RECOLECCIÓN DE MUESTRAS

DMétodo no destructivo sobre carcasa:

Para el muestreo y colección de las muestras en las canales porcinas se empleo el método no destructivo de arrastre sobre la piel de las carcasas con hisopos estériles (dos por muestra). Los hisopos se humedecieron durante cinco segundos antes de la toma de muestras empleando una solución estéril de Agua Peptonada Tamponada (APT).

Posteriormente con una plantilla en acrílico estéril de 10 cm. x 10cm, de cada canal seleccionada se tomaron cuatro muestras superficiales en un área de 100 cm2(10 x10 cm), la cual se delimito por la plantilla estéril. Se aplicó la mayor presión posible y se frotó en el área delimitada por la plantilla 10 veces verticalmente (de arriba hacia abajo) y luego 10 veces horizontalmente (derecha a izquierda). Las cuatro áreas de donde se obtuvieron las muestras fueron: cabeza, vientre, lomo y pierna (Fig. 4). Las plantillas de acrílico fueron utilizadas solamente una vez pues se descartaban al finalizar el muestreo.

Las muestras anteriormente mencionadas se recogieron en tubos falcón con 10 ml de APT y a continuación se homogenizaron mediante agitación. (Anexo 2). El transporte se realizó en una nevera de icopor con hielo seco hasta el momento de llegada al laboratorio donde luego fueron procesadas (Figura 5.)

a) b)

c)

Figura 4. Toma de Submuestras. Hisopado de arrastre.

a) Hisopado de la cabeza. b) Hisopado del vientre c) Hisopado del lomo. d) Hisopado de la pierna.

Figura 5. Condiciones de transporte de implementos y materiales utilizados durante los muestreos.

5.4.1 Procesamiento de las muestras

El proceso se realizó en condiciones de completa esterilidad en el laboratorio de microbiología (Fig. 6 y 7).Las asas fueron desinfectadas en cada proceso para evitar contaminaciones ambientales.

Figura 7. Procesamiento de las muestras en el laboratorio. Empleo de la cabina de bioseguridad.

5.4.1.1 PreJenriquecimiento no selectivo

Inicialmente en el laboratorio cada espécimen se dividió en dos, con un volumen final de 5 ml. con su respectivo hisopo.

A continuación cada tubo se identificó como “tubo A” el cual se incubo a 37 ± 1° C durante 18D24 horas y el “tubo B” se incubo a 41 ± 1° C durante 18D24 horas (Fig. 8).

Figura 8. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de sp a partir de carcasas porcinas. Procesamiento del PreJenriquecimiento no selectivo.

5.4.1.2 Enriquecimiento selectivo.

Posteriormente, se transfirió del tubo B, 1 ml de la solución a un tubo con 9 ml de Caldo de enriquecimiento Rapapport Vassiliadis (RVS), y un (1) ml a otro tubo con nueve (9) ml de Caldo de enriquecimiento SelenitoDCistina (SC) y luego se incubaron a 43 ± 1° C durante 18 – 24 horas

De otro lado, a partir del tubo A se extrajo un (1) ml y se deposito en un tubo con nueve (9) ml de Caldo Tetrationato (TTO), al cual previamente se le había adicionado 0.4 ml de Yodo, posteriormente se incubó a 37 ± 1° C durante 18 – 24 horas. (Figura 9).

a) b)

Figura 9. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de sp a partir de carcasas porcinas. Proceso de Incubación para el PreJenriquecimiento no selectivo de las muestras. . a) Incubación a 37ª C. b) Incubación a 43 ± 1° C. 5.4.1.3 Siembra en medios selectivos

Una vez se finalizó el enriquecimiento se procedió a la agitación de los tubos de RVS, SDC, TTO, se introdujo el asa de aro en el interior de estos tubos y tomando abundante inóculo se sembró por agotamiento sobre Agar Xilosa Lisina Desoxicolato (XLD), Agar SalmonellaDShigella (S.S) y Agar Xilosa Lisina Tergitol (XLT4) (Figura 10).

Figura 10. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de sp a partir de carcasas porcinas. Siembra en medios selectivos a partir de caldos de enriquecimiento selectivo. Procedimiento de enriquecimiento selectivo.

Se compararon las metodologías de aislamiento, (1D9), por muestra y submuestra para establecer cual fue la mas efectiva para aislar sp a partir de canales porcinas en planta de sacrificio, según las sugerencias de la literatura. Cada muestra fue sometida a nueve metodologías de aislamiento las cuales se categorizaron como se indica en la tabla 4 de la siguiente manera.

