PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS

Para cada muestra, se mezclaron 2-5 µg del anticuerpo correspondiente con 5 µl de Proteína G Sepharose (GE Healthcare) preequilibrada en tampón de lisis. Tras 45 minutos de agitación a 1100 rpm a 4ºC, se realizaron dos lavados con tampón de lisis.

En paralelo se realizó un preclear de las muestras para evitar posibles interacciones inespecíficas. De 0,1 a 5 mg de lisado celular fueron incubados con 5 µl de Proteína G-Sepharose preequilibrada en tampón de lisis y se incubó 45 minutos a 1100 rpm a 4ºC. Trascurrido este tiempo, se centrifugaron las muestras 1 minuto a 1000 g y se recogió el sobrenadante (lisado celular o preclear).

A continuación, se añadió el lisado celular a la proteina G-Sepharose con anticuerpo y se incubó durante 90 minutos a 4ºC en agitación a 1100rpm. Se realizaron dos lavados en tampón de lisis con 0,5 M NaCl y un lavado en tampón 50mM Tris pH 7,5; 0,1mM EGTA; 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol. Al pellet final se añadieron 10 µl de tampón de muestra de electroforesis y tras calentar 5 min a 100ºC las proteínas inmunoprecipitadas fueron separadas mediante electroforesis y analizadas mediante inmunoblot.

En paralelo a la inmunoprecipitación de las muestras se realizó un control negativo en ausencia de anticuerpo.

Inmunoprecipitación con FLAG-M2-Agarose

Células HEK293T fueron transfectadas con el vector que codifica para la proteína pertinente fusionada al péptido FLAG, incubadas 24 horas a 37ºC en una atmósfera al 100% de humedad y 5% CO2 y lisadas.

Para purificar la proteína recombinante fusionada a FLAG se utilizó una variante del ensayo de inmunoprecipitación, utilizando un anticuerpo anti-FLAG inmovilizado en resina de agarosa (FLAG-M2-Agarose, Sigma). Se incubaron 5µl de resina-anticuerpo con 150 µg de muestra durante 1hora a 4ºC en agitación a 1100 rpm. Tras este tiempo se realizaron diferentes lavados de la muestra siguiendo el protocolo arriba descrito.

5.2. ENSAYOS DE PULL-DOWN

Se utilizó esta técnica para purificar proteínas recombinantes fusionadas a la proteína GST. En primer lugar, células HEK293T fueron transfectadas con el vector que codifica para la proteína pertinente fusionada a GST, incubadas 24 horas a 37ºC, en una atmósfera al 100% de humedad y 5% CO2 y lisadas.

Se incubaron 150 µg de extracto celular con 5 µl de Glutathione-Sepharose (GE Healthcare) que une específicamente GST. A continuación se procedió de igual manera que en la IP a la incubación, lavados de la resina y análisis de la muestra purificada.

5.3. PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MARCADAS CON GST o FLAG Purificación de GST-ERK5

Para cada purificación se transfectaron 10 discos de 10 cm de células HEK 293T, se incubaron durante 24 horas a 37ºC y se lisaron en tampón de lisis. A continuación, se incubó el lisado celular a 4ºC con 100 µl de Glutation Sepharosa (pre-equilibrados en tampón de lisis). Tras una hora en agitación se centrifugó la muestra 15 minutos a 3000 g.

En tubos falcon de 15 ml, se realizaron lavados secuenciales de la resina añadiendo 10 ml de tampón y centrifugando 1 minuto a 3000 g: 4 lavados con tampón de lisis 0,5 M de NaCl, seguidos de 3 lavados con tampón kinasa (50 mM Tris pH 7,5; 0,1% βME; 0,1 mM EGTA) y un lavado con tampón de elución (50 mM Tris pH 8; 0,1% βME; 0,1 mM EGTA; 0,27 M sacarosa). A continuación, se aspiró el sobrenadante del último lavado y se dejó un volumen de 500 µl en el que se resuspendió la resina. Se transfirió este volumen a un eppendorf y se eluyó la proteína mediante la adición de Glutatión a una concentración final de 40 mM. Se incubó 15 minutos a temperatura ambiente en agitación, se transfirió la muestra un tubo con filtro Spin X (0,45 µm de poro, Costar) y se centrifugó a 8000 g durante 1 minuto. El filtrado recogido corresponde a la proteína purificada.

