Los procesos desarrollados en los biorreactores son muy sensibles a la contaminación. La mayoría de los microorganismos utilizados en la industria alimentaria, farmacéutica, cosmética o de biocombustibles crecen de forma óptima bajo sustrato de glucosa y a temperaturas entre 20-30ºC en microorganismos mesófilos, y 35-65ºC en microorganismos termófilos. En estas condiciones cualquier célula que se introduzca en el interior del reactor crecerá con las células deseadas provocando una enorme competencia, e incluso producir sustancias químicas inhibidoras del proceso objetivo. Las células contaminantes pueden crecer a velocidad mayor que las no contaminantes. Esto nos obliga a tener especial cuidado en el diseño para conseguir condiciones de asepsia, e introducir un sistema de desinfección o esterilización en el biorreactor.
Se denomina desinfección o sanitización a la reducción significante del número de células mediante una limpieza cuidadosa, que lleve la población microbiana a niveles no perjudiciales para el proceso. Se denomina esterilización a la eliminación o destrucción completa de todos los microorganismos presentes, capaces de competir con el organismo deseado en las condiciones de cultivo.
Antes de la carga del biorreactor con el sustrato es necesario esterilizar el interior de los equipos y de las conducciones. Posteriormente se debe esterilizar el propio sustrato bien en un esterilizador a parte o bien en el interior del propio reactor. Sólo en esas circunstancias se puede proceder a la inoculación de la cepa objetivo.
53 Existen cinco sistemas que se pueden utilizar en la esterilización de un biorreactor. Éstos son los siguientes:
‐ Esterilización química ‐ Esterilización por filtración ‐ Esterilización por radiación ‐ Esterilización por calor
‐ Esterilización por calor húmedo
Esterilización química
Existen multitud de sustancias químicas nocivas para las células que nos permiten esterilizar las conducciones y los equipos, como bombas, sensores, interior del reactor, etc. Tras la aplicación del agente químico es necesario un enjuague profundo para el arrastre de los contaminantes, generalmente con agua esterilizada caliente. Las sustancias químicas no son aplicables para esterilización del sustrato. Los compuestos químicos más usados son los siguientes:
‐ Alcoholes, el grupo OH en solución acuosa libera protones que penetran las membranas celulares provocando la acidificación del citoplasma y disrupción de membranas. Generalmente se utilizan soluciones acuosas al 70% de etanol. ‐ Ácidos orgánicos como ácido sórbico, ácido benzoico o propinato cálcico.
Actúan de forma muy semejante a los alcoholes, provocan disrupción de membranas y desactivación de proteínas. Son comunes en la preservación de alimentos.
‐ Compuestos fenólicos: Actúan del mismo modo provocan disrupción de membranas y desactivación de proteínas.
‐ Compuestos con amonios cuaternarios. Son agentes catiónicos. Deben trabajar a concentraciones elevadas y no son totalmenmte eficaces contra endosporas, Mycobacterium tuberculosis y Pseudomonas spp.
‐ Agentes oxidantes: Ozono, hipoclorito, peróxido de hidrógeno.
‐ Aldehídos: Mata por inactivación de proteínas: Formaldehído, Gluteraldeido. Esteriliza después de horas de contacto.
‐ Halógenos: Son agentes oxidantes y desnaturalizantes de proteínas. ‐ Óxido de Etileno: Gas utilizado para esterilizar plásticos.
‐ Sales de metales pesados con poder antimicrobiano, como por ejemplo nitrato de plata
La instalación requiere un depósito de almacenamiento del compuesto químico con dispensador basado en un venturi o con una bomba específica. Para poder pasar el fluido esterilizador por todas las tuberías se requieren válvulas de tres vías, también llamadas de asiento doble (bloqueo y purgado). Por una de las vías entra el esterilizador en la conducción permaneciendo la vía de entrada de sustrato cerrada. Después del enjuague se cierra el circuito de esterilización abriéndose la vía de alimentación de sustrato. Para la esterilización del interior del reactor el fluido desinfectante se emite a través de unos emisores, generalmente esféricos con finas perforaciones, de modo que inyectando el líquido a presión se pulveriza el chorro mojando completamente las paredes internas. El efecto es similar al de una ducha. La disposición de los emisores esféricos debe ser tal que no quede ninguna superficie sin tratar. La presencia del eje de
54 la turbina de agitación en ocasiones puede generar un obstáculo. Para una adecuada distribución del chorro se suelen colocar dos emisores en la parte superior, simétricos respecto al eje de agitación, y otros dos en la parte inferior. Una vez se ha desinfectado la instalación el líquido residual se elimina a través de una válvula de vaciado colocada en la parte más baja del biorrecator.
Un sistema particular de desinfección o esterilización química son los llamados Cleaning In Place Technology (CIP) y Sterilizer In Place (SIP). Éstos son sistemas diseñados para la limpieza y esterilización automáticos con capacidad de aislar una parte de la instalación permitiendo que el resto continúe su producción. Los sistemas CIP se basan en una serie cuatro fases de desinfección: Primero un pase de una solución cáustica que permite solubilizar grasas, aceites y otros compuestos orgánicos; segundo un pase de solución ácida para neutralizar restos del lavado alcalino y extraer depósitos de minerales como la cal del agua; tercero el pase de un detergente y por último agua esterilizada.
Las soluciones de limpieza se preparan y mantienen listas para su uso en tanques separados donde se monitoriza el nivel, la temperatura y la concentración. Las condiciones de operación quedan definidas por el caudal emitido, la presión, la temperatura y el tiempo efectivo de cada tratamiento.
Figura 21. Esquema de funcionamiento de un CIP
Una bomba, generalmente centrifuga, se encarga de impulsar las soluciones desde los tanques depósito hasta los emisores del biorreactor a desinfectar en donde está instalado el dispositivo de aspersión interna. En la tubería de vaciado existe otra bomba para el retorno de las mismas a la planta CIP. El control de las líneas se hace con válvulas con accionamiento neumático. La velocidad mínima del flujo de un sistema CIP a través de los sistemas de aspersión debe ser mayor o igual a 1,5 m/s normalmente hasta de 3 m/s
55 para facilitar el arrastre. El caudal y presión llegan por lo general hasta 140 m3/h y 10 bar, respectivamente. El número de tanques depende de los volúmenes de detergente y de desinfectantes requerido, raras veces excede 8 tanques por sistema. El volumen de los tanques depende del volumen fluido requerido para limpiar los tubos, reactores, etc. La superficie de contacto con el producto debe ser lisa, libre de grietas o agujeros, no porosa, no absorbente y no tóxica. Las soldaduras también deben cumplir estas condiciones. Los materiales más comunes con estas características son el acero inoxidable tipo 304 y 316, algunos cristales y algunos elastómeros. Las líneas deben ser horizontales y acabar en puntos de drenaje. La base del tanque debe permitir el vaciado total. El sistema precisa sensores de monitorización y tener capacidad de regulación de caudal, presión y concentración de la solución.
Esterilización por filtración
Este sistema es generalmente usado para esterilización de fluidos, ya sea sustrato, agua o aire. Consiste en un lecho poroso a través del cual se hace circular el fluido a desinfectar o esterilizar. Si las células contaminantes son de mayor tamaño que el poro quedan retenidas y no pueden pasar. En líquidos se utilizan membranas con poros de 2 µm, en gases se suelen utilizar membranas con poros 0,02 µm, llamados High Efficiency Particulate Air Filters (HEPA).
Se utiliza especialmente cuando los líquidos llevan sustancias que se degradan con calor, como compuestos orgánicos nutricionales, sustratos etc.; para la esterilización del aire de entrada y salida del fermentador.; o para mantener el aire libre de contaminantes en la sala de fermentación.
Esterilización por radiación
La radiación ionizante que produce radicales libres en el agua que alteran las membranas celulares y las proteínas. La eficiencia depende de la penetración de la onda. La radiación UV es muy eficaz para la esterilización de instrumentación porque permite la esterilización de superficies, pero en líquidos es poco penetrante. Los rayos Gamma penetran se utilizan para esterilizar alimentos
Esterilización por calor seco
Consiste en la aplicación de calor mediante resistencias eléctricas en las paredes del reactor o la circulación de aire caliente. Destruye los microorganismos por oxidación (quema). Necesita más temperatura que el calor húmedo (170°C durante 2 horas). Adecuado para objetos con elevada resistencia a la temperatura.
Esterilización por calor húmedo
Consiste en la aplicación de agua hirviendo, vapor saturado o vapor sobrecalentado para provocar desnaturalización de proteínas metabólicas y con ello la muerte del
56 microorganismo contaminante. Este principio es el que se utiliza en los autoclaves. Es el método más usado. Elimina casi todo: excepto microorganismos termófilos extremos, endoesporas y algunos virus. La eficacia depende de la presión y el tiempo de aplicación. Generalmente se utiliza vapor a 121°C, durante 30 min, y 10 bares de presión.
La instalación requiere una caldera, el vapor se hace pasar por el interior de las tuberías y del reactor del mismo modo que se hace en las instalaciones de esterilización con productos químicos.