Tabla 4. Protocolos para el aislamiento de sp a partir de canales porcinas. MEDIOS DE AISLAMIENTO Nª Caldo de PreJ enriquecimiento Caldo de enriquecimiento

selectivo Medio selectivo 1 Agua Peptonada

Tamponada Rapapport Vassiliadis

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato 2 Agua Peptonada

Tamponada SelenitoJCistina

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato 3 Agua Peptonada

Tamponada Caldo Tetrationato

Agar Xilosa Lisina Desoxicolato 4 Agua Peptonada

Tamponada Rapapport Vassiliadis

Agar Xilosa Lisina Tergitol 5 Agua Peptonada

Tamponada SelenitoJCistina

Agar Xilosa Lisina Tergitol 6 Agua Peptonada

Tamponada Caldo Tetrationato

Agar Xilosa Lisina Tergitol 7 Agua Peptonada

Tamponada Rapapport Vassiliadis Agar SalmonellaJShigella 8 Agua Peptonada

Tamponada SelenitoJCistina Agar SalmonellaJShigella 9 Agua Peptonada

Tamponada Caldo Tetrationato Agar SalmonellaJShigella

5.4.1.3 Pruebas bioquímicas

Las colonias típicas o sospechosas provenientes de los medios de cultivo mencionados anteriormente fueron repicadas en XLD . Cuando se seleccionaron las

colonias características y puras de se analizaron con la batería de

Luego cada colonia se inoculó en: Medio citrato de simmons, agar triple azúcarD hierro (TSI), agar lisinaDhierro (LIA), UREA y en el medio Sulfuro de HidrogenoD IndolDMotilidad (SIM). Para ello, se tomó suavemente la superficie y el centro de la colonia sospechosa con el asa de platino y a continuación se sembró en cada medio.El citrato se inoculó mediante una estría suave sobre la superficie, luego en TSI en profundidad y estría en superficie. La urea fue inoculada mediante una estría superficial y el tubo de Agar LIA se inoculó picando dos veces en profundidad y estría en superficie. Posteriormente se inoculó el medio SIM con asa recta picando el medio por el centro y dos terceras partes de profundidad, procurando sacar el asa por el mismo orificio. Finalmente se incubaron todos los medios utilizados a 37 ± 1° C por 24 ± 2 hrs. (Figura 11).En general se utilizaron los métodos convencionales descritos en la literatura para identificación bioquímica del genero

Figura 11. Métodos bacteriológicos para el aislamiento de sp a partir de carcasas porcinas. Batería de pruebas bioquímicas convencionales para el

5.4.1.4. Tipificación Serológica.

Para establecer el género y la especie de los microorganismos aislados se utilizaron los antisueros polivalentes y monovalentes (Difco, USA) comerciales y disponibles en el país. El método utilizado a sido ampliamente utilizado en la literatura disponible Cada aislamiento se sembró por duplicado en Agar Infusión Cerebro Corazón para realizar la tipificación somática y flagelar.

a. Prueba de aglutinación en lámina para la determinación de antigenos somáticos “O”.

Las colonias positivas para confirmadas con los perfiles bioquímicos

se repicaron en Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI) en tubo inclinado y se incubaron a 37 ± 1° C por 18D 24 ± 2 hrs.

Posteriormente se adicionaron 2.5 ± 1 ml de solución salina formolada (Anexo 8) al tubo con el microorganismo crecido y se emulsionó. Este proceso inactivó las cepa y después de una (1) hora de reposo a temperatura ambiente, se adicionó 10 Vl de la suspensión bacteriana en un portaobjetos y se agregó 10 Vl de antisuero polivalente con el fin de determinar el género de los aislamientos [“Salmonella O antisero Poly ADI and Vi” (Difco, ref. 224751)]. Después de mezclar durante dos (2) minutos se observo la presencia de flóculos con luz blanca directa, indicando la positividad.

Al lado de la muestra con su respectiva gota de antisuero siempre se utilizó un control negativo, el cual, consistió en 10 Vl de una gota de la suspensión bacteriana y 10 Vl de solución salina formolada con el fin de descartar la posibilidad de que la cepa autoaglutinara y se emitiera un resultado falso positivo.

Si la muestra aglutinaba con los sueros polivalentes se procedió enfrentar con antisueros polivalentes del grupo “Salmonella O antisuero poly A” (Difco, ref. 224722), el cual contiene los grupos somáticos A, B, D, E1, E2,E3,E4y L.

b. Prueba de aglutinación en tubo para la determinación del antígeno flagelar H (Fase 1).

