Capitulo+10.+Diseño+de+biorreactores
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(2) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Durante su crecimiento las células secretan sustancias que pueden ser útiles para el ser humano, como alcoholes combustibles, antibióticos, o sustancias químicas de aplicación agrícola o industrial. Para obtener esas sustancias se hacen crecer las células deseadas en un biorreactor, para ello se le deben proporcionar las condiciones óptimas en cuanto a alimento, eliminación de inhibidores, eliminación de competencia (a través de desinfección previa), condiciones determinadas de temperatura y pH. Tras la producción de la sustancia deseada, ésta queda diluida en el caldo del biorreactor, por tanto su extracción pasa por un proceso de destilación, o purificación del fluyente. En microbiología a la cantidad o concentración de microorganismos en el biorreactor se denomina biomasa. En este contexto no hay que confundir el término biomasa (microorganismos) con el tipo de materia prima que se desea procesar, que en el ámbito de la bioenergía también se denomina biomasa pero que en el ámbito de la microbiología se denomina sustrato. En cuanto a la alimentación, los microorganismos precisan tres tipos de sustancias principales: una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno y, en su caso, oxígeno (en reacciones aerobias). Para determinar cuanta cantidad de alimento es necesario y cuanto producto se puede obtener en un determinado proceso, se puede partir de la reacción estequiométrica del mismo. Los microorganismos pueden ser analizados en cuanto a su composición elemental de carbono C, hidrógeno H, oxígeno O y nitrógeno N, obteniendo su fórmula empírica CHxOyNz. Existen ya numerosas referencias en cuanto a la composición elemental de los microorganismos más comunes, como se muestra en la Tabla 1. También debe ser conocida la fórmula del sustrato y del producto secretado durante su crecimiento. De acuerdo a las composiciones del microorganismo, sustrato, y productos se puede escribir la ecuación estequiométrica general como se muestra en (1), donde no se incluyen todos los elementos del medio de reacción, sólo aquellos que se consideran limitantes, que suelen ser la fuente de C, el O2 y la fuente de N, aunque pueden haber otros. Tabla 1. Fórmula elemental de microorganismos fermentadores Microorganismos Aerobacter aerogenes Klebsiella aerogenes Candida utilis Saccharomyces cerevisiae. Fórmula empírica CH1.78O0.33N0.24 CH1.74O0.43N0.22 CH1.84O0.55N0.2 CH1.70O0.46N0.17. CHmOn + a O2 + b NH3 → c CHxOyNz + d CO2 + e H2O+ f CsHrOw. (1). Por ejemplo si consideramos un proceso de fermentación alcohólica con levaduras Saccharomyces cerevisiae con glucosa C6H12O6 como la fuente de carbono, y amoniaco NH3 como la fuente de nitrógeno para producir etanol, la reacción se modeliza según la ecuación (2) C6H12O6 + a O2 + b NH3→ c CH1.703O0.459N0.171 + d CO2 + e H2O + f C2H6O. (2). Para la determinación de los coeficientes estequiométricos se resuelve el sistema de ecuaciones del balance de cada uno de los elementos. El coeficiente a indica los moles de oxígeno consumidos en la reacción por mol de sustrato (glucosa). El coeficiente b indica los moles de amoniaco consumidos en la reacción por mol de sustrato. El 2.
