Considerando nuestros resultados con respecto a las funciones de las isoformas de AKT en la adhesión, extensión y migración celular, evaluamos la interacción de isoformas con sustratos implicados
en la regulación de éstas características fenotípicas. Para ello, en primer lugar inmunoprecipitamos las isoformas 1 y 2 de AKT en células PC-3 y analizamos su interacción con FAK y con la subunidad p85 de PI3K.
Nuestros resultados (figura 63) indican que únicamente AKT1 interactúa habitualmente tanto con FAK como con p85.
Figura 63:Interacciones proteicas diferenciales de las isoformas de AKT.Se sembraron células PC-3, se lisaron y los extractos proteicos obtenidos (1 mg) se inmunoprecipitaron con un anticuerpo anti-AKT1 ó anti-AKT2 según se describe en el apartado de Materiales y Métodos. Como control de unión inespecífica se utilizó el soporte (proteína G-sepharosa) sin anticuerpo primario (carril indicado como “G” en la figura). Los inmunocomplejos fueron analizados mediantewestern blotutilizando anticuerpos anti-FAK ó anti-p85. La imagen muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes.
Dado que observamos que SHP-1 interacciona con AKT1 y regula su actividad, nos interesó eva- luar si la ausencia de SHP-1 podría afectar dichas uniones. Para ello, transfectamos células PC-3 con un siRNA control ó un siRNA específico para SHP-1 y posteriormente inmunoprecipitamos AKT1, eva- luando la presencia de FAK ó p85. En éstos experimentos además incluimos a Src, con el objeto de confirmar la existencia de plataformas de señalización.
Regulación de la vía PI3K/AKT por la fosfotirosina fosfatasa SHP-1.
Figura 64:Papel de SHP-1 en la regulación de interacciones proteicas diferenciales de AKT1.Las células PC-3 fueron trans- fectadas con un siRNA específico para SHP-1 ó una secuencia control. Tras 72 horas se inmunoprecipitó 1 mg de proteína utilizando un anticuerpo anti-AKT1 y cómo control de unión inespecífica se utilizó proteína G-sepharosa sin anticuerpo primario (indicado como “G” en la figura). Los inmu- nocomplejos fueron analizados mediantewestern blotutilizando anticuerpos anti-FAK ó anti-p85. La imagen muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes.
Como observamos en la figura 64A, tras el silenciamiento de SHP-1, la interacción entre AKT1 y FAK disminuye. Una disminución aún mas notable se observa en la figura 64B, donde la interferencia por ARN de SHP-1, provoca una drástica bajada de los niveles de p85 unidos a AKT1. Por otra parte, como vemos en la figura 64C, la unión entre Src y AKT1 no parece modificarse en ausencia de SHP-1.
Efecto del silenciamiento de SHP-1 sobre la actividad de FAK y Src.
Hemos visto la formación de complejos de señalización en torno a AKT1, que incluyen a p85, FAK y Src. También hemos demostrado su desorganización bajo el silenciamiento de SHP-1. Dado que la ausencia de SHP-1 provoca una disminución de la actividad quinasa de PI3K, nos planteamos evaluar los efectos biológicos sobre los otros dos componentes implicados en ésta plataforma de señalización: FAK y Src. Para ello, sembramos células PC-3 y las transfectamos con un siRNA específico para SHP- 1. Tras 72 horas de silenciamiento, evaluamos los niveles de fosforilación en los residuos de activación de FAK (tirosina 397) y Src (tirosina 419).
Figura 65:Efecto del silenciamiento de SHP-1 sobre la actividad de FAK y Src.Las células PC-3 fueron transfectadas con un siRNA específico para SHP-1 ó una secuencia control. Tras 72 horas se evaluó mediantewestern blotlos niveles de fosforilación de los residuos indicadores de activación de FAK (tirosina 397) y de Src (tirosina 419), utilizando como controles de carga los niveles proteicos totales de cada una de ellas. También se evaluó la fosforilación de la tirosina 530 de Src. En la figura se incluye además un control del silenciamiento de SHP-1 alcanzado. La imagen muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes.
Como se observa en la figura 65 la anulación de SHP-1 provocó una disminución de un 60 % en los niveles de fosforilación de FAK en su residuo de activación (tirosina 397). Con respecto a Src, la ausencia de SHP-1 provocó un aumento en los niveles de fosforilación tanto de la tirosina 419 (residuo “activador” de Src) como de la tirosina 530 (cuya fosforilación provoca la inhibición de Src). Dada ésta situación nos planteamos analizar la actividad enzimática de Src mediante un ensayo quinasa radiactivo.
Figura 66:Efecto del silenciamiento de SHP-1 sobre la actividad quinasa de Src.Las células PC-3 fueron transfectadas con un siRNA específico para SHP-1 ó una secuencia control. Tras 72 horas se inmunoprecipitó Src y se evaluó su actividad quinasa sobre un sustrato artificial (RaytideT M) utilizando fósforo radiactivo. La imagen muestra un experimento representativo de 3 experimentos independientes (* p<0,05
versus SC).
Regulación de la vía PI3K/AKT por la fosfotirosina fosfatasa SHP-1.
significativo de más de un 100 % en la actividad quinasa de Src, con respecto al control.
Estos resultados demuestran que AKT1 interacciona con FAK, p85 y Src constituyendo una platafor- ma de señalización celular cuya composición está regulada por SHP-1. La ausencia de ésta fosfatasa provoca una desorganización de éste complejo, desprendiéndose del mismo tanto FAK como p85 a la par que se observa una disminución en la activación de ambas. Sin embargo, Src permanece unido a AKT1 y su actividad quinasa se ve aumentada.
Papel diferencial de las isoformas de AKT en el control de la proliferación celular.