TÉCNICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE COMPLEJOS DE PROTEÍNAS

Las proteínas llevan a cabo la mayoría de los procesos biológicos que se dan en la célula, y muy a menudo lo hacen formando complejos proteína-proteína. El conocimiento del genoma de los organismos eucariotas superiores sugiere que la complejidad de éstos no se debe a un dramático aumento en el número de genes, sino que más bien se debe a una mayor complejidad en interacciones proteína- proteína (Rubin, 2001). El establecimiento de las interacciones moleculares que forman estos complejos es una de las tareas más relevantes de la era post-genómica, en un proceso que se beneficia de las nuevas técnicas de espectrometría de masas. Originalmente, la purificación de complejos de proteínas utilizaba los métodos bioquímicos clásicos de técnicas cromatográficas, en un proceso largo y laborioso, que requiere una gran cantidad de material de partida y que debe ser diseñado específicamente para cada caso. Posteriormente, la introducción de técnicas de purificación por afinidad utilizando tags redujo el coste y tiempo de este proceso. La proteína utilizada como cebo (a la que se le adiciona un péptido – tag – que es reconocido por una resina de afinidad), se sobre-expresa en células y las proteínas asociadas se purifican mediante una resina de afinidad que reconoce dicho péptido (FLAG, myc, HA o poli-histidinas) (Dziembowski y Seraphin, 2004). Sin embargo, el grado de afinidad de estas resinas es pobre, por lo que con mucha frecuencia el grado de recuperación de proteínas poco abundantes es muy bajo, además de aparecer artefactos; las proteínas contaminantes típicas son de citoesqueleto y chaperonas.

En 1991 se describió un nuevo método para la identificación de complejos de proteínas que interaccionan con una proteína conocida, el yeast two hybrid (Chien et al., 1991). Este método se basa en el diseño de dos plásmidos que codifican para dos proteínas híbridas. Un híbrido consiste en un dominio de unión a DNA de la proteína de activación transcripcional de levadura GAL4 fusionada a una proteína conocida; el otro híbrido consiste en el dominio de activación de GAL4 unido a una secuencia de proteína codificada en una librería de fragmentos de DNA genómico de levadura. La interacción entre la proteína conocida y la codificada por los plásmidos de la librería llevan a la transcripción del gen “reporter”, que es detectado (figura 11). Este método presenta dos problemas principales: un elevado número de falsos positivos y de

FIGURA 11. Bases del sistema yeast two hybrid. La interacción de la proteína cebo X con la proteína Y de una librería acercan los dos dominios del factor de transcripción (AD,

activation domain y BD, binding domain) necesarios del para que se exprese el gen

reportero. Obtenido de www.nature.com

En 1999 se describió una nueva técnica para la purificación de complejos de proteínas en condiciones nativas, basada en una purificación de afinidad en tandem (TAP, tandem affinity purification) (Rigaut et al., 1999). En este trabajo se utilizará esta técnica para identificar proteínas que interaccionan con la proteína kinasa ERK5. El procedimiento TAP tiene aplicaciones similares al yeast two-hybrid (Fromont- Racine et al., 1997). Sin embargo, el método TAP presenta la ventaja de que en unas condiciones establecidas, todas las interacciones directas e indirectas son identificadas en un único ensayo. Además, el método TAP aporta una información aproximada sobre la estequiometría de las proteínas presentes en el complejo, y permite un análisis bioquímico de las proteínas purificadas. Esta metodología no está limitada a la detección de interacciones proteína-proteína, ya que los ligandos que copurifican también pueden ser caracterizados (Rigaut et al., 1999).

El método TAP fue originalmente puesto a punto para la purificación de complejos de proteínas en levadura (Rigaut et al., 1999; Puig et al., 2001; Shevchenko et al., 2002), pero está siendo utilizado con éxito en células de mamífero (Drakas et al., 2005). Desde su descubrimento en 1999, se ha producido un gran aumento en el número de publicaciones en las que se utiliza la metodología TAP (ver figura 12).

FIGURA 12. Número de publicaciones que utilizan la metodología TAP desde su descubrimiento hasta finales de 2008. Fuente http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/

Este método se basa en el uso de dos cromatografías secuenciales. En primer lugar se diseña un vector que codifique la proteína objeto de estudio a la que se le adicionan dos dominios de unión a IgG y un péptido de unión a calmodulina, ambos separados por una secuencia que es específicamente reconocida por la proteasa TEV (ver la representación esquemática de la figura 13). Este vector debe ser sobre- expresado establemente en una línea celular. La purificación de los complejos se realiza mediante dos cromatografías secuenciales. La combinación de dos resinas diferentes logra un gran rendimiento, y la rapidez de la purificación y el uso de tampones que simulan las condiciones intracelulares incrementa el éxito de obtener complejos de proteínas, que son identificadas mediante espectrometría de masas (Dziembowski y Seraphin, 2004). 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 0 50 100 150 200 Año de publicación nº de pub li ca ci on es ut il iz ando l a m et odo logí a TA P

FIGURA 13. Método TAP. Representación esquemática del procedimiento de purificación de complejos de proteínas TAP. Figura modificada de www.nature.com.