La cuantificación y determinación de la pureza de la proteína purificada fue llevada a cabo mediante electroforesis SDS-PAGE, comparando la proteína obtenida con un

Purificación de ERK5-FLAG y PKM2-FLAG

Las proteínas fusionadas al péptido FLAG en su extremo C-terminal, fueron purificadas utilizando el protocolo anterior con dos modificaciones: la resina utilizada fue FLAG-M2-agarosa (SIGMA) y la elución se llevó a cabo con péptido FLAG Peptide (SIGMA) a una concentración final de 50 ng/ml.

5.4. PURIFICACIÓN DE ERK1/2 ACTIVA MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO EN COLUMNA MONO-Q HR-5/5

Esta resina cromatográfica fue utilizada con el fin de obtener una preparación pura y activa de ERK1 y ERK2 (ERK1/2). Se utilizó una columna Mono-Q HR-5/5 de Pharmacia (constituida por 1 ml de resina intercambiadora de iones monoQ) acoplada al sistema FPLC.

Para obtener los extractos celulares que contuvieran ERK1/2 activas, 5 discos de 10 cm de células HeLa fueron estimulados durante 15 minutos con 50 ng/ml de EGF y lisados en el tampón de lisis habitual. A continuación, fueron introducidos en una columna mono-Q HR-5/5 previamente equilibrada con tampón 50 mM Tris-HCl pH 7.5; 0,1% (v/v) β-mercaptoetanol. La columna fue lavada con 20 ml del mismo tampón y las proteínas retenidas se eluyeron mediante 20 ml de un gradiente de 0 a 0,375 M de NaCl en tampón de cromatografía. El flujo durante todo el proceso fue de 1 ml/min y se recogieron fracciones de 1ml.

La presencia de ERK1/2 en cada fracción fue determinada mediante inmunoblot, y la actividad kinasa medida utilizando como sustrato MBP y 32P-γ-ATP-Mg.

5.5. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA EN GEL FILTRACIÓN

El fraccionamiento cromatográfico de las muestras en función de su peso molecular se realizó en un sistema de FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography) (Pharmacia), equipado con 2 bombas de alta precisión P-500 y colector RediFrac. Se utilizó una columna Superdex 200-HR 10/30 (24 ml de lecho, Pharmacia), constituida por dextrano unido covalentemente a agarosa, con un rango de exclusión de 10 a 600 kDa.

El volumen vacío de la resina se determinó tras la aplicación de 0,5 ml de azul dextrano (1 mg/ml) y la lectura de la absorbancia a 620 nm de las fracciones recogidas. La columna fue equilibrada con 2 volúmenes de tampón de cromatografía (50 mM Tris pH 7,5; 0,15 M NaCl; 0,1 mM EGTA; 0,1% β-mercaptoetanol) y la velocidad de flujo fue de 0,32 ml/min. Una vez aplicada la muestra (500 µl, 0,5 a 2 mg de proteína) se recogieron fracciones de 0,33 ml.

Para la calibración de la columna se utilizaron los marcadores indicados en la tabla 8.

TABLA 8. Marcadores de peso molecular utilizados en la calibración de la columna Superdex 200-HR (FPLC)

Marcador Peso molecular (kDa) Referencia Casa Comercial

Azul dextrano 2.000 D-4772 Sigma-Aldrich

Tiroglobulina bovina 670 γ-globulina bovina 158 Ovoalbúmina de pollo 44 Mioglobina equina 17 Vitamina B12 1,35 151-1901 Bio-Rad

6. TANDEM AFFINITY PURIFICATION (TAP)