Receptores TLR

El proceso inflamatorio comienza cuando una noxa, externa/interna potencialmente dañina, induce una respuesta local y general mediante citoquinas solubles inflamatorias y agentes quimiotácticos, que aumentan el flujo sanguíneo, la permeabilidad vascular, y la migración, acúmulo y activación leucocitaria.

Los enterocitos humanos, como las células de plantas o invertebrados (438), perciben el daño potencial por receptores de patrones de reconocimiento (PRR) (439, 440) que reconocen y unen patrones moleculares asociados de microbios (MAMP) y activan cascadas de señales intra-inter celulares de defensa. Los MAMP, son biomoléculas heterogéneas, específicas y sensibles de la presencia de microorganismos como: lipopolisacaridos, peptidoglicanos (PGN), lipoproteínas, polipéptidos (flagelina), ácidos nucléicos (ADN, ARN de cadena doble, rico en CpG) (441). Los PRR más conocidos en vertebrados son los TLR (442, 443), una docena en humanos (444). Son receptores transmembrana con dos motivos muy conservados. Sus porciones extracelulares tienen varios dominios ricos en leucina (LRR) que reconocen y se unen a los MAMP. Las intracelulares, llamadas TIR (Toll/IL-1R) activan e integran las vías de transducción de señales (445). Además de en las

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membranas citoplásmaticas, también están en las membranas de orgánelas del citosol, como los NOD1 y NOD2 (446).

Figura 21.- Los TLR son una superfamilia de receptores celulares. En los humanos, tienen un papel fundamental en la respuesta inmune del huésped. Conservan dominios ancestrales tipo TIR para el reconocimiento de noxas externas. Los receptores TLR, en humanos, detectan patrones moleculares específicos de diferentes microorganismos. Los TLR se expresan en la superficie celular y en la membrana de algunas organelas citoplasmáticas. Como respuesta al acoplamiento y activación de los TLR se desencadena una respuesta en cascada intracelular, que conlleva la producción de citoquinas celulares, que desencadenan la reacción de respuesta inmune e inflamatoria. Modificado de Qiagen Pathways

67 1.5.3.2 Lipopolisacarido (LPS)

El LPS es el principal glicolípido de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas que es reconocido por TLR4 (447). Los pacientes con ECN, tienen elevación plasmática de LPS (340, 448, 449), que promueve la activación de leucocitos (450, 451) y disminuye la integridad de la barrera intestinal (452-454). Su actuación en humanos está mediada por TLR4 (455, 456), en modelos animales los mutantes para TLR4 no reaccionan a LPS (457, 458) y están parcialmente protegidos frente a ECN. En concreto, enterocitos IEC-6 de rata (459), colonocitos (460-462), y células rectales de ratón CMT93(253) expresan TLR4, MD-2 y MyD88, y su proliferación aumenta con la activación por LPS (459), secreción de IL-8 (463), tráfico intracelular de TLR4 (460, 462), y activación de NF- B (461, 464).

La activación de TLR4 por LPS estimula la vía kinasa de IL-1R mediada por MyD88 y MD2 (465), que produce aumento de NF- B y de citoquinas proinflamatorias (466). La activación de TLR4 también puede transmitirse por una vía independiente de MyD88, induciendo la producción de IFN-β (467, 468).

La activación de PRR por los MAMP, activa tres vías de respuesta: la clásica dependiente de Rel/NF- B, la proteína kinasa activada por mitógenos (MAPK) y el factor regulador de interferón (IRF). Al final, se activan factores de transcripción nuclear: Rel, bZip y IRF3 que activan promotores de genes de defensa celular (469).

1.5.3.2.1 Factor nuclear kappa B (NF-κB)

NF-κB es un factor de transcripción citosólico, con subunidades de dos tipos, p65 y p50. Es activado por citocinas inflamatorias, TNF-α e IL-1β, estrés oxidativo (470), endotoxina LPS (471), proteína-kinasa C (PKC) y fosfatidilinositol-3-kinasa (PI3K). En células sin estimular se asocia a proteínas llamadas factores inhibidores de NF-κB tipo 1 y 2 (IκB: 1-2) (469). Su activación clásica se produce por fosforilación del IκB en dos Ser, por la kinasa del IκB (IKK), formada por las subunidades IKKα e IKKβ, y otra reguladora IKK-gamma (NEMO). Ya fosforilado, IkB se une a ubiquitina y el proteasoma 26S lo degrada. La forma libre de NF-κB se transloca al núcleo y actúa como factor de transcripción mediada por Rel.

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Figura 22.- El NF-κB es una proteína heterodimérica compuesta por la combinación de alguno de los 5 miembros de

la familia de factores de transcripción Rel: ( NF-κBB1(p50), NF-κBB2 (p52), RelA (p65), RelB, y c-Rel). Se encuentra

en forma dimérica preformada y secuestrada en el citosol, unida de forma no covalente a IKB. Se activa principalmente por estrés celular y como respuesta inmune e inflamatoria frente a noxas como: LPS, TNF, EROS, inhalantes, virus, bacterias, radiaciones, rayos UV y linfocitos B o T activados. El NF-κB activa la transcripción de Ciclina-D1, regulador

principal del punto de control mitogeno G1. Modificado de Qiagen Pathways.

