en N. crassa, se etiquetó a la proteína en el extremo amino terminal con la proteína GFP. Las imágenes de microscopía confocal a bajo aumento revelaron una acumulación de YPT-1 en la región apical y subapical proximal de las hifas (Fig. 16A). En la región apical se identificó a GFP-YPT-1 en el Spitzenkörper de todas las hifas vegetativas en crecimiento (Fig. 16B, flecha, panel 1), mientras que en regiones distales no se observó a GFP-YPT-1 en sitios de formación de septos (Fig. 16C). Inicialmente se analizó la expresión de GFP-YPT-1 bajo el control del promotor reprimible por glucosa Pccg-1, anteriormente llamado grg-1 (McNally and Free, 1988). Aunque Pccg-1 ha sido ampliamente utilizado para los análisis de localización de proteínas etiquetadas con proteínas fluorescentes en N. crassa, su utilización ha generado controversia ya que algunos autores consideran que este promotor genera niveles muy altos de expresión, clasificándolo como un promotor fuerte. Como consecuencia se ha especulado que la expresión regulada por este promotor genera artefactos. Para descartar que la distribución subcelular de GFP-YPT-1 bajo control del promotor ccg-1 pudiera deberse a un efecto del promotor, se expresó GFP-YPT- 1 bajo el control del promotor propio del gen ypt-1, Pypt-1. No se encontraron diferencias en la distribución subcelular de GFP-YPT-1 expresado bajo el control del promotor ccg-1 o el promotor propio (Fig. 16B, panel 2). Para confirmar que GFP- YPT-1 se estuviera expresando a niveles similares con ambos promotores se determinó por Western blot la concentración del constructo expresado bajo control del promotor Pccg-1 (en presencia de sacarosa en el medio) y bajo control del promotor Pypt-1. No se observaron diferencias en los niveles de expresión de GFP- YPT-1 bajo el control de ambos promotores (Fig. 16D). Por lo tanto, la mayoría de los análisis se realizaron con la cepa que expresa GFP-YPT-1 con el promotor Pccg- 1.
Figura 16. Distribución subcelular y análisis de la expresión bajo el control de los promotores Pccg-1 y Pypt-1 de la Rab GTPasa YPT-1 en hifas en crecimiento de Neurospora crassa.
A. El análisis a bajo aumento por LSCM mostró la acumulación de GFP-YPT-1 en distintas regiones de las hifas en crecimiento teñidas con FM4-64. GFP-YPT-1 se observó principalmente en regiones apicales como fluorescencia dispersa en el citoplasma (cabezas de flecha) y en regiones subapicales se detectó a YPT-1 en estructuras puntuales a lo largo de las hifas. Nótese la acumulación de GFP-YPT-1 en estructuras pleomórficas citoplasmáticas en la región subapical distal de la hifa (recuadro). Barra, 20 μm.
B. Panel 1: El análisis a mayor aumento por LSCM mostró la acumulación de GFP-YPT-1 expresada bajo el control del promotor Pccg-1 en el núcleo (región microvesicular) del Spitzenkörper (flecha), pero además se observó en numerosas estructuras puntuales posiblemente cisternas de Golgi (cabezas de flecha). Barra, 10 μm. Panel 2: El análisis por LSCM mostró la distribución subcelular de GFP-YPT-1 expresado bajo el control del promotor Pypt-1, mostrando un patrón de localización similar al de las hifas que regulan la expresión de GFP-YPT-1 con el promotor reprimible por glucosa Pccg-1 (McNally and Free, 1988). Barra, 5 μm.
C. Los análisis de series de tiempo por LSCM de hifas teñidas con FM4-64 mostraron la ausencia de GFP-YPT-1 en septos en formación. Barra, 5 μm.
D. Western blot de extractos celulares (carga de 40 μg/ml de proteína total equivalente a BSA), inmuno-detectado con anti-GFP, de las cepas que expresan GFP-YPT-1 bajo el control de los promotores Pccg-1 y Pypt-1 (n= 3). En el panel inferior se muestra el control de carga inmuno- detectado con anti-β-actina.
Para analizar a detalle la distribución de YPT-1 en el Spitzenkörper se utilizó el marcador lipofílico FM4-64, el cual se ha utilizado ampliamente para el marcaje de estructuras membranosas y el Spitzenkörper (Fischer-Parton et al., 2000; Hickey et al., 2002). Se observó que la tinción con FM4-64 se limitó a la región macrovesicular del Spitzenkörper, circundando la región de distribución de GFP-YPT-1 (Fig. 17A, panel 1). En estudios anteriores se determinó que en N. crassa las enzimas encargadas de la biosíntesis de quitina se encuentran en los quitosomas, los cuales se distribuyen en la región microvesicular del Spitzenkörper (Riquelme et al., 2007; Fajardo-Somera, 2013; Sánchez-León et al., 2011). Para determinar si YPT-1 podría estar asociado con la población de quitosomas se analizó el patrón de distribución de GFP-YPT-1 y CHS-1-GFP en el Spitzenkörper de una cepa heterocarionte que expresaba ambas proteínas recombinantes. Ambas proteínas co-localizaron en el núcleo del Spitzenkörper (Fig. 17A, panel 2). En estudios previos también se identificó a GS-1, proteína relacionada a la síntesis de -(1,3) glucanos en N. crassa, confinada a la región más externa del Spitzenkörper (Verdín et al., 2009), la cual coincide con la distribución de macrovesículas observadas por microscopía electrónica de transmisión (Grove and Bracker, 1970; Howard, 1981). Para confirmar la exclusión de YPT-1 de la región macrovesicular se analizó la localización de GS- 1-GFP y mChFP-YPT-1 en una cepa heterocarionte que expresaba ambas construcciones. Se observó claramente que tanto GS-1-GFP como mChFP-YPT-1 ocupaban distintos estratos del Spitzenkörper (Fig. 17A, panel 3). El análisis por Western blot de las fracciones obtenidas por gradientes de densidad (10-65%) mostraron la presencia de GFP-YPT-1 (banda de 50 kDa) en todas las fracciones, aunque las más altas concentraciones se encontraron en las fracciones 10 a 12, las cuales tenían un rango de densidad de 1.119 a 1.138 g/ml (Fig. 17B).
Figura 17. Asociación de la Rab GTPasa YPT-1 con una sub-población de vesículas del