Reacciones de ligación de fragmentos de DNA

Se realizaron en un volumen final de 20 l en un tampón 50 mM TrisHCl pH 7.8, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 1 mM ATP, 25 g/ml BSA; utilizando 200 ng/ml de cada

fragmento de DNA y 200 U de T4 DNA ligasa (New England Biolabs). Las reacciones se llevaron a cabo durante 16 h a 16 oC.

32 3.2.3. Reacciones de restricción enzimática

Se realizaron con enzimas procedentes de las casas comerciales New England

Biolabs y Fermentas, según las indicaciones del proveedor. 3.2.4. Generación de plásmidos recombinantes

3.2.4.1. Generación de los plásmidos pFBHtb-VP3P1, pFBHtb-VP3P2 y pFBHtb-VP3P1+2

Un fragmento de DNA de 789 pb que contiene la versión mutante VP3MutPatch1 con cuatro sustituciones aminoacídicas en la región Patch1 (K99D, R102D, K105D y K106D), flanqueado por los sitios de restricción BamHI y EcoRI, fue síntetizado in vitro (Genscript) e insertado en el sitio EcoRV localizado en el MCS del plásmido pUC57. Este plásmido se digirió con BamHI y EcoRI y el fragmento resultante fue purificado e insertado en el MCS del vector de transferencia de baculovirus pFastBacHtb (Invitrogen), previamente digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido que se obtuvo, pFastBacHtb-VP3P1, fue secuenciado para comprobar la corrección de su secuencia.

El plásmido pFastBacHtb-VP3P2 se generó de la misma manera que el anterior. En este caso, contiene la versión mutante VP3MutPatch2 con cuatro sustituciones aminoacídicas en la región Patch2 (R159D, R168D, H198D y R200D).

El plásmido pFastBacHtb-VP3P1+2 que contiene la versión mutante VP3MutPatch1+2 con ocho sustituciones puntuales, correspondientes a las regiones Patch1 y Patch2, fue generado sustituyendo el fragmento BamHI/XbaI de la secuencia de VP3MutPatch2 por la correspondiente en la secuencia VP3MutPatch1. Esto fue posible porque existe un sitio único de restricción para XbaI en la secuencia entre Patch1 y Patch2.

3.2.4.2. Generación de los plásmidos pFastBacHtb-VP3K99D, -VP3R102D, -VP3K105D y – VP3K106D

Estos plásmidos se generaron por mutagénesis dirigida sobre el plásmido pFastBacHtb-VP3wt utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 1 para obtener

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secuencias de VP3 que tuvieran las mutaciones puntuales K99D, R102D, K105D y K106D.

3.2.4.3. Generación de los plásmidos pFastBacHtb-VP3K99D/R102D, -VP3K99D/K105D, - VP3K99D/K106D, -VP3R102D/K105D, -VP3R102D/K106D y –VP3K105D/K106D

Para generar los plásmidos con las versiones de VP3 con mutaciones dobles, se realizó mutagénesis dirigida sobre plásmidos pFastBacHtb-VP3 con diferentes mutaciones puntuales y utilizando los cebadores enumerados en la Tabla 1 para obtener secuencias de VP3 que tuvieran las mutaciones dobles indicadas.

Plásmido Oligos (5’-3’) Molde

pFBHtbVP3K99D GAAGCACAGAGGGAAGACGACACACGGATCTCA _pFBHtbVP3 pFBHtbVP3R102D AGGGAAAAAGACACAGACATCTCAAAGAAGATG _pFBHtbVP3 pFBHtbVP3K105D GACACACGGATCTCAGACAAGATGGAGACCATG _pFBHtbVP3 pFBHtbVP3K106D ACACGGATCTCAAAGGACATGGAGACCATGGGC _pFBHtbVP3 pFBHtbVP3K99D/R102D AGGGAAGACGACACAGACATCTCAAAGAAGATG _{pFBHtbVP3K99D} pFBHtbVP3K99D/K105D GACACACGGATCTCAGACAAGATGGAGACCATG _{pFBHtbVP3K99D} pFBHtbVP3K99D/K106D ACACGGATCTCAAAGGACATGGAGACCATGGGC _{pFBHtbVP3K99D} pFBHtbVP3R102D/K105D GACACAGACATCTCAGACAAGATGGAGACCATG _{pFBHtbVP3R102D} pFBHtbVP3R102D/K106D ACAGACATCTCAAAGGACATGGAGACCATGGGC _{pFBHtbVP3R102D} pFBHtbVP3K105D/K106D ACACGGATCTCAGACGACATGGAGACCATGGGC _{pFBHtbVP3K105D}

Tabla 1. Generación de plásmidos recombinantes con una o dos mutaciones puntuales. Se

indica el plásmido generado, la secuencia de los oligonucleótidos empleados en la mutagénesis dirigida; y el plásmido empleado como molde para la PCR.