A partir de uno de los cultivos de la cepa en Agar Infusión Cerebro Corazón (BHI), se inoculó con una punción de 1 cm. en agar motilidad el cual se incubó a 37 ± 1° C por 18D 24 ± 2 hrs. En caso de observarse movilidad, se tomaba una alícuota y se inoculaba en Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI) a 37 ± 1° C por 18D 24 ± 2 hrs.; si en el tubo con agar motilidad no se observaba un desplazamiento evidente se repicaba en otro tubo con el mismo medio y si fuese necesario este proceso se repetía varias veces hasta que la bacteria indujera flagelos, con algunas cepas se realizaron hasta 3 pases.

En el caldo BHI se evidenció el crecimiento por la presencia de turbidez y a continuación se adicionó solución salina formolada hasta llevar la suspensión a un concentración de 6 x 108 bacterias /ml de la escala 0.5 Mac Farland. Luego se dejó en reposo la suspensión durante una hora a temperatura ambiente.

Posteriormente, se adicionaron 500 Vl de la suspensión de BHI anteriormente descrita y 500 Vl de cada antisuero H Flagelar (Disco, USA) previamente diluido según la recomendación de la casa comercial. (8.23 ml de solución salina y 100 Vl del antisuero). El Kit Spicer Edwards contiene cuatro tubos 1, 2 ,3 4 (Anexo 7), para la detección del antígeno flagelar de cada aislado.

En el tubo control se agregaron 500 Vl de solución salina formolada y 500 Vl de la cepa para evitar autoaglutinaciones. Luego se llevó a incubación en baño serológico a 50± 1ª C durante 1 hora, evitando cualquier agitación.

Transcurrido este tiempo se realizó la lectura con luz blanca directa determinando positividad con la presencia de flóculos en el fondo de la suspensión y la aglutinación se registró mediante la tabla de “Reacciones de los Salmonella H Antisera Spicer Edwards” (Anexo 7) para identificar la Fase flagelar 1 de cada aislamiento

c. Prueba de aglutinación en lámina para la determinación de antígenos somáticos “O” específicos por serogrupo.

A partir de la identificación del serogrupo y la determinación de los antígenos específicos en el esquema de KauffmanDWhite (Anexo 9) se seleccionaron los antisueros con los que se debía enfrentar el aislado para ubicarlo en un serotipo mediante su evaluación frente a los antisueros monovalentes con el fin de determinar la presencia de un antígeno especifico y la especie de las cepas aisladas.

Para ello, se adicionaron 10 Vl de la suspensión bacteriana (cepa en agar BHI inactivada con solución salina formolada) en un portaobjetos y 10 Vl de antisuero monovalente (Difco) y después de mezclar durante dos (2) minutos con luz blanca directa se observo la presencia de flóculos.

d. Prueba de aglutinación en tubo para la determinación del antígeno flagelar H (Fase 2).

A partir de la suspensión inactivada suspendida en BHI se tomaron 500 Vl y se adicionaron 500 Vl del antisuero H (Difco), posteriormente se incubó en baño serológico a 50± 1ª C durante 1 hora, evitando cualquier agitación.

e. Determinación de serotipo de las cepas aisladas

A partir de los resultados obtenidos del grupo y antígenos somáticos “O” (Fase somática), Fase flagelar 1 y Fase flagelar 2 de cada cepa aislada mediante el

esquema de KauffmanDWhite (Anexo 9) se determino la formula antigénica

especifica para cada cepa.

5.4.1.6 PRUEBA DE SENSIBILIDAD ANTIMICROBIANA.

A partir de las colonias que cumplieran con las pruebas bioquímicas características

para sp. se realizó una resuspensión en solución salina fisiológica,

ajustándose visualmente a una turbidez equivalente a 0,5 en la escala de Mac Farland.

En el anexo 11., se presentan los quince (15) antibióticos empleados en este estudio. Mediante los parámetros de resistencia y sensibilidad de sp frente a cada antibiótico se determino la eficiencia de cada uno.

En agar muellerDhinton, se dispusieron los antibióticos (en forma de sensidiscos)

mediante el dispensador automático en ángulos opuestos de 60° aprox. A

continuación cada placa se incubó a 37° C durante 18 D24 horas, la lectura se hizo midiendo el halo de inhibición de crecimiento (mm) y revisando la tabla de comparación entre los resultados obtenidos con los datos de la casa productora (Anexo 11).

6. RESULTADOS