(3) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. coeficiente c indica los moles de microorganismos (biomasa) que se obtienen por mol de glucosa consumido. Los valores c, e y f son los moles de dióxido de carbono, agua y etanol producidos por mol de glucosa respectivamente. Como se puede observar el número de ecuaciones obtenidas en los balances de cada elemento es inferior al número de incógnitas, lo que hace que el sistema de ecuaciones lineales resultante sea indeterminado. Esto nos obliga para resolver el sistema a realizar determinaciones empíricas complementarias como la obtención de la relación biomasa/oxígeno (c/a) y biomasa/dióxido de carbono (c/d) a través generalmente de experimentos específicos. La relación biomasa/oxígeno es el número de células que se obtiene por mol de oxígeno consumido. Es justamente la inversa de la demanda biológica de oxígeno (DBO). Es decir, la DBO se define como el oxígeno consumido por mol de células reproducido. La biomasa/oxígeno (c/a) y biomasa/dióxido de carbono (c/d) se obtienen mediante un sencillo experimento en el que una concentración de células conocida se hace crecer en un medio de cultivo en el cual se ha colocado una sonda que mide de forma instantánea la concentración de O2 o CO2 según el caso. En cuanto se modifica la concentración de estos gases se mide la variación del número de células. Así se obtiene el sistema de ecuaciones siguiente para la reacción indicada: C: H: O: N:. 6 = c+d+2 f 12+3 b=1,703 c+2 e+6 f 6+2 a=0 ,459 c+2 d+e+f b=0,171 c. c/a= 1,70 c/d= 1,98 La resolución del sistema de ecuaciones se muestra en la reacción (3) C6H12O6 + 2 O2+ 0,585 NH3 → 3,42 CH1.703O0.459N0.171 + 2,41 CO2 + 3,47 H2O +0,16 C2H6O (3). Especial importancia tienen la relación biomasa/sustrato (c = 3,42), biomasa/oxígeno (c/a = 1,70) y biomasa/producto (c/f = 20,8) en el diseño de los flujos de alimentación del biorreactor. La relación biomasa/sustrato se simboliza generalmente como Yx / s de acuerdo a la ecuación (4) y se puede expresar tanto como relación de masas como relación de moles, es decir, como la masa de microorganismos producida en relación a la masa de sustrato consumida; o los moles de microorganismos producidos en relación a los moles de sustrato consumidos. Las relaciones biomasa/oxígeno y biomasa/producto se calculan según las ecuaciones (5) y (6) respectivamente, y del mismo modo se pueden expresar en relación de masa o de moles. Yx / s . X1 X 0 S 0 S1. (4). Yx / o . X1 X 0 O0 O1. (5). Yx / p . X1 X 0 P1 P0. (6) 3.
(4) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. X0 es la masa (o moles) de células inicial, X1 es la masa (o moles) de células final. S0 es la masa (o moles) de sustrato inicial, S1 es la masa (o moles) de sustrato final. O0 es la masa (o moles) de oxígeno inicial, O1 es la masa (o moles) de oxígeno final. P0 es la masa (o moles) de producto inicial, P1 es la masa (o moles) de producto final, en una prueba específica.. 2. Tipos de biorreactores De acuerdo a la configuración del biorreactor se tienen dos tipos: biorreactor de tanque agitado o biorreactor flujo-pistón. Biorreactor de tanque agitado El biorreactor de tanque agitado es un recipiente donde las condiciones de crecimiento son homogéneas y cada uno de sus componentes tiene la misma concentración en todos los puntos de su volumen, es decir, no existen gradientes de concentración en cualquier elemento, ni de temperatura, ni de pH. Esto se consigue por la acción de una turbina que mantiene el caldo de cultivo en continuo movimiento, produciendo la mezcla. Según el régimen de alimentación los biorreactores de tanque agitado se clasifican en tres grupos: - Biorreactor de tanque agitado en discontinuo, también llamado biorreactor Batch. Este tipo de biorreactor trabaja por lotes, es decir, se llena con caldo de cultivo y se deja reaccionar un periodo de tiempo, tras el cual se vacía. El tiempo que un determinado elemento está dentro del reactor se denomina Tiempo de retención, es decir en este tipo de biorreactores comprende el periodo entre el llenado y el vaciado. Durante el tiempo de retención no entra ni sale material del reactor, es decir, los flujos son cero. La concentración de los componentes en el interior del reactor es variable. La concentración de células va aumentando hasta un límite, la concentración de sustrato va disminuyendo y la concentración de producto va aumentando. - Biorreactor de tanque agitado en continuo, también llamado Quimiostato. En él se alimenta de forma continua a las células con sustrato y se extrae también de forma continua caldo con producto. Los flujos de entrada y salida son iguales, y la concentración de todos los componentes en el interior del reactor es constante. El tiempo de retención TR de los componentes se calcula por la ecuación (7) donde V es el volumen del reactor y F el flujo de entrada y salida. TR . V F. (7). - Biorreactor de tanque agitado en semicontinuo. Es el biorreactor agitado en que la reacción se produce durante el proceso de llenado del mismo. Cuando termina el llenado se da por concluida la reacción comenzando el vaciado. El tiempo de llenado es el tiempo de retención. La concentración de los distintos componentes durante el tiempo de retención es constante.. 4.