3.2.4.4. Generación de los plásmidos pFastBacHtb-VP3DXV y pFastBacHtb-VP3IPNV

Un fragmento de DNA de 856 bp que contiene la versión VP3DXV, flanqueado por los sitios de restricción BamHI y EcoRI, fue síntetizado in vitro (Genscript) e insertado en el sitio EcoRV localizado en el MCS del plásmido pUC57. Este plásmido se digirió con BamHI y EcoRI y el fragmento resultante fue purificado e insertado en el MCS del vector de transferencia de baculovirus pFastBacHtb (Invitrogen), previamente

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digerido con las mismas enzimas de restricción. El plásmido que se obtuvo, pFastBacHtb-VP3DXV, fue secuenciado para comprobar la corrección de su secuencia.

Se siguió el mismo procedimiento para generar el plásmido pFastBacHtb- VP3IPNV que contiene el fragmento de DNA de 718 pb correspondiente a la versión VP3IPNV.

3.2.4.5. Generación de los plásmidos pVOTE-VP3P1, pVOTE-VP3P2 y pVOTE-VP3P1+2

El fragmento de DNA de 789 pb que contiene la región codificante de la versión mutante VP3Patch1, con cuatro sustituciones aminoacídicas (K99D, R102D, K105D y K106D), flanqueado por los sitios de restricción NdeI y BamHI, fue generado por PCR utilizando como molde el plásmido pFBHtb-VP3P1 previamente descrito y los oligos 5’- GCGCCATATGGCTGCATCAGAGTTCAAAGAG y 5’- GCGCGGATCCTCACTCAAGGTCCTCATCAGAG. El producto de la PCR resultante, fue purificado, digerido con NdeI y BamHI y ligado en el vector pVOTE2 previamente digerido con estos enzimas. El plásmido resultante, pVOTE/VP3P1, fue secuenciado para comprobar la corrección de la secuencia introducida.

Se siguió el mismo procedimiento para generar los plásmidos pVOTE/VP3P2 y pVOTE/VP3P1+2, esta vez utilizando como moldes los plásmidos pFBHtb-VP3P2 y pFBHtb-VP3P1+2 respectivamente.

3.2.4.6. Generación del plásmido pJR101-VP3

El fragmento de DNA de 789 pb que contiene la región codificante de la proteína VP3 flanqueado por los sitios de restricción KpnI y BamHI, fue obtenido por PCR utilizando como molde el plásmido pFBHtbVP3 (Kochan y col. 2003) y los oligos 5’- GCGCGGTACCATGGCTGCATCAGAGTTCAAAGAG y 5’- GCGCGGATCCTCACTCAAGGTCCTCATCAGAG. El fragmento de PCR resultante fue purificado, digerido con los enzimas NdeI y BamHI y ligado en el vector pJR101 previamente digerido con estos mismos enzimas. El plásmido resultante pJR101-VP3 fue secuenciado para comprobar la corrección de la secuencia introducida.

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3.2.4.7. Generación de los plásmidos pNTAP-P1b, pNTAP-NS1, pNTAP-VP3, pNTAP- VP3Patch1, pNTAP-VP3Patch2, pNTAP-VP3Patch1+2, pNTAP-VP3DXV y pNTAP-VP3IPNV

Los vectores de expresión en plantas de las proteínas NS1 del virus de la gripe, VP3 de IBDV y sus versiones mutantes, así como VP3 de DXV y VP3 de IPNV, con una cola TAP fusionada en su extremo N-terminal, fueron generados por reacciones de LR clonasa entre el correspondiente vector donante pDONR y el vector receptor p35S- NTAP (Valli y col. 2012). Los plásmidos resultantes fueron secuenciados para comprobar la corrección de la secuencia introducida. Los plásmidos pDONR-P1b y p35S-NTAP-P1b habían sido generados previamente (Valli y col. 2008).

3.2.4.8. Generación del plásmido pICPPV-VP3

La región codificante correspondiente al polipéptido VP3 se clonó en un plásmido intermediario pGEMTp1p3 para generar pGEMTp1-VP3-p3. Este plásmido se empleó para reemplazar el fragmento equivalente en el cDNA genómico de una versión recombinante de PPV que contiene también la secuencia codificante de la proteína GFP para facilitar la monitorización de la infección (pICPPV-NK-GFPn), y se generó un cDNA infectivo denominado PPV-VP3 (Maliogka y col. 2012).