La vía de PI3K/AKT ha sido ampliamente estudiada por sus implicaciones en el desarrollo de neo- plasias. En éste sentido, actualmente se empieza a reconocer la existencia de funciones biológicas no redundantes ejercidas por las isoformas de AKT que inciden directamente en la progresión tumo- ral138, 143, 176. Para profundizar en este estudio, nos planteamos analizar los efectos del silenciamiento de isoformas de AKT sobre algunas características fenotípicas fundamentales en el desarrollo tumoral, como la proliferación, la adhesión ó la migración, utilizando la línea celular PC-3, que constituye un modelo de estudio de metástasis prostática. Utilizamos ARN pequeños de interferencia (siRNA) para alcanzar dicho silenciamiento dirigidos contra cada una de las isoformas de AKT ó bien una secuencia control que no inhibe la expresión de ninguna proteína (SC).
Figura 30:Efectos del silenciamiento de isoformas de AKT sobre la proliferación celular en células PC-3.Se transfectaron células PC-3 con un siRNA control (SC) ó un siRNA específico para isoformas de AKT (1, 2 ó 3).(A)Tras 72 horas de transfección se analizaron los niveles de cada isoforma de AKT utilizándose como control de cargaβ-tubulina. Bajo ésta condición se contó el número de células(B)y se realizaron estudios de incorporación de timidina tritiada para cuantificar la síntesis de ADN(C). Los gráficos representan los valores promedios ± DEM de tres experimentos independientes (*p<0,05; **p<0,01; **p <0,001versusSC).
Como se muestra en la figura 30A, tras 72 horas de transfección la interferencia por ARN provocó una disminución de la expresión de las tres isoformas de AKT superior al 90 %, con respecto a los nive- les proteicos observados en el control. En la misma figura se observa que las anulaciones alcanzadas,
mediante las secuencias empleadas, son específicas de cada isoforma, sin afectar la expresión de las restantes.
Tras comprobar la eficacia de los diferentes siRNA, nos planteamos analizar si esta disminución afecta al crecimiento de las células PC-3. Para ello, tras 72 horas de transfección, levantamos las cé- lulas de su soporte de plástico y contamos su número total, tanto en la situación control como bajo la anulación de cada isoforma.
Como se aprecia en la figura 30B, el silenciamiento de cualquiera de las isoformas provoca una disminución en el número de células totales: bajo la anulación de AKT1 ó AKT2 se observa alrededor de un 50 % menos de células con respecto al control, en tanto que al silenciar la isoforma 3 observamos una reducción estadísticamente significativa de un 15 % aproximadamente.
También analizamos la síntesis de ADN en las células PC-3, cuantificando la incorporación de timi- dina tritiada. Observamos (figura 30C) que al silenciar AKT1 se produce una disminución en la incorpo- ración de dicho marcador de un 67 % con respecto al control, en tanto que la disminución es del 85 % al inhibir AKT2. Con respecto a la anulación de AKT3 observamos una disminución de un 35 % en la incorporación de timidina, diferencia que no resultó ser estadísticamente significativa.
Estos datos indican que la disminución de los niveles de cualquiera de las tres isoformas de AKT provoca la inhibición de la proliferación de las células PC-3, aunque esta menor proliferación se observa principalmente al anular AKT1 y AKT2.
Posteriormente quisimos estudiar la distribución de las células en las distintas fases del ciclo celular, mediante ensayos de citometría de flujo.
Papel de las isoformas de AKT en la proliferación celular.
Figura 31:Efectos de la anulación de isoformas de AKT sobre la distribución del ciclo celular.Se transfectaron células PC-3 con un siRNA control (SC) ó un siRNA específico para isoformas de AKT (1, 2 ó 3). Tras 72 horas de transfección se analizó la distribución celular en las distintas fases del ciclo celular mediante citometría de flujo. Se muestran los perfiles de citometría, así como los valores de un experimento representativo de tres experimentos independientes.
Como se observa en la figura 31, la anulación de las isoformas 1 ó 3 no afecta la distribución de las células entre las fases del ciclo celular. Sin embargo, el silenciamiento de la isoforma 2 provocó una parada en la fase G0/G1 del ciclo celular: se observa que al anular dicha isoforma el porcentaje de células en fase G0/G1 aumenta al 68 % con respecto al 42 % observadas en el control (lo cual supone un aumento del 62 %, estadísticamente significativo). Además, el número de células en fase S disminuye al 18 %, con respecto al 30 % observado en las células control (un descenso del 40 %).
Con el fin de confirmar que éstos resultados no se producen como consecuencia de un incremento en la muerte celular, se realizaron ensayos de incorporación de la sonda TMRM.
Figura 32:Efectos de la inhibición de isoformas de AKT sobre la supervivencia celular.Se transfectaron células PC-3 con un siRNA control (SC) ó un siRNA específico para isoformas de AKT (1, 2 ó 3). Tras 72 horas de transfección se analizó la supervivencia celular mediante la incorporación de la sonda TMRM. Los datos representan los valores promedios normalizados de la mediana geométrica de fluorescencia ± DEM de tres experimentos independientes (NS p>0,05versusSC).
Como se observa en la figura 32, los resultados obtenidos indican que, tras 72 horas de silencia- miento de las distintas isoformas de AKT, las células PC-3 no sufren un incremento estadísticamente significativo de la muerte celular.
En conjunto, éstos resultados indican que la inhibición de la proliferación celular inducida por la anu- lación de AKT2, pero no la de AKT1 ó AKT3, se debe a una parada en G0/G1, poniendo de manifiesto que ésta isoforma ejerce un papel clave en el control del ciclo celular.
Considerando los datos obtenidos anteriormente, en los que demostramos que la isoforma 3 no parece desempeñar un papel relevante en el control de la proliferación y en conjunción con diversas cuestiones técnicas y metodológicas, a partir de ésta observación nos centramos en el estudio del papel de las isoformas AKT1 y AKT2.