(5) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Figura 1. Tipos de biorreactor de tanque agitado (a) discontinuo, (b) continuo, (c) semicontinuo Biorreactor flujo-pistón El biorreactor tipo flujo-pistón es un recipiente estratificado, la alimentación se produce de forma continua por un extremo, y circula en flujo laminar lentamente a través del mismo mientras se va produciendo la reacción. Cuando el fluido llega al extremo opuesto del reactor la reacción ha concluido, y se realiza el vaciado también de forma continua. Este tipo de reactor es muy conveniente cuando diferentes tipos de microorganismos trabajan encadenadamente formando un mecanismo de tal modo que el producto del primer tipo de microorganismos es el sustrato del siguiente tipo de microorganismos. En cada estrato predominará un tipo y una composición. A medida que se forma el producto del primer microorganismo, la inhibición hace que éste deje de realizar su actividad cediendo el paso al siguiente. Al desplazarse durante la transformación, en cada punto del camino seguido el sustrato forma un estrato con composición concreta. En la Figura 2 se muestran diferentes configuraciones de biorreactores flujo-pistón. La banda de color degradada representa la variación de composición.. Figura 2. Distintas configuraciones de biorreactor flujo-pistón Este tipo de biorreactor se ha utilizado tradicionalmente en la fermentación metánica para la producción de biogás, donde existe una etapa inicial realizada por microorganismos hidrolíticos que produce ácidos de cadena corta a partir de la degradación de la materia orgánica, seguidos de una etapa de producción de ácido acético a partir de los ácidos anteriores ejecutada por microorganismos llamados acetogénicos, y una última etapa de producción de metano a partir de ácido acético realizada por los microorganismos metanogénicos. El tiempo que un determinado elemento está dentro del reactor se denomina Tiempo de retención. 5.
(6) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. 3. Cálculo de flujos y tiempos de retención. El cálculo de los flujos de alimentación y evacuación de producto, y de los tiempos de retención están basados en los balances de materia y energía en el biorreactor, que a su vez dependen de la cinética del proceso de crecimiento celular. El balance de materia de cualquier componente sigue la siguiente igualdad. Esta igualdad se expresa de forma matemática según la ecuación (8) d (VCi ) Fe Ce Fs C s V ri f V ric dt. (8). Donde V = volumen del reactor (l) Fe = caudal de alimentación (l/s) Fs = caudal de salida (l/s) Ce = concentración del componente i en la alimentación (moles/l) Cs = concentración del componente i en la salida (moles/l) ri2= velocidad de formación del componente i (moles/l s) ric = velocidad de consumo del componente i (moles/l s). En la reproducción celular existen procesos que pueden resultar globalmente exotérmicos o endotérmicos. Los procesos exotérmicos liberarán calor al medio y ello provocará un calentamiento del reactor. En esa circunstancia para mantener la temperatura fija, según los requerimientos de la cepa a reproducir, es necesario refrigerar el reactor. En los procesos endotérmicos, la reproducción de la cepa absorberá calor, de modo que la temperatura del reactor tenderá a disminuir, lo que obliga al calentamiento del medio. Para mantener la temperatura fija el calor aportado o extraído del reactor debe ser igual al absorbido o liberado en el proceso. Ello obliga al diseño de un sistema de control de temperatura en el reactor basado en un sistema de calentamiento y un sistema de refrigeración para hacer el mismo versátil, que a su vez se empleará en los procesos de desinfección previa, para evitar competencias de especies de microorganismos no deseados. Biorreactor Batch El biorreactor Batch trabaja de forma discontinua por lotes. En él los flujos de entrada y salida son cero. El caldo de cultivo inoculado con la cepa deseada se introduce en el reactor y se deja un tiempo hasta que se considera que la reacción ha concluido, momento en que se vacía. La evolución de la población microbiana dentro del biorreactor se divide en cuatro etapas representadas en la Figura 3. Inicialmente en el caldo de sustrato recién inoculado la concentración de microorganismos es baja y su crecimiento muy lento. Esta etapa se denomina Fase de letargo. El crecimiento de la concentración es lento porque las células necesitan un tiempo de maduración. Éstas 6.
