Sec4

Una de las Rab GTPasas mejor caracterizadas es la Sec4p de S. cerevisiae, proteína homóloga de la Rab8 en mamíferos, la cual tiene un rol esencial en la regulación del tráfico de vesículas secretoras desde Golgi hacia la membrana plasmática y en eventos previos a la exocitosis (Salminen and Novick, 1987; Kabcenell et al., 1990; Walworth et al., 1992; Guo et al., 1999; Novick et al., 2006); aunque también se encuentra involucrada en procesos de autofagia y endocitosis (Geng et al., 2010; Kean et al., 1993). El inicio de la actividad reguladora de Sec4p está basado en dos eventos anteriores: 1) El reclutamiento de la GEF Sec2p por la Rab Ypt32p (Ortiz et al., 2002) y 2) la activación de Sec4p por Sec2p mediante la liberación de GDP unida a Sec4p para su unión con GTP (Walch-Solimena et al., 1997). Sec4p se une a las membranas de las vesículas a través de los grupos prenilo ubicados en el extremo carboxilo terminal de la proteína (Goud et al., 1988; Newman and Magee, 1993; Calero et al., 2003).

1.3.7.1 Reguladores de Sec4

Estudios relacionados al funcionamiento de la Rab GTPasa Sec4p han permitido identificar moléculas reguladoras de su actividad. La proteína GDI de S. cerevisiae

Gdi1p tiene un rol esencial en la estabilización de Sec4p unido a GDP, además participa en la regulación de la extracción membranal de Sec4p-GDP (Garrett et al.,

1994; Garrett et al., 1993). La actividad de Sec4p es regulada por proteínas GAP como Gyl1p y Gyp5p las cuales forman un complejo en la membrana plasmática de

S. cerevisiae; análisis in vitro demostraron que ambas GAPs interactúan con Sec4p posiblemente regulando su actividad exocítica en sitios de crecimiento polarizado. La doble mutante gyl1gyp5presentó defectos en la secreción y la acumulación de vesículas secretoras (Chesneau et al., 2004). Defectos similares presentó la doble mutante msb3msb4, y se demostró que estas proteínas GAP (Msb3p y Msb4p) interactúan in vivo con Sec4p (Gao et al., 2003). Gdi1p es una proteína GDI involucrada en el reciclaje de Sec4-GDP desde la membrana plasmática hacia el complejo de Golgi o membranas vesiculares a través del citoplasma (Garrett et al., 1994).

El cambio al estado activo de Sec4p es inducido por dos proteínas, la Dss4p que favorece la remoción de GDP unida a Sec4p y su estabilización en ese estado libre de nucleótidos y la GEF Sec2p que favorece el intercambio de GDP por GTP en Sec4p (Moya et al., 1994; Collins et al., 1997; Itzen et al., 2007; Strick et al., 2002; Walch-Solimena et al., 1997). Estudios iniciales en mutantes Sec15p de S. cerevisiae

revelaron una posible interacción entre Sec15p, Sec4p y Sec2p en donde estas últimas participan río arriba de Sec15p (Salminen and Novick, 1989). Posteriormente se identificó que Sec2p participaba de manera directa en el intercambio de GTP- GDP de Sec4p, definiendo a Sec2p como GEF de la Rab GTPasa, ubicando su actividad en etapas iniciales del tráfico vesicular de Golgi hacia la membrana; además se determinó que la interacción de ambas proteínas ocurre en la membrana de vesículas secretoras (Elkind et al., 2000; Walch-Solimena et al., 1997). El reclutamiento de Sec2p en vesículas secretoras es favorecido por la interacción directa con la Rab Ypt32p en su estado activo, permitiendo el intercambio de GDP por GTP en Sec4p en el proceso de regulación de tráfico vesicular post-Golgi hacia la membrana plasmática (Ortiz et al., 2002). La interacción del complejo GEF-Rab- Efector favorece el estado activo de la Rab-GTP en sitios específicos de la membrana, asegurando el reclutamiento y la regulación de otros componentes necesarios para el tráfico vesicular; Un ejemplo de esto es la interacción de Sec4p con Sec2p, Myo2p, Sec15p, Sro7p (Grosshans et al., 2006b; Walch-Solimena et al., 1997; Guo et al., 1999; Medkova et al., 2006; Grosshans et al., 2006a). Ypt32p y

Sec15p interactúan secuencialmente con Sec2p, y compiten por el mismo dominio de unión con Sec2p (Medkova et al., 2006). Esta interacción parece estar regulada por el PI4P (Fosfatidilinositol 4 Fosfato); se propone que las altas concentraciones de PI4P en Golgi inhiben la interacción de Sec2p con Sec15p, permitiendo el reclutamiento membranal de Sec2p por Ypt32p. La baja concentración de PI4P en las vesículas permiten el reemplazamiento de Ypt32p por Sec15p, asegurando un mecanismo de retroalimentación positiva a través del reclutamiento de Sec2p para activar a Sec4p en los sitios de exocitosis (Mizuno-Yamasaki et al., 2010).

1.3.7.2 Efectores de Sec4

En la membrana vesicular Sec4p unido a GTP interactúa con distintos efectores los cuales finalmente definen sus funciones de regulación. El Exocisto por ejemplo, es un complejo ancla hetero-octamérico reclutado por la forma activa de Sec4p en sitios específicos de la membrana plasmática donde participa en el anclaje “tethering” de las vesículas. En S. cerevisiae, se ha demostrado que Sec15p, subunidad del Exocisto, tiene una interacción directa con Sec4p en su forma activa, interacción importante para el reclutamiento del complejo (TerBush et al., 1996; Lipschutz and Mostov, 2002; Guo et al., 1999). La interacción Sec15p-Sec4p está regulado por la asociación directa de Sec2p con Sec15p, acoplando la activación de Sec4p y el reclutamiento del Exocisto (Medkova et al., 2006; Mizuno-Yamasaki et al., 2012). Otro efector identificado de Sec4p incluye a la proteína Sro7p la cual es miembro de la familia de proteínas lgl (lethal giant larvae) supresoras de tumores. Sec4p, Sro7p y la t-SNARE (target-associated SNARE) Sec9p se han identificado formando un complejo proponiendo una regulación indirecta de Sec4p en la fusión vesicular (Brennwald et al., 1994; Grosshans et al., 2006a).