Respuestas celulares posteriores a la activación de NF-κB son: activación de células del sistema inmune por inducción de citoquinas, migración celular y reparación tisular por inducción de moléculas de adhesión, inflamación por inducción de proteínas de fase aguda, inhibición de tumorogénesis por regulación de protooncogenes (472). También inhibe la apoptosis regulando el equilibrio de

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señales pro y anti-apoptóticas. El NF-κB inhibe la acumulación de EROS inducida por el TNF-α que media en la activación de JNK y la muerte celular (473).

1.5.3.2.2 Proteína-kinasas activadas por mitógenos (MAPK)

Vía que incluye la propia MAPK, la proteína-kinasa-kinasa activada por mitógenos (MAPKK) y la proteína-kinasa-kinasa-kinasa activada por mitógenos (MAPKKK). En la familia MAPK se han identificado tres subgrupos: la kinasa N- terminal c-Jun (JNK), la MAPK p38 y la kinasa regulada por señales extracelulares (ERK1/2), que se activan por EROS y afectan a la supervivencia celular (474).

Figura 23.- Las MAPKs operan de forma modular por tres kinasas que, se activan de forma secuencial al fosforilarse. En mamíferos, se han identificado 12 MAPK, 7 MAPKK y 14 MAPKKK. Son múltiples los receptores celulares que al ser estimulados activan la vía de MAKPs: EGF, PDGF, FGF, GH, TGF-beta, TNF, estrés térmico, osmótico e isquémico. Modificado de Qiagen Pathways.

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Su respuesta frente a las bacterias es la fosforilación de los dominios de JNK y CREB/ATF, y activando así la síntesis de ARNm. ERK1/2 y MAPK p38 se han relacionado con la supervivencia celular, y JNK con la muerte celular. El equilibrio entre las activaciones de ERK1/2, MAPK p38 y JNK es crucial para determinar el destino de la célula, entre la muerte y la supervivencia (474-476).

1.5.3.2.3 Factores de interferón de regulación nuclear (IRF)

IRF3 e IRF7 se activan tras el estimulo de los receptores TLR3 y TLR4. Muchos de los novedosos IRF se sintetizan en respuesta a ADN2c y otras señales proinflamatorias de bacterias, para mediar en la respuesta adaptativa. IRF3 está inactivo en citosol, hasta que TIR interacciona con la proteína adaptadora TRIF, activando IKKe y TBK1 (una MAPKK). Este complejo kinasa, fosforila IRF3, por un mecanismo aún desconocido y este se traslocan al núcleo para inducir las transcripción de genes de supervivencia celular (477).

1.6 Clínica

En enero de 2012, el Comité de Coordinación y Mantenimiento del ICD-9-CM del CDC, describe el código de clasificación 777.5 para RN con ECN no específica. Y el código 777.51 para ECN sin neumatosis ni perforación (estadio I); 777.52 para ECN con neumatosis, sin perforación (estadio II) y 777.53 para ECN con neumatosis, con perforación (estadio III) (478).

La forma de presentación clínica de la ECN es muy variable, si bien dos tercios de los casos aparecen en las 2-3 primeras semanas de vida. Al inicio pueden presentarse síntomas generales inespecíficos y menores como: rechazo de tomas, irritabilidad, inestabilidad de la temperatura…etc, o graves como: letargia, apnea, bradicardia…etc y también síntomas gastrointestinales menores, como: náuseas, vómitos, distensión abdominal, o mayores como: sangre macroscópica en heces, íleo y signos de peritonismo (479, 480).

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Los síntomas iniciales, de distensión abdominal y presencia de residuos gástricos, son marcadores clínicos sensibles pero inespecíficos, pues se solapan con otros cuadros clínicos (481). La asociación de timpanismo a la percusión abdominal, vómitos con residuos biliosos en RN con factores de riesgo de ECN, deben ser signos de alerta.

Cuando se deteriora la mucosa de la pared intestinal, las microrroturas y trombos de los capilares comprometen su vascularización, apareciendo inicialmente sangre oculta en heces. La disminución del riego sanguíneo puede afectar posteriormente a toda la pared intestinal con áreas de necrosis e infarto, siendo entonces visible, macroscópicamente la pérdida de sangre en heces, acompañada de una alteración de la coagulación (482) y afectando los vasos de mayor calibre (483) para dar lugar a la perforación intestinal.

La afectación de la mucosa y capas más profundas de la pared intestinal, da lugar a microperforaciones intestinales, provocando íleo adinámico, que se traduce en la palpación como posible masa abdominal y dolor difuso. Puede aparecer aire entre las capas del tracto intestinal (pneumatosis), en el peritoneo (pneumoperitoneo) o en el propio árbol vascular (aire en territorio portal). Una vez establecida la perforación franca aparece peritonismo grave que conlleva inestabilidad hemodinámica y alteración de la termorregulación. La traslocación de microorganismos intestinales al torrente circulatorio provoca septicemia. Aunque con frecuencia se aíslan patógenos en hemocultivo, coprocultivo o cultivo del líquido ascítico en pacientes con ECN, ningún único patógeno presenta una relación consistente (59, 484-496).

Sin instaurar un tratamiento rápido y agresivo hay un deterioro general, rápidamente progresivo, con acidosis metabólica, letargia, crisis de apnea, CID y fallo multiorgánico, que conlleva sin tratamiento inexorablemente a la muerte del RN (479, 480, 497-505).

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