5 EL REOVIRUS AVIAR ES RESISTENTE AL PRETRATAMIENTO DE LAS CÉLULAS CON IFN

Los ARVs son muy resistentes al pretratamiento de las células con IFN cuando se comparan con otros virus (Ellis et al., 1983), lo que, sumado a que son buenos inductores de la producción de IFN, sugiere que poseen mecanismos para replicar en presencia de un estado antiviral, latente o activo. En este trabajo hemos comprobado que durante la infección con ARV de células aviares pretratadas con IFN no se detecta la forma hiperfosforilada de PKR, ni un incremento acusado en los niveles de fosforilación de eIF2, aunque no se puede descartar que se genere una forma de PKR poco activa o que sólo se active una pequeña fracción de esta quinasa.

El grado de activación de PKR en células infectadas con otros reovirus varía según el virus y cepa estudiados. En rotavirus se observa desde las primeras horas de infección un aumento en el grado de fosforilación de eIF2 que se mantiene durante toda la infección, por un mecanismo mediado por PKR (Rojas et al., 2010) y dependiente de la presencia de las proteínas VP2, VP6, NSP2 y NSP5 (Montero et al., 2008). Se ha planteado que esta activación se debe a la presencia de acúmulos de dsRNA en el citoplasma celular que no parecen corresponderse con estructuras secundarias de los mRNA virales (Rojas et al., 2010). En este trabajo, hemos estudiado la distribución del dsRNA en células infectadas con ARV y no hemos detectado dsRNA accesible fuera de los cuerpos de inclusión, dado que los puntos que detectamos en el citoplasma colocalizan con la proteína A, indicando que, o bien se trata de cores, o bien el dsRNA se encuentra recubierto por esta proteína, por lo que no debería ser accesible a PKR.

En células infectadas con MRV el grado de activación de PKR depende de la cepa empleada. Se cree que la distribución de la proteína de unión a dsRNA 3

139 condiciona el estado de activación de esta quinasa: si se encuentra en el citoplasma además de en las inclusiones, inhibe la activación de PKR y fosforilación de eIF2a nivel global, mientras que si se concentra en las inclusiones, sólo se inhibe la activación de PKR en el entorno de la inclusión, permitiendo que se mantenga la síntesis de proteínas virales (Schmechel et al., 1997). En el caso del ARV, las inmunofluorescencias muestran que la proteína de unión a dsRNA A no se concentra exclusivamente en las inclusiones y mediante fraccionamiento subcelular se había comprobado que no toda la proteína sintetizada se incorpora inmediatamente a los cuerpos de inclusión y que gran parte permanece en la fracción soluble (Tourís-Otero et al., 2004a). Esto asemejaría a ARV con las cepas de MRV en las que no se activa PKR ni se induce shutoff de las proteínas celulares, aunque en nuestro caso habría shutoff sin activación detectable de PKR.

Por otra parte, nuestros resultados mostraron que la traducción de los mRNAs de ARV es resistente a la fosforilación de eIF2 inducida por DTT. Existen virus cuyos mensajeros se traducen en presencia de eIF2 fosforilado, lo que consiguen interaccionando con el ribosoma a través de estructuras complejas de sus mRNAs (Mohr y Sonenberg, 2012). No se ha descrito por el momento ninguna estructura de este tipo en miembros de la familia Reoviridae, si exceptuamos la región complementaria al rRNA 18S presente en el mRNA s1 de ARV y necesaria para la traducción eficiente del tercer cistrón (Racine y Duncan, 2010). Otro mecanismo que podría permitir la traducción de mRNAs en presencia de eIF2 fosforilado consiste en interferir con la formación de los gránulos de estrés (SGs) que induce la fosforilación de este factor. Los SGs son acumulaciones de mRNAs, complejos de preiniciación de la traducción y otras proteínas que se generan en respuesta a ciertos estímulos de estrés y en los que se almacenan los mRNAs sin traducir a la espera de que se reanude la traducción o sean degradados (White y Lloyd, 2012). Algunos virus de la familia Reoviridae, como MRV y rotavirus interfieren con la formación de los SGs para permitir la traducción de las proteínas virales. En el caso de MRV, la infección provoca la formación de SGs a tiempos tempranos de infección que van despareciendo conforme progresa la infección, aunque se sigan manteniendo niveles altos de eIF2 fosforilado (Qin et al., 2011). Por otra parte, en células infectadas con rotavirus se inhibe la formación de SGs desde el inicio de la infección, pese a que los niveles de fosforilación de eIF2 son elevados(Montero et al., 2008). Es posible que alguna proteína del ARV sea capaz de impedir la formación

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de los SGs y que por ello no se produzca una inhibición tan acusada de la síntesis de proteínas virales y celulares en las células infectadas cuando se induce la fosforilación de eIF2 con DTT.

Sin embargo, pese a que el virus es resistente al pretratamiento con IFN, es capaz de inhibir la activación de PKR y de sintetizar proteínas en presencia de eIF2 fosforilado, la replicación de ARV se ve muy perjudicada si PKR está activada desde el inicio de la infección, como ocurre cuando las células se someten a un tratamiento secuencial con IFN y dsRNA previo a la infección (Marcus y Sekellick, 2001). Esto sería consistente con un modelo en el que es necesaria la acumulación de una cierta cantidad de proteínas virales para impedir la activación de PKR y los efectos perjudiciales de la fosforilación de eIF2, mientras que una activación de PKR desde el inicio de la infección inhibiría la síntesis de proteínas virales.

6.- EL PAPEL DE LA PROTEÍNA A DEL REOVIRUS AVIAR EN LA RESISTENCIA AL IFN

Anteriormente se habían obtenido pruebas indirectas de que la proteína A de ARV es capaz de prevenir la activación de PKR (González-López et al., 2003; Martínez- Costas et al., 2000). En este trabajo se ha estudiado de forma directa los efectos de la expresión de esta proteína sobre la activación de PKR y la fosforilación de eIF2. Hemos observado que la expresión de A por el virus recombinante WRS2 inhibe la activación de PKR y rescata la replicación del virus en células aviares pretratadas con IFN. Por otra parte, la proteína A también es capaz de reducir la activación de PKR en células transfectadas con el dsRNA sintético poli(I:C).

La proteína A es una proteína que une fuertemente dsRNA de manera independiente de secuencia (Martínez-Costas et al., 2000; Tourís-Otero et al., 2005; Yin et al., 2000) y en este trabajo se han aportado evidencias experimentales de que su capacidad para unir dsRNA es necesaria para que pueda inhibir la activación de PKR. Además, parece que la inhibición de PKR depende únicamente de su capacidad para secuestrar dsRNA, ya que no se ha detectado interacción directa de A con la PKR aviar mediante doble híbrido o por inmunofluorescencia (resultados no mostrados). Sin embargo, no puede descartarse que las etiquetas añadidas en el sistema del doble híbrido estén afectando a la interacción de ambas proteínas, o que interaccionen únicamente en

141 algún compartimento celular específico, dado que existen muchas proteínas virales de unión a dsRNA que también interaccionan con PKR.

La inhibición de la activación de PKR mediante el secuestro del dsRNA es una estrategia muy utilizada por los virus. Los MRVs poseen otra proteína de unión a dsRNA que no es homóloga a la proteína A de ARV, la proteína 3 de la cápside externa (Bergeron et al., 1998; Imani y Jacobs, 1988; Schmechel et al., 1997). Es llamativo que ambos virus hayan desarrollado de manera independiente proteínas para secuestrar dsRNA, lo que enfatiza la importancia que tiene el secuestro de dsRNA para el desarrollo del ciclo replicativo de estos virus.

En la siguiente tabla se indican otras proteínas virales de unión a dsRNA que inhiben la activación de PKR:

Virus Proteína Observaciones Referencias Vaccinia E3L Requiere tanto la unión

a dsRNA como a PKR

Chang et al., 1992; Romano et al., 1998b

Reovirus 3 Imani y Jacobs, 1988

Rotavirus porcino NSP3 Langland et al., 1994

Influenza A NS1

Puede inhibir la activación de PKR mediante interacción directa aunque no una dsRNA.

Li et al., 2006

Virus Herpes

Simplex (HSV) US11

Une dsRNA, pero también interacciona directamente con ella.

Peters et al., 2002; Poppers et al., 2000 Citomegalovirus

humano (HCMV) TRS1

Requiere tanto la unión

a dsRNA como a PKR Bierle et al., 2013 Citomegalovirus

murino (MCMV) m142/143 Child et al., 2006

Virus Ébola

(EBOV) VP35

Puede inhibir la activación de PKR aunque no una dsRNA.

Feng et al., 2007; Schümann et al., 2009 Virus de Epstein

Barr (EBV) SM

Requiere tanto la unión

a dsRNA como a PKR. Poppers et al., 2003 Coronavirus de

oriente medio (MERS)

4a

Une dsRNA e

interacciona con PACT, inhibiendo a RLRs, no se ha descrito lo que ocurre con PKR. Niemeyer et al., 2013; Siu et al., 2014 Virus de la bursitis

infecciosa (IBDV) VP3 Busnadiego et al., 2012

Tabla 4. Proteínas virales de unión a dsRNA que inhiben a PKR. Se indican también los casos en los que

se ha descrito interacción directa con PKR o con su activador PACT. Modificado de Randall y Goodbourn, 2008

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La expresión de proteínas virales de unión a dsRNA no sólo permitiría a los virus prevenir la activación de PKR, sino que también podría impedir la activación de los sistemas OAS/RNasaL y los basados en RNA interferente, además de reducir la apoptosis o dificultar la detección del virus por los PRRs celulares (Randall y Goodbourn, 2008), aunque en ocasiones estas proteínas sólo son capaces de inhibir eficazmente uno de estos sistemas.