraída a una determinada persona. Luego se procede a sincronizar la división celular y posteriormente se observa la disposición de los cromosomas en metafase. Se determina así el número de ellos, la composición de los cromosomas sexuales y se identifica cualquiera anomalía que se presente en cuanto a su forma, ya que les puede faltar o sobrar un segmento, lo cual nos entrega una idea de la cantidad de DNA que portan. El Cariotipo nos permitirá también determinar cual es el sexo real de una persona, así como los problemas de infertilidad que puedan existir.
Metacéntrico Submetacéntrico Acrocéntrico BANDEO DE UN CROMOSOMA
p
q
TELOMEROS CENTROMEROFig. 25 - 16. Tipos de cromosomas que se encuentran en un Kariotipo
Los cromosomas pueden ser distinguidos por su tamaño y por la posición del centrómero, que puede llegar a ser Metacéntrico (Fig. 25 - 16), cuando se ubica equidistante a ambos extremos del cromosoma. Submetacentricos, cuando el centrómero se encuentra fuera del centro, ya que un par de brazos del cromosoma es mayor que el otro p (brazo corto) y q ( brazo largo) y finalmente Acrocéntrico, cuando el centrómero se encuentra en un solo extremo.
Otro tipo de identificación que se puede llevar a cabo sobre los cromosomas lo constituye su bandeo. Este aparece bajo ciertos tratamientos químicos que dependen de la
composición de las bases y la estructura de la cromatina. Así tenemos, que el bandeo C tiñe Centrómeros, luego el bandeo R es el inverso del C y tiñe regiones no
centroméricas como los brazos p y q. A continuación tenemos el bandeo G, que se obtiene con la tinción de Giemsa, produciendo bandas a lo largo de su estructura y por último el bandeo Q que se obtiene con Quinacrina y produce fluorescencia. Los dos últimos bandeos G y Q son suficientes para permitir la identificación de cada cromosoma y proceder a su arreglo por tamaño y número de bandas para observar el Cariotipo.
c) EL PROYECTO GENOMA HUMANO
El Proyecto Genoma Humano (HGP) auspiciado por Europa y Estados Unidos partió en octubre de 1990 y pretendió secuenciar todo el DNA de la especie humana incluyendo los 80.000 a 100.000 genes supuestos genes , que resultaron ser solo 30.000 y que constituyen el patrimonio humano, más el DNA “de relleno” en un periodo de 13 años. Es decir, se reconoció la secuencia de aproximadamente 3 x 109 bases que forman el material genético humano y se trabaja en la actualidad dilucidando todos los mecanismos de control posibles. Otros desarrollos consistirán en el análisis de los productos proteicos de los genes y la observación de cromosomas teñidos con sondas fluorescentes en lugares específicos donde se encuentren las posibles anomalías. A la vez se llevaron a cabo estudios paralelos en otros organismos como Drosophylas, Levaduras y E. Coli, para desarrollar la tecnología e interpretar la función de los genes en humanos. Las tareas fundamentales se desarrollaron a través de varios métodos independientes de análisis que garantizaron su validez. A continuación se ilustran algunos de los métodos empleados:
Volver al inicio d) MAPEO DE LOS GENES
Consiste en emplear una técnica que permita determinar el orden de estos y de otros marcadores (secuencias específicas que no son genes), junto al espacio que ocupan en cada cromosoma y a la vez determinar la distancia que exista entre ellos. Así se pudo identificar ciertos genes asociados a determinadas enfermedades y las propiedades biológicas de las cuales son responsables, constituyendo la columna vertebral del mapeo físico. De esta manera se pretende mostrar el arreglo de los genes y los marcadores de secuencia del DNA. Estos mapas se construyeron en varias escalas y niveles de
resolución.
X Y
PRESENCIA DE AM BOS ALELOS EN EL PADRE Y LA M ADRE HIJOS X X Y Y M ARCADORE S EN EL PADRE Crossing-over o recom binación X Y Fig. 26 - 16. El material genético del padre sé recombinó durante el proceso de espermatogénesis. La frecuencia de estos eventos de crossing-over ayudan a determinar la distancia entre los
marcadores
e) MAPEO LIGADO A MARCADORES
El Mapeo ligado a marcadores se encuentra constituido por los mapas de menor resolución y dependen de regiones expresadas del DNA (genes), como secuencias que no se expresan, pero cuya pauta de herencia (secuencia específica) puede ser reconocida y seguida (Ver marcadores moleculares en Herramientas) en los
descendientes.
Los genes se pueden analizar por sus características fenotípicas, como X e Y en la figura 26 - 16 o bien pueden ser reconocidos por sus características polimórficas, es decir las formas alternativas de un alelo o bien la presencia de distintos alelos entre los diferentes individuos de una familia, como ocurre con el color de los ojos, el pelo, la estatura. En cambio entre las secuencias que no se expresan y que pueden ser seguidas, encontramos a los polimorfismos representados por secuencias repetitivas en su DNA que pueden variar en tamaño y número de repeticiones en los distintos individuos. En el mapeo ligado a marcadores se emplean las frecuencias con que se expresan los marcadores o las características ligadas a los genes que aparecen en los descendientes para asignar las ubicaciones en el cromosoma. Este reconocimiento se lleva a cabo después de la gametogénesis cuando han pasado por la recombinación o “crossing-over”. Es así posible construir un mapa observando cuan frecuentemente dos marcadores o genes se heredan juntos o cuan frecuentemente dos marcadores o genes pasan desde los padres hacia los hijos. Mientras más juntos en el cromosoma, es menos posible que se separen y mientras más lejos es más posible que se hereden separados y aparezcan en distintos hermanos y no en uno solo de ellos.
De esta forma es posible asignar un par de genes o marcadores a un área específica del cromosoma, donde las distancias se miden en términos de Centimorgans (cM), en honor a un genetista de ese apellido. Dos marcadores se encuentran separados por 1cM cuando aparecen separados por recombinación, tan solo el 1% de todas las veces (el 99% salen juntos) y esto equivale en un mapa físico a la distancia de 1 millón de pares de bases entre los dos marcadores.
Por otro lado, dentro de los marcadores determinados por la secuencia cuya pauta puede ser seguida se encuentran ciertas secuencias con simetría bicatenaria que constituyen polimorfismos. Esto significa que la misma secuencia se ubica en distintos lugares en diferentes individuos y son reconocidas por ciertas enzimas denominadas
Endonucleasas de Restricción (Ver herramientas).
Cada una de estas enzimas es capaz de reconocer una secuencia específica, pero como esta se ubica en distintas posiciones en los distintos individuos, tanto en el DNA “de relleno” como en los genes que son de interés. Al ser cortadas generan una población de fragmentos de distinto largo o polimorfismos típicos de cada individuo. Cada
endonucleasa actúa produciendo un patrón típico de cortes para cada individuo. Estos fragmentos se pueden emplear para reconocer sectores específicos del DNA tanto en los mapas físicos como en aquellos mapas de entrecruzamiento o recombinación y la técnica derivada de esta análisis se denomina RFLP.