(7) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. antes de la inoculación se conservan en frío, por ello deben adaptarse a las nuevas condiciones. Cuando se ha superado la fase de letargo el crecimiento celular se realiza de forma exponencial. Las células en abundancia de alimento se reproducen a la mayor velocidad posible, específica para esas condiciones de pH y temperatura. Esta fase de denomina Fase de crecimiento exponencial. Cuando el alimento empieza a escasear la velocidad de reproducción va disminuyendo. Empiezan a aumentar el número de muertes celulares de forma que acaban por igualarse a las reproducciones, de modo que la concentración de células vivas permanece constante. A esta fase se le denomina Fase estacionaria. Si la deficiencia de alimento persiste y finalmente aumenta, el número de defunciones en la población celular podrá ser superior al de reproducciones de forma que la concentración de células vivas comienza a decrecer de forma exponencial. Esta fase de denomina de Muerte celular.. Figura 3. Evolución de la concentración de células vivas en un biorreactor Batch. La mayor cantidad de producto se forma en la fase de crecimiento exponencial, es por ello que se busca que el reactor batch trabaje siempre en esta fase. Para conseguir esto se limita el tiempo de retención a la duración de esta etapa. Si representamos la concentración de producto en el reactor en función del tiempo (Figura 4) se puede observar que en la fase de letargo no hay formación de producto. En la fase de crecimiento celular exponencial la variación de concentración de producto es muy alta con alta productividad, y que en la fase estacionaria la variación de concentración es Pexp . Pest . más pequeña y tiene productividad menor, es decir: t exp t est .. 7.
(8) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Figura 4. Variación de la concentración de producto en un biorreactor discontinuo. (Se ha considerado un valor Yx/p= 0,45 respecto a la Figura 3) Para evitar un número excesivo de inoculaciones y el consecuente gasto económico en cepas, en cada lote el reactor no se vacía completamente, sino que se deja aproximadamente un tercio del volumen con caldo en el interior, reponiendo los dos tercios restantes con sustrato nuevo previamente desinfectado. La agitación del caldo a través de la turbina en el interior del reactor facilita la mezcla, de forma que las células que no han llegado a la fase estacionaria y están en pleno auge reproductivo se aprovechan para la inoculación del siguiente lote, reduciendo al máximo el tiempo de letargo, y obteniendo la máxima productividad de producto. Para modelizar el balance celular se particulariza la ecuación general (8) de forma que la concentración de células vivas dentro del reactor se simboliza con la letra X, el volumen de caldo permanece contante y los flujos de entrada y salida son cero, Fe = Fs = 0. Dado que se trabaja en la fase de crecimiento celular exponencial la tasa de defunciones es despreciable respecto a la de reproducciones, de tal modo que la ecuación 8 se transforma del modo siguiente: d (VX ) Fe X e Fs X s V rxf V rxc dt V cte , Fe Fs 0 , rxc 0. dX ri f dt. La velocidad de crecimiento celular es proporcional al número de células existentes. La constante de proporcionalidad se denomina tasa de crecimiento celular y se simboliza. 8.
