PROCEDIMIENTOS CON ANIMALES

Todos los procedimientos con animales y su estabulación se llevaron a cabo en el estabulario de la Facultad de Farmacia de la Universitat de Barcelona. Los ratones se estabularon en habitaciones con ciclos de luz / oscuridad de 12 horas, en un ambiente controlado de temperatura (22 ± 2ºC) y humedad (60%) con libre acceso a agua y comida. El número de ratones usado para cada condición experimental fue de 6 a 8, salvo indicado. Todos

Universitat de Barcelona.

3.1. ANIMALES

Los animales empleados en esta tesis fueron ratones adultos, de entre 2 y 3 meses de edad con un peso de 25-30 g de la cepa salvaje C57/BL6J y ratones deficientes de CPT1C con el mismo fondo genético que los ratones salvajes. Los ratones deficientes de CPT1C (CPT1C KO) fueron generados en colaboración con el CEBATEG (Centre de Biotecnologia Animal i de Teràpia Gènica) de la Universitat Autònoma de Barcelona, mediante una mutación génica introducida por recombinación homóloga. Los exones del 12 al 15 fueron eliminados, perturbando el marco abierto de lectura de la proteína CPT1C desencadenando en una proteína truncada. El vector fue electroporado en células madre embrionarias (ESC, Embryonic Stem Cells) 129SvEv y el par de clones de ESC positivos obtenidos fueron expandidos. Posteriormente fueron microinyectados en blastocitos de ratones C57/BL6, los cuales fueron transferidos a hembras aceptoras. Los ratones obtenidos mediante este procedimiento se denominaron quimeras ya que se generaron a partir de células 129/SV y embriones C57/BL6. Los ratones quiméricos con capacidad de transmisión de la línea germinal fueron seleccionados para obtener ratones heterocigotos. Éstos fueron cruzados entre sí para generar ratones homocigotos deficientes de CPT1C.

3.2. DISEÑOS EXPERIMENTALES 3.2.1. AYUNO

Para los experimentos en los que los animales fueron ayunados, en todos los casos la comida se retiró al inicio del ciclo claro, es decir, a las 9 h de la mañana. Después del tiempo de ayuno correspondiente, los animales o bien se sacrificaron o bien se tomaron medidas oportunas antes de reponer de nuevo la comida. En este trabajo se han aplicado tres tipos de ayuno distinto, indicados en cada caso en el capítulo de resultados.

1. Ayuno a corto plazo: Privación de alimento durante 6 horas. Aplicado para la cuantificación de glucógeno, ya que las reservas de éste se agotan muy rápidamente. 2. Ayuno de 24 horas: Aplicado en la mayoría de experimentos de privación de alimento. 3. Ayuno a largo plazo: Privación de alimento durante 48 horas. Aplicado puntualmente

El torpor se caracteriza por una gran disminución de la actividad fisiológica de un animal, evidenciado generalmente por una disminución en la temperatura corporal y la tasa metabólica que puede durar días o semanas, o puede hacer referencia a un período de baja temperatura corporal y del metabolismo que dura menos de 24 horas, como es el caso del "torpor diario". Para inducir el estado de torpor a nuestros animales, éstos fueron sometidos a dos procedimientos distintos:

1. Mantenimiento de todo el grupo de animales a 16ºC de temperatura ambiental, dividido en dos subgrupos, alimentados y ayunados, durante 32 horas.

2. Mantenimiento de un grupo de ratones durante 2 horas a 4ºC, mientras el resto son mantenidos a temperatura ambiente.

3.2.3. ENVEJECIMIENTO

El estudio del envejecimiento se llevó a cabo mediante la monitorización mensual del peso y la ingesta de los animales, desde los 2 meses de edad hasta los 12 meses. Durante este período de tiempo se realizaron pruebas de la homeostasis de la glucosa. A los 15 meses de edad se realizó una prueba de memoria juntamente con un grupo de ratones jóvenes. Finalmente a los 16 meses de edad fueron sacrificados. Un subgrupo de animales fue perfundido por tal de fijar los tejidos para un análisis histológico posterior (apartado 3.8.), el resto fue diseccionado como se detalla en el apartado 3.7. de este capítulo.

3.3. DETERMINACIÓN DEL PESO Y LA INGESTA

El peso corporal de los ratones se determinó pesando los animales en los períodos de tiempos indicados en cada caso. El incremento de peso fue calculado como la diferencia entre el peso medido en los intervalos de tiempo descritos.

La ingesta fue medida mediante el peso en una balanza de precisión del pienso antes de ser administrado a los ratones y después del tiempo indicado. Los animales sometidos a ingesta controlada fueron estabulados en jaulas individuales.

3.4. DETERMINACIÓN DE LA TEMPERATURA CORPORAL

La temperatura corporal de los ratones fue medida mediante una sonda rectal específica para roedores pequeños (RET-3-ISO Physitemp) acoplada a un termómetro (Acorn®

la sonda es crítica para la reproducibilidad de los registros de la temperatura. Los animales fueron estabulados en grupos de tres en la misma jaula en los experimentos en los que se midió la temperatura.

3.5. DETERMINACIÓN DE LA GLUCEMIA

La determinación de los niveles de glucosa en sangre fue medida tanto a nivel basal como después de períodos de ayuno a las 9 h de la mañana. Después de realizar un pequeño corte en la cola de los animales, la primera gota de sangre es descartada y la segunda es recogida en tiras reactivas de glucosa (Contour®Next Bayer) utilizando un glucómetro para su lectura.

3.6. TEST DE TOLERANCIA AL PIRUVATO, A LA GLUCOSA Y A LA INSULINA

El test de tolerancia al piruvato se realizó en ratones ayunados durante 16 horas. Una dosis de 2g/kg de piruvato sódico en PBS (preparado el mismo día y filtrado) fue administrada a los ratones mediante una inyección intraperitoneal (ip). La medida de la glucemia se realizó antes de la inyección y a los 30, 60, 90 minutos tras la inyección.

El test de tolerancia a la glucosa se realizó en ratones ayunados durante 6 horas. Se practicó una inyección ip de glucosa 20% en PBS, teniendo en cuenta el peso de cada ratón y la dosis a administrar (2 g/kg) se ajustó el volumen administrado (multiplicando por 10 el peso del ratón en gramos). La glucemia se midió justo antes de la inyección y a los 30, 60 y 120 minutos tras la inyección.

Para el test de tolerancia a la insulina, los ratones se ayunaron durante 4 horas. La solución de insulina se preparó a 0,1 U/mL (añadir 16,6 µL de insulina 10mg/mL a 40 mL de PBS). La dosis administrada fue de 0,75 U/Kg, por lo que el volumen de administración se ajustó en función del peso de los animales (multiplicando el peso en gramos del ratón por 7,5). La medida de la glucemia se realizó antes de la inyección y a los 30, 60 y 120 minutos tras la inyección.

En todos los casos, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Rápidamente se diseccionaron los siguientes tejidos: hígado (lóbulo medial derecho), músculo gastrocnemio, tejido adiposo blanco epididimal e inguinal, tejido adiposo marrón interescapular, hipotálamo y MBH. Para la disección del MBH se usó una matriz de acero inoxidable que permite hacer cortes coronales de 0,5 mm de grosor (SA-2165 Roboz Surgical Instrument) mediante el uso de dos cuchillas. Posteriormente en la sección coronal obtenida se realiza una micropunción con un micro-colector de tejido de 1 mm de diámetro para la obtención del MBH (figura 37).

Figura 37. Representación esquemática de la disección del hipotálamo mediobasal. A) Visión ventral

de cerebro de ratón. La sección marcada por el cuadro negro es el hipotálamo. Las líneas rojas indican el corte coronal realizado con la ayuda de una matriz. B) Representación de un corte coronal a la altura del MBH. La sección marcada con el círculo rojo es el MBH (Imagen adaptada del atlas anatómico de cerebro de ratón Paxinos Atlas).

3.8. PERFUSIÓN INTRACARDÍACA FIJATIVA

El objetivo de la fijación es preservar rápida y uniformemente el tejido de una forma similar al estado in vivo. Si bien la colocación de tejidos en soluciones fijadoras es un método correcto para la fijación de secciones pequeñas, la fijación por inmersión plantea un problema para las muestras más grandes. La ventaja de la perfusión transcardial con fijadores basados en aldehído se considera un paradigma eficaz para la preservación de los tejidos que se autolisan rápidamente, como el tejido nervioso o el tejido endocrino, ya que puede llegar rápidamente a todos los rincones del organismo utilizando la red vascular natural (figura 38). Por lo tanto, este método es óptimo para estudios anatómicos, histológicos y moleculares. La descripción de este método se detalla a continuación. Todo el procedimiento se llevó a cabo siguiendo las medidas de seguridad oportunas debido a sus propiedades nocivas.

1. Anestesiar el animal mediante la administración i.p. de la mezcla de ketamina/Xilacina (Ket: 100mg/kg, Xil: 10 mg/Kg)

2. Hacer una incisión en la piel en la línea media de la entrada torácica hasta la pelvis. Usar las tijeras para abrir cuidadosamente el abdomen.

3. Hacer una incisión lateral de 5-6 cm a través del tegumento y la pared abdominal justo debajo de la caja torácica. Separar con cuidado el hígado a partir del diafragma.

4. Hacer una pequeña incisión en el diafragma. Continuar la incisión del diafragma a lo largo de toda la longitud de la caja torácica para exponer la cavidad pleural.

5. Desplazando cuidadosamente los pulmones, hacer un corte a través de la caja torácica hasta la clavícula. Hacer un corte similar en el lado contralateral.

6. Levantar el esternón y recortar cuidadosamente cualquier tejido que conecte al corazón.

7. Sujetar el corazón suavemente e identificar las aurículas y los ventrículos. Introducir la aguja mariposa por la esquina inferior del ventrículo izquierdo (más grueso y de color más claro que el derecho) y abrir con la tijera la aurícula derecha.

8. Colocar la aguja mariposa en dirección a la aorta y mantener en esa posición.

9. Iniciar el flujo de PBS 1x hasta que se haya desplazado toda la sangre del animal y salga un líquido casi transparente (aprox. 30 mL)

10. Cambiar la jeringa y reponer una jeringa con 4% PFA. Continuar el flujo hasta pasar 60 mL. Las contracciones musculares y el blanqueo del hígado son signos de buena perfusión. La perfusión se ha completado cuando todas las contracciones musculares se han detenido y la cantidad deseada de fijativo se ha pasado a través del sistema circulatorio. El ratón debe estar rígido.