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Neospora caninum isolates of different virulence

The aim of this objective was to determine the bovine macrophage response to N. caninum infection at the molecular level, and the influence of the isolate in cell modulation. The transcriptional profile of bovine monocyte-derived macrophages infected with Nc-Spain7 and Nc-Spain1H was investigated. Additionally, we studied the parasite transcriptome to reveal the molecular basis of macrophage modulation by N. caninum.

Sub-objective 2.1: Gene expression profiling of bovine macrophages infected with high and

low virulence Neospora caninum isolates.

In this sub-objective, the transcriptome profile of bovine monocyte-derived macrophages infected with Nc-Spain7 and Nc-Spain1H isolates was investigated to reveal the main processes involved in parasite recognition and subsequent response by the macrophages against N. caninum infection. Those processes related to parasite manipulation of the host cell environment were further investigated by means of the comparison of macrophage responses infected with both isolates. The results from this study will show how N. caninum impacts on the host signaling pathways to escape cellular defenses, and the molecular basis implicated in the differences in host cell modulation between high and low virulence isolates.

Sub-objective 2.2: Gene expression profiling of high and low virulence Neospora caninum

isolates in bovine macrophages.

In this sub-objective, the transcriptome profile of Nc-Spain7 and Nc-Spain1H was studied with the aim of investigating the parasite gene profile in bovine macrophages, correlating the different gene expression between isolates with the differences observed in their behavior, and determining potential parasite effectors implicated in the host-cell modulation. The results of this study will help identify potential parasite factors associated to virulence and thus, to disease traits, such as abortion and transmission.

La infección por Neospora caninum, parásito apicomplejo intracelular obligado, se considera una de las principales causas de aborto en el ganado bovino a nivel mundial. La respuesta inmunitaria innata es clave en la patogenia de la neosporosis bovina. Los macrófagos constituyen la primera línea de defensa frente a infecciones intracelulares y juegan un papel importante en el inicio de la respuesta inmunitaria innata e influyendo posteriormente en la respuesta adaptativa. Por ello, la interacción entre N. caninum y el macrófago puede ser determinante en el desarrollo de la infección. Hasta la fecha, la mayoría de estudios han utilizado macrófagos humanos o de ratón, pero estas especies no son hospedadores naturales para N. caninum.

En el presente estudio se utilizó un modelo de infección de macrófago bovino por N. caninum con el objetivo de determinar los mecanismos utilizados por el parásito para modular dichas células durante la fase temprana de la infección. Además, se estudió por primera vez la interacción entre macrófagos bovinos y dos aislados de distinta virulencia para identificar mecanismos de modulación específicos de cada aislado que pudieran explicar sus diferencias en patogenia observadas in vivo. Se estudió la habilidad de N. caninum para invadir activamente el macrófago, sobrevivir y proliferar en su interior. Asimismo se determinó la respuesta inmunitaria celular a la infección mediante el análisis de la producción de especies reactivas de oxígeno, expresión de citoquinas, inducción de la producción de IFN-γ por linfocitos en co-cultivo y cambios en la expresión de marcadores de superficie en el macrófago infectado. Finalmente se investigó la capacidad del parásito de inducir un fenotipo hipermigratorio en la célula hospedadora. Además se comparó la respuesta celular y los parámetros asociados al ciclo lítico del parásito entre el aislado de alta virulencia de N. caninum (Nc-Spain7) y el de baja virulencia (Nc-Spain1H). Ambos aislados fueron capaces de invadir activamente el macrófago y completar en él su ciclo lítico, escapando de la degradación por los lisosomas y disminuyendo la concentración de ROS intracelulares. Sin embargo, el aislado de alta virulencia Nc-Spain7 mostró una mayor tasa de invasión junto con una mayor capacidad de supervivencia y proliferación.

Tras la disminución observada en los niveles intracelulares de ROS común a la infección por ambos aislados, los macrófagos infectados con el aislado de baja virulencia Nc-Spain1H mostraron un aumento dichos niveles y en la expresión de IL-12p40, lo que resultó en un incremento de la producción de IFN-γ por los linfocitos, comparado con las células infectadas por Nc-Spain7. Además, la expresión de IL-10 aumentó en macrófagos infectados con ambos aislados, pero fue mayor para la infección por Nc-Spain1H. Finalmente, los macrófagos infectados exhibieron una menor expresión de las moléculas CMH II y CD1b, relacionadas con la presentación de antígeno, y de CD86, molécula de superficie involucrada en la maduración y activación de linfocitos T. La infección por N. caninum indujo un fenotipo hipermigratorio en el macrófago bovino caracterizado por un aumento en la motilidad y en la transmigración celular in vitro. Dicho fenotipo se acompaña de rápidos cambios en el citoesqueleto de la célula con desaparición de podosomas y de una disminución en la degradación de la matriz extracelular, que conducen a un movimiento ameboide rápido del macrófago. Una hipermotilidad significativamente mayor se observó con la infección por el aislado Nc-Spain7.

OBJETIVO I | Caracterización fenotípica in vitro de macrófagos bovinos derivados