(9) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. por la letra µ. A partir de la ecuación (9) se demuestra el crecimiento exponencial de la población. dX X dt. →. . dX dt X. x. . (9). t. dX dt Xo X tlag. ln. X t tlag Xo. X Xo e. (10). . t t lag. . X0 representa la concentración celular inicial en el reactor, que es muy baja; X representa la concentración celular en un tiempo t, tlag es el tiempo de letargo. La tasa de crecimiento µ se moleliza generalmente con la ecuación de Monhod (11). Su aplicación requiere el conocimiento de la tasa máxima de crecimiento µmax y la constante de saturación Ks denominados parámetros cinéticos de la cepa, que dependen de la temperatura y del pH, y se obtienen de forma experimental. Conocidas µmax y Ks, la tasa de crecimiento microbiano µ sólo depende de la concentración de sustrato S. Cuando la concentración de sustrato es muy grande, el término Ks es despreciable frente a S, por tanto, la tasa de crecimiento microbiano se aproxima mucho a la máxima. Ahora bien, cuando la concentración de sustrato es baja, Ks ya no es despreciable y la tasa de crecimiento es menor a la máxima.. . max S. (11). Ks S. Si existe más de un tipo de alimento limitante, por ejemplo G (fuente de carbono), N (fuente de nitrógeno) o O (Oxigeno), de acuerdo a la ecuación de Monhod, la tasa máxima de crecimiento queda minorizada de la siguiente forma: G N O KG G K N N Ko O . (12). max . El modelo de Monhod queda modificado en presencia de inhibidores. En caso de inhibición competitiva la constante de saturación aumenta, multiplicándose por un factor a (ecuación 13). En caso de de inhibición no competitiva la tasa máxima de crecimiento se reduce tal como indica la ecuación (14). El factor a depende de la concentración del inhibidor I y de una constante de afinidad KI. Inhibición competitiva. max. S Ks a S. (13). 9.
(10) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Inhibición no competitiva. a 1. . max a. S Ks S. (14). I KI. Hay que indicar que la modelización de Monhod para la tasa de crecimiento celular en función del sustrato no es la única. Existen diferentes modelos tal como se muestra en la Tabla 2, pero el modelo de Monhod es el más utilizado. Tabla 2. Modelos de cálculo de la tasa de crecimiento celular Tipo de modelo. Autor. Modelo. Modelos cinéticos sin inhibición. Tessier. max 1 e S / K s. Moser. Contois Modelos cinéticos con inhibición. Andrews y Noak. Webb. Aiba et al. Teissier Tseng y Wymann. . Sn. max max. max. . Ks a S n S BX S 1 S2 Ks S K is. S S 1 K is max S2 Ks S K is S max e S / K si Ks S. . max e S / K si e S / K s. max. . S K si s s c Ks S. De la ecuación de Monhod se deduce que a medida que se va terminando el sustrato la tasa de crecimiento celular disminuye. Para la determinación del tiempo de retención TR se debe fijar un límite al descenso de la tasa de crecimiento. Por ejemplo, para trabajar en la fase exponencial del ciclo no se debe permitir que la tasa de crecimiento baje más de un 85% de la tasa de crecimiento máxima, es decir µ > 0.85µmax. De ahí se deduce a partir de la ecuación de Monhod la concentración límite de sustrato en el reactor. 0.85 max . max S1 K s S1. → S1 5.66 K s. 10.
(11) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Conocida la concentración inicial de sustrato So, a partir de la relación biomasa/sustrato del proceso Yx/s, definida por la ecuación (4), se obtiene la variación de masa celular durante el proceso. La concentración inicial de células en el reactor también es conocido Xo y por tanto también la biomasa final X1. A partir de la ecuación (10) se obtiene el tiempo de retención. Yx / s . ln. X1 X 0 S 0 S1. →. . . X1 max TR t lag Xo. X 1 X 0 Yx / s S 0 S1 . TR t lag . →. 1. max. ln. X1 Xo. La variación de la concentración de sustrato en el reactor en función del tiempo se puede obtener de la ecuación (15) d (VS ) Fe S e Fs S s V rsf V rsc dt V cte , Fe Fs 0 , rsf 0 ,. 1 dS X dt Yx / s. S. →. t t lag 1 Xo e dt tlag Y x / s. . rsc . (15) 1. Yx / s. X. t t lag 1 dS Xo e dt Yx / s. t. →. S. t t lag 1 2 1 X o e Yx / s . Del mismo modo la variación de la concentración de producto en el reactor en función del tiempo se puede obtener de la ecuación (16) d (VP ) Fe Pe Fs Ps V r pf V r pc dt V cte , Fe Fs 0 , r pc 0 ,. 1 dP X dt Yx / p P. . t. 1. tlag Yx / p. Xo e. . t t lag. →. dt. r pf . (16) 1 Yx / p. X. t t lag 1 dP Xo e dt Yx / p. →. P. 1 Yx / p. 2 X o e . . t t lag. 1 11.
