PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA AEROBIOS Y ANAEROBIOS FACULTATIVOS

1. PRUEBA DE LA OXIDASA

La oxidasa o citocromooxidasa es una enzima del grupo de las ferroporfirinas. Se encuentra presente en bacterias que realizan respiración aerobia y que poseen

citocromo c en la cadena de transporte de electrones. Interviene en las

reacciones:

1) citocromo c reducido + oxidasa activa citocromo c oxidado + oxidasa inactivared

2) oxidasa reducida + O2 oxidasa oxidada + H2O

En pruebas in vitro, la oxidasa presente en los microorganismos se evidencia porque en presencia de O2, puede transferir los electrones que tomó del citocromo c a sustancias orgánicas como alfa-naftol y dimetil p-fenilendiamina, produciendo por ej. el compuesto azul de indofenol.

Existen distintos métodos para demostrar la presencia de esta enzima. a. Técnica en medio líquido (Gaby y Hadley)

-Cultivos frescos de 18-24 h en caldo nutritivo a 37°C -Reactivos:

a) alfa-naftol al 1% en alcohol de 95°

b) oxalato de p-aminodimetilamina 1% en agua destilada

Esta última solución debe ser preparada en el momento. A baja temperatura y en la oscuridad puede mantenerse dos semanas. Procedimiento:

Tomar 2,5 ml del cultivo y adicionar 0,3 ml de solución b) y 0,2 ml de solución a). Agitar y esperar entre 20 a 60 seg para que desarrolle ligero color azul que se intensifica rápidamente.

b. Prueba sobre papel de filtro Cultivo de 18-24 h en agar nutritivo.

Colocar 2 gotas de cada uno de los reactivos sobre papel de filtro.

En el centro de la zona impregnada se esparce una gruesa porción del cultivo sobre una superficie de no más de 5 mm de diámetro por medio de un ansa de platino (preferentemente nueva), o varilla de vidrio, plástico o madera para evitar falsos positivos, provenientes del metal reducido. La zona vira al azul al cabo de 5- 10 seg.

c. Prueba en "discos de oxidasa"

Discos embebidos en solución b) para la detección de la enzima oxidasa en microorganismos de los géneros Pseudomonas, Vibrio, Neisseria, Aeromonas.

Técnica: en un tubo de hemólisis se prepara una suspensión densa del microorganismo en estudio (cultivo de 18-24 h) en 0,2 ml de agua destilada. Se coloca un disco de oxidasa.

REACCION POSITIVA: en 30 seg desarrollará color rosado que se intensificará hasta fucsia.

REACCION NEGATIVA: 2 ó más minutos sin desarrollar color.

Comparar con testigos positivo y negativo como P. aeruginosa y E.coli, respectivamente.

2. PRUEBA DE HEMOLISIS

Fundamento: algunos microorganismos como los estafilococos, estreptococos, neumococos, etc., producen ciertas exoenzimas llamadas hemolisinas capaces de hemolizar glóbulos rojos, ya sean humanos o de otros mamíferos, por ej.: carnero, conejo, etc.

Interpretación:

Estas hemolisinas no actúan de la misma forma, así la hemólisis se ha clasificado en:

-alfa hemólisis, cuando hay hemólisis parcial y los productos de la hemólisis son de color verde, viéndose alrededor de la colonia un halo de hemólisis de color verde.

-beta hemólisis, en este caso hay hemólisis total y alrededor de la colonia se observa un halo transparente.

-gamma hemólisis, cuando no se observa hemólisis ni en la superficie ni en la profundidad, ejemplo típico: Enterococcus faecalis.

Medio: agar sangre

3. ACTIVIDAD AMILOLITICA (alfa amilasa)

Medio: agar almidón

Peptona...5 g Extracto de carne ...3 g Almidón soluble...2 g Agar...15 g A.D. c.s.p... 1000 ml pH = 7-7.2 Material necesario

- 1 tubo de agar almidón - 1 caja de Petri estéril

- un cultivo joven de Bacillus subtilis - un cultivo joven de Escherichia coli

Guía de Trabajos Prácticos. Microbiología e Inmunología - Parte A Técnica

-Fundir a B.M. hirviente un tubo de agar almidón, dejar enfriar a 45-50°C y volcar sobre la caja de Petri estéril.

-Dejar solidificar. Sembrar por picadura con ansa recta. - Incubar durante 18-24 h.

-Cubrir la placa con solución iodo-iodurada y observar. Fundamento e interpretación

Algunos microorganismos producen ciertas enzimas -carbohidrasas- que hidrolizan los polisacáridos (por ej. almidón a monosacáridos o azúcares más simples.

-POSITIVO: presencia de halo claro alrededor de la colonia revela actividad amilolítica.

-NEGATIVO: ausencia de dicho halo.

4. ACTIVIDAD PROTEOLITICA (proteasa)

Medio: agar leche

Peptona...5 g Extracto de carne ...3 g Leche en polvo...100 g Agar...15 g A.D. c.s.p... 1000 ml pH = 7-7.2 Material necesario

-un tubo de agar leche -una placa de Petri estéril

-un cultivo joven de Serratia marsescens -un cultivo joven de Escherichia coli Técnica

Fundir a B.M. hirviente un tubo de agar leche. Dejar enfriar a 45-50°C y volcar sobre una caja de Petri estéril. Dejar solidificar. Secar y sembrar por picadura. Usar ansa recta. Incubar 24-48 h. Observar.

Fundamento e interpretación

Algunos microorganismos producen proteasas que hidrolizan las proteínas a péptidos y aminoácidos.

-POSITIVO: presencia de halo claro alrededor de la colonia indica actividad proteolítica.

5. ACTIVIDAD LIPOLITICA Medio: agar-tributirín Peptona...5 g Extracto de carne ...3 g Tributirín...10 g Agar...15 g A.D. c.s.p... 1000 ml pH = 7-7.2

El tributirín es adicionado a los ingredientes luego de disolverlos y calentar a 90°C, se debe agitar bien para emulsionarlos. El tributirín puede ser reemplazado por manteca en una proporción 3 veces mayor.

Material necesario

-un tubo de agar tributirín -una placa de Petri estéril

-un cultivo joven de Staphylococcus aureus -un cultivo joven de Escherichia coli

Técnica

Fundir a B.M. hirviente un tubo de agar tributirín. Enfriar a 45-50°C y volcar sobre caja de Petri. Dejar solidificar. Secar y sembrar por picadura con ansa recta. Incubar durante 72 h y observar.

Fundamento e interpretación

Ciertos microorganismos producen enzimas -lipasas- que hidrolizan los lípidos (grasas) a glicerol y ácidos grasos.

-POSITIVO: aparición de una zona de opacidad debajo de la colonia debido a la precipitación de los ácidos grasos como sales cálcicas.

-NEGATIVO: no se observa zona de opacidad.