Hay dos tipos de receptores de célula T, ambos son heterodí- meros (dímeros constituidos de dos polipéptidos diferentes). Casi todas las células T recirculantes portan he terodímeros αβ, que se unen a ligandos constituidos de un péptido antigé- nico presentado en un surco molecular sobre la superficie de una molécula del mhc tipo I o tipo II. Un se gundo sub grupo de células T expresa, en lugar de esto, un receptor de célula T heterodimérico compuesto de un par diferente de cadenas de proteína, llamadas γ y δ. Las células T que portan receptores γδ tienen patrones de localización particulares (a menudo en tejidos mucosos) y algunas células T γδ reconocen tipos de antígenos diferentes de los que son unidos por células T αβ. Aunque algunas células T γδ reconocen antígenos peptídicos presentados por mhc convencionales, otras células T γδ se unen a porciones de lípido y glicolípido presentadas por moléculas del mhc no canónicas. Aún otras clonas de células T γδ parecen reconocer proteínas de choque por calor auto- generadas o fosfoantígenos derivados de microbios. No ha logrado establecerse todavía una teoría unificada de la natu- raleza precisa de antígenos reconocidos por células T γδ. Empero, esta capacidad de dichas cé lulas para romper las reglas de restricción del mhc tal vez explique la evolución de una diferencia leve en el ángulo entre la región de unión a antígeno y la región constante del receptor de cé lula T, que queda de manifiesto en un análisis cristalográfico de rayos X de los dos tipos de receptor (figura 3-29). A pesar de estas diferencias funcionales en los receptores αβ en contraposi- ción con γδ, sus características bioquímicas esenciales son bastante similares.
Dominios V
Dominios C
γδ TCR
111° αβ TCR147°
FigurA 3-29 comparación de las estructuras cristalinas de TcR 𝛄𝛅 y 𝛂𝛃. La diferencia (puesta de relieve con líneas negras) en el ángulo codo entre formas γδ y αβ forma el TCR.
El resto de este capítulo se enfoca en la estructura y la seña- lización del tipo de tcr αβ dominante, reconociendo que puede haber diferencias menores entre los dos tipos de re ceptores y sus componentes torrente abajo.
Aunque el tcr no es una inmunoglobulina en sí, las proteí- nas del tcr son miembros de la superfamilia de proteínas inmunoglobulina y, por ende, las estructuras dominio de hete- rodímeros de tcr αβ y γδ son notoriamente similares a las de las inmunoglobulinas (figura 3-19). La cadena α tiene un peso molecular de 40 a 50 kDa, y la cadena β es de 40 a 45 kDa. Al igual que las cadenas ligeras de anticuerpo, las cadenas de tcr tienen dos dominios tipo inmunoglobulina, cada uno de los cuales contiene un enlace disulfuro intracadena que abarca 60 a 75 aminoácidos. El dominio Cα del tcr difiere de casi todos los dominios de inmunoglobulina en que posee sólo una lámina β única, en lugar de un par, y el resto de la secuencia muestra plegamiento más variable. El dominio amino terminal (varia- ble) en ambas cadenas muestra notoria variación de secuencia, pero las secuencias del resto de cada cadena están conservadas (son constantes). Cada uno de los dominios variables de tcr tiene tres regiones hipervariables, que parecen ser equivalentes a las regiones determinantes de la complementariedad (cdr) en las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina. Una cuarta región hipervariable sobre la cadena β de tcr no parece tener contacto con el antígeno, y, por ende, su importancia funcional es incierta.
En el extremo C terminal del dominio constante, cada ca - dena de tcr contiene una secuencia conectora corta, en la cual un residuo de cisteína forma un enlace disulfuro con la otra cadena del heterodímero. En posición C– terminal a este disul- furo hay una región transmembrana de 21 o 22 aminoácidos, que ancla cada cadena en la membrana plasmática. Los domi- nios transmembrana de las cadenas alfa y beta de tcr son poco comunes por cuanto cada uno de ellos contiene residuos de aminoácido con carga positiva que promueven la interacción con residuos con carga negativa correspondientes sobre las cadenas del complejo CD3 transductor de señal. Por último, al igual que los bcr, cada cadena de tcr sólo contiene una cola citoplasmática muy corta en el extremo carboxilo terminal.
rísticas bioquímicas del tcr se entendieron
después que las del bcr, hasta el decenio de
1980-1989, cuando un importante avance científico —la capacidad para sintetizar anti- cuerpos monoclonales a partir de tumores vamente más tratable. Sin embargo, los
investigadores dedicados a caracterizar el receptor de célula T (tcr) no disfrutaron de
la misma ventaja, porque el tcr no es secre-
tado en forma soluble. Por ende, las caracte-
El descubrimiento del receptor de células T αβ
Una vez
que los científicos habían esta- blecido que el bcr era simplemente unaforma unida a membrana del anticuerpo secretado, la elucidación de la estructura del
bcr se convirtió en un problema significati-
Se inmuniza ratones con ovoalbúmina (OVA)
Se espera varios días Se extirpan ganglios linfáticos
Se cultivan células T del ganglio linfático con OVA
Generación de un hibridoma de células T con especificidad de antígeno conocida 1
FIGuRA 1
La generación de anticuerpos específicos para el tcr
Se diluyen las células fusionadas de modo que cada célula contenga un hibridoma de células T único. Se permite que las células se dividan para formar clonas y se prueba cada clona respecto a su capacidad para secretar IL-2 cuando es estimulada con péptidos de ovoalbúmina. Se hacen crecer clonas individuales de hibridomas de células T que reconocen OVA.
3
Se añade polietilénglicol para inducir fusión de células T específicas para antígeno con línea de células T de vida prolongada 2
Se inmuniza a un nuevo ratón con células provenientes de un hibridoma de células T específico para OVA
Se espera varios días Se aísla el bazo
Producción de anticuerpos que se unen a TCR sobre el hibridoma de células T
4
Se fusionan células B provenientes del bazo con línea de células B a largo plazo
5
Se recolectan anticuerpos monoclonales que se unen a líneas de células T Selección y expansión de las clonas de células B a largo plazo que secretan anticuerpos monoclonales que se unen al hibridoma de células T
6
linfático recolectadas (figura 1, paso 1). Des- pués de cierto tiempo en cultivo, fusionaron estas células T específicas para ova, activa-
das, con células derivadas de un tumor de células T (figura 1, paso 2); de este modo ge- neraron varios cultivos de hibridoma de células T de vida prolongada que recono- cieron péptidos de ova en el contexto del mhc del ratón original, un alelo del mhc
llamado H-2d. A continuación diluyeron las
células fusionadas en cada cultivo, lo que generó varias líneas de hibridoma de células T en las cuales todas las células en una línea de hibridoma individual se derivaron del pro ducto de un evento de fusión único (fi - gura 1, paso 3); esto se denomina clonación por dilución limitante. De esta manera, aisla- ron un hibridoma de células T que expresó un tcr capaz de reconocer un péptido pro-
veniente de la ova, en el contexto de proteí-
nas del mhc clase 2 provenientes de ratones
de la cepa H-2d.
Entonces esas células T podían utilizarse como antígenos e inyectarlas en un ratón (figura 1, paso 4). Algunos días más tarde se extirpó el bazo de este animal, y las células B del ratón se fusionaron con células tumora- les de la línea B (figura 1, paso 5). Después de cultivar para estabilizar los híbridos, los investigadores clonaron los hibridomas de células B y seleccionaron una línea de hibri- doma de células B que produjo anticuerpos de células B construidos de manera artificial,
o hibridomas— hizo técnicamente más fac- tible el análisis del tcr.
Un hibridoma es un producto de fusión de dos células. Los hibridomas de células B se generan al fusionar de manera artificial linfocitos de vida breve, productores de anti- cuerpos, con células tumorales de vida pro- longada a fin de generar células hijas de vida prolongada que secretan grandes cantida- des de anticuerpos monoclonales. (El tér- mino monoclonal se refiere al hecho de que todas las células en un cultivo de hibri- doma dado se derivan de la clona única de células y, por ende, portan el mismo dna; los
detalles de la tecnología se describen en el capítulo 20.) Aunque esta técnica se desarro- lló por vez primera para la generación de células B de vida prolongada, los científicos que trabajaban en el laboratorio de John Kappler y Philippa Marrack también la apli- caron a linfocitos T.
Los investigadores empezaron por inmu- nizar un ratón con la proteína ovoalbúmina (ova), y permitieron que células T específi-
cas para ova se dividieran y diferenciaran
durante algunos días, y después recolecta- ron los ganglios linfáticos del animal inmuni- zado. Para enriquecer su población inicial con tantas células T específicas para ova
como fue posible, durante varias horas culti- varon con ova in vitro las células de ganglio
monoclonales que se unieron de manera específica al hibridoma de células T (figura 1, paso 6). Lo que es más importante, estos anticuerpos interfirieron con la capacidad de las células T para reconocer su antígeno cognado (figura 1, paso 7). El hecho de que este anticuerpo monoclonal inhibió la unión de antígeno a tcr sugirió que el anticuerpo
se estaba uniendo de manera directa al receptor, y estaba compitiendo con el antí- geno por unión al tcr. A continuación usa-
ron estos anticuerpos para inmunoprecipitar el tcr desde preparaciones de membrana
solubilizadas con detergente, y purificaron la proteína tcr (figura 1, paso 8).
De modo concurrente con estos experi- mentos, en los laboratorios de Stephen Hedrick y de Mark Davis en los nih y de Tak
Mak en Toronto, se habían estado buscando los genes que codifican para receptor de célula T, y se habían logrado avances. Estos experimentos, así como investigación subsi- guiente realizada por Susumu Tonegawa, que completó la identificación de los genes que codifican para el tcr, se describen con
detalle en el capítulo 7.
Haskins et al. 1983. The major histocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells. I. Isolation with a monoclonal antibody. The Jour-
nal of Experimental Medicine 157:1149-1169.
Haskins et al. 1984. The major histocompatibility complex-restricted antigen receptor on T cells. Annual Review of Immunology 2:51-66.
OVA OVA
Identificación de anticuerpo monoclonal que interfiere con el reconocimiento de antígeno por células de hibridoma de células T
La mezcla de hibridoma de células T con células presentadoras de OVA en
ausencia de anticuerpo da lugar a la proliferación de hibridoma de células T
La mezcla de hibridoma de células T con células presentadoras de OVA en
presencia de anticuerpo da lugar a proliferación nula de hibridoma de células T 7
Las dos cadenas del receptor αβ pueden observarse en la línea 1 del gel, corriendo una arriba de la otra a aproximadamente 40 a 45 kDa. Se mostró que las dos bandas de peso molecular más alto que se observan en esta línea representan bandas inespecíficas.
Bandas de TCR αβ de 45 kDa
8
ζη (zeta, eta). (Note que las cadenas γ y δ de CD3 son distintas de las cadenas que constituyen el tcr γδ.) Al igual que Igα e Igβ, las colas citoplasmáticas de las moléculas de CD3 están salpicadas de secuencias itam que sirven como sitios de aco- plamiento para proteínas adaptadoras después de fosforilación de tirosina inducida por activación. Cada uno de los dímeros CD3 contiene aminoácidos con carga negativa en su dominio transmembrana que forman enlaces iónicos con los residuos que tienen carga positiva sobre las regiones intramembrana del receptor de célula T.