(12) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Ejemplo 1 Determínese el tiempo de retención recomendable en un biorrecator discontinuo de 3 m3 para fermentación alcohólica con la levadura Sacharomyces cerevisae para producción de etanol, si la concentración inicial es de 0,002 g/l de células y 6 g/l de glucosa. Se supone que el microorganismo sigue una cinética de Monod con µmax= 0,37 h-1, tlag= 6 h y Ks= 1,35 g/l, un rendimiento biomasa/sustrato de 0,4, y un rendimiento biomasa/producto 9,8. Cálculese la productividad del sistema Si consideramos una limitación de reducción de la tasa de crecimiento celular a un 75% de la máxima, se tiene 0,75 max . Yx / s . ln. max S1 K s S1. X1 X 0 S 0 S1. . → S1 3 K s 3 1,35 4,05 g/l. → X 1 X 0 Yx / s S 0 S1 = 0,002 0,4 6 4,05 = 0,38 g/l. X1 max TR t lag Xo Yx / p . . →. TR t lag . 1. max. ln. X1 0,38 1 6 20,18 h ln Xo 0,37 0,002. X1 X 0 1 1 → P1 P0 X1 X 0 = 0 0,38 0,002 = 0,038 g/l Yx / p 9,8 P1 P0. La cantidad total obtenida de etanol en cada lote será: 3000 l 0,038 g/l = 114 g de etanol. La productividad será: 114 g/20,18 h = 5,65 g/h Fin. Biorreactor continuo, quimiostato Un biorreactor continuo en equilibrio en estado estacionario, quimioestato, está siendo continuamente alimentado con sustrato y se está extrayendo fluyente, de forma que el flujo de entrada y el flujo de salida son iguales. Por otra parte, el volumen de caldo en su interior V, junto la concentración de cada uno de los componentes, tanto concentración celular X, concentración del sustrato S, concentración de producto P son constantes. En condiciones de funcionamiento se busca que el biorreactor trabaje en la zona de crecimiento celular exponencial de forma que la tasa de defunción es despreciable rxc ≈0. El flujo de entrada está compuesto exclusivamente por sustrato a una concentración Se, no existen células ni producto, es decir, Xe y Pe son cero. El flujo de salida está compuesto por sustrato, producto y células a la concentración de equilibrio del interior del reactor, es decir X, S y P respectivamente. De manera en el balance de biomasa general dado por la ecuación (8) se particulariza de la siguiente forma: d (VX ) Fe X e Fs X V rxf V rxc dt. 12.
(13) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. dX 0, dt. Fe Fs F , Xe=0, rxc ≈0 0. F X rxf V. Dado que se trabaja en la zona exponencial se tiene que rxf X , por tanto se debe cumplir la igualdad (17) para que se cumpla el quimiostato, de lo contrario el sistema evolucionará. F F 0 X → V V . (17). Si analizamos el balance de materia referido al sustrato, la ecuación general (8) se particulariza de la siguiente manera: la formación de sustrato en el interior del reactor es nula rsf 0 ; Sólo existe consumo, que está relacionado con la producción de biomasa por la ecuación del rendimiento biomasa/sustrato Yx/s. d (VS ) Fe S e Fs S V rsf V rsc dt dS 0, dt. Fe Fs F ,. rsf 0 ,. rsc . 1. Yx / s. X. 1 F (Se S ) X 0 V Yx / s (S e S ) . 1. Yx / s. X 0. (18). Si analizamos el balance de materia referido al producto, el consumo de producto en el interior del reactor es nulo r pc 0 ; la producción está relacionada con la reproducción celular por la ecuación del rendimiento biomasa/producto Yx/p, de madera que la ecuación general (8) se particulariza del siguiente modo: d (VP ) Fe Pe Fs P V r pf V r pc dt. Pe 0 ,. dP 0, dt. Fe Fs F ,. r pc 0 ,. r pf . 1 Yx / p. X. 13.
(14) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. F 1 P X 0 V Yx / p P. 1 Yx / p. X 0. Para el cálculo de las condiciones de trabajo en un biorreactor continuo (flujos y concentraciones de X, S y P) es necesario seleccionar la tasa de crecimiento celular en la que se desea trabajar y su relación respecto a la tasa máxima, por ejemplo el 75% de la tasa máxima, es decir, µ > 0,75µmax. A partir de la ecuación (17) se obtiene el valor del flujo, y a partir de la ecuación de Monhod se calcula la concentración de sustrato conseguida en el equilibrio S. Dado que la concentración de sustrato en el equilibrio no puede ser mayor que la concentración de sustrato en el flujo de alimentación se debe comprobar que Se > S, en caso contrario debe elegirse otra tasa de crecimiento para que el sistema funcione. Conocida S a partir de la ecuación (18) se calcula la concentración de células en el reactor. A partir de la ecuación (19) se calcula la concentración de producto en el reactor que es la que se extrae del fluyente de salida. La productividad (moles de producto/h) se obtiene de la multiplicación de P por el flujo.. . F V. max S Ks S. →. F V. →. S. F 1 (S e S ) X 0 V Yx / s. P. 1 Yx / p. →. X 0 →. Ks max . X Yx / s ( S e S ). P. 1 Yx / p. X. Productivi dad (moles/h) F P. 14.
(15) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Ejemplo 2 Se plantea el diseño de un reactor continuo de 3 m3 para fermentación alcohólica con la levadura Sacharomyces cerevisae. Se desea conocer la concentración de células, sustrato y producto en el equilibrio, junto los flujos de alimentación y productividad si se alimenta con glucosa a una concentración de 6 g/l, para obtener etanol. Se supone que el microorganismo sigue una cinética de Monod con µmax= 0,37 h-1 y Ks= 1,35 g/l, un rendimiento biomasa/sustrato de 0,4, y un rendimiento biomasa/producto 9,8. Si consideramos una limitación de reducción de la tasa de crecimiento celular a un 75% de la máxima, se tiene . F → F V 0,75 0,37 3000 832,5 l/h V. . max S Ks S. →. 1 F (Se S ) X 0 V Yx / s. P. 1 Yx / p. S. →. X 0 →. Ks max . . 0,75 1,35 4,05 g/l 1 0,75. X Yx / s ( S e S ) 0,4 6 4,05 0,8 g/l. P. 1 Yx / p. X . 1 0,8 0,078 g/l 9,8. Productivi dad (moles/h) F P 832,51 0,078 64,94 g/h. Se puede comprobar que la productividad es sustancialmente mayor en el biorreactor continuo que en el discontinuo. Fin. Ejemplo 3 Se desea determinar cuál es la tasa óptima de crecimiento a utilizar en un reactor continuo de 3 m3 para fermentación alcohólica con la levadura Sacharomyces cerevisae si se alimenta con glucosa a una concentración de 6 g/l, para obtener etanol. Se supone que el microorganismo sigue una cinética de Monod con µmax= 0.37 h-1 y Ks= 1.35 g/l, un rendimiento biomasa/sustrato de 0,4, y un rendimiento biomasa/producto 9,8. La tasa de crecimiento óptima será la que proporcione mayor productividad F P . Para determinar ésta se elabora la Tabla 3.. 15.
(16) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Tabla 3. Condiciones estacionario para distintas tasas de crecimiento celular en el biorreactor del ejemplo 3. %mu 1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 95. mu 0,004 0,037 0,074 0,111 0,148 0,185 0,222 0,259 0,296 0,333 0,352. F (l/h) 11,1 111 222 333 444 555 666 777 888 999 1054,5. S (g/l) 0,01 0,15 0,34 0,58 0,90 1,35 2,03 3,15 5,40 12,15 25,65. X (g/l) 2,39 2,34 2,27 2,17 2,04 1,86 1,59 1,14 0,24 -2,46 -7,86. P (g/l) 0,24 0,23 0,23 0,22 0,20 0,19 0,16 0,11 0,02 -0,25 -0,79. FP (g/h) 2,66 25,97 50,28 72,21 90,58 103,23 105,89 88,58 21,31 -245,75 -828,84. Si se observa la representación de cada una de las variables, se detecta que existe una tasa de crecimiento celular para la cual la productividad es máxima. Para los datos considerados éste se sitúa alrededor del 60% de la tasa máxima. Este valor cambia cuando se incrementa la concentración del sustrato de alimentación. Concentración de S (g/l). Concentración des X (g/l). 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00 0. 50 Porcentaje de mu max. 100. Productividadde P (g/ h). Concentración de P (g/l). 0,30 0,25 0,20 0,15 0,10 0,05 0,00 0. 50 Porcentaje de mu max. 100. 30,00 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 0. 50 Porcentaje de mumax. 100. 120 100 80 60 40 20 0 0. 50 100 Porcentaje de mu max (h-1). Figura 5. Variación de la concentración de los componentes del biorreactor continuo del ejemplo 3. 16.
(17) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Ejemplo 4 Determínese las condiciones de crecimiento celular en un reactor de 1000 l de volumen con levadura Sacharomyces cerevisae que es alimentado con una solución de glucosa de 20 g/l de concentración si se desea una productividad de 150 g de alcohol por hora. Se supone que el microorganismo sigue una cinética de Monod con µmax= 0,37 h-1 y Ks= 1,35 g/l, un rendimiento biomasa/sustrato de 0,4, y un rendimiento biomasa/producto 9,8. Pr oductivida d P F 150 g/h. F 1 150 P X 0 → X 9,8 1,47 g/lh V Yx / p 1000 1 F (Se S ) X 0 , V Yx / s. como . F max S V Ks S. →. max S Ks S. (Se S ) . max S ( S e S ) max S 2 ( max S 2 (. 1. Yx / s 1. Yx / s. 0,37 S 2 (. 1. Yx / s. 1. Yx / s. X 0. X ( K s S ) 0. X max S e ) S . 1. Yx / s. X S e max ) S . 1. Yx / s. X K s 0 X K s 0. 1 1 1,47 20 0,37) S 1,47 1,35 0 0,4 0,4 0,37 S 2 3,47 S 4,69 0. S. 3,47 3,47 2 4 0,37 4,69 =8,48 g/l 2 0,37. X Yx / s ( S e S ) 0,4 20 8,48 4,60 g/l P. 1 Yx / p. . X 0 →. P. 1 Yx / p. X . 1 4,60 0,47 g/l 9,8. X 1,47 0,32 → 0,863 max X 4,60 17.
(18) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. F V 0,32 1000 320 l/h. Fin. Biorreactor semicontinuo En un reactor semicontinuo la reacción ocurre durante el periodo de llenado que corresponde al tiempo de retención. Esto es así para todas las partículas puesto que las primeras en entrar son las primeras en salir tras el llenado, y las últimas en entrar son las últimas en salir. Durante la reacción solo hay flujo de entrada o de salida, pero nunca ambos simultáneamente. Durante la reacción (periodo de llenado) la concentración de todos los componentes, tanto células, sustrato como producto es constante. El volumen del reactor es variable (se está llenando el tanque o se está vaciando). Para el análisis del balance de materia en el reactor se considera trabajando en la fase exponencial, por tanto la tasa de defunción celular se considera cero, tampoco hay células en el flujo de entrada, por tanto Xe=0. d (VX ) Fe X e Fs X V rxf V rxc dt. Fs 0 , Xe=0, rxc 0 d (VX ) V rxf dt. (19). Dado que el volumen es variable la ecuación (19) se desarrolla y. dX dV 0, Fe . dt dt. dX dV V X V rxf dt dt 0 rxf . F X V. 0 X . F X V. F F 0 X → V V . En el análisis del balance de sustrato en el reactor se considera d (VS ) Fe S e Fs S V rsf V rsc dt. 18.
(19) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Fs 0 , rsf 0 ,. 1 dS 0 , rsc X dt Yx / s. dS dV V S Fe S e V rsc dt dt Fe 1 S e S X 0 V Yx / s. En el análisis del balance de producto se tiene lo siguiente d (VP ) Fe Pe Fs P V r pf V r pc dt dP 0, dt. Fs 0 ,. r pc 0 ,. r pf . 1 Yx / p. X. dP dV V P V r pf dt dt. F 1 P X 0 V Yx / p P. 1 Yx / p. X 0. Como se puede comprobar las ecuaciones resultantes de los balances de materia en células, sustrato y productos son similares a las obtenidas en el biorreactor continuo, por tanto el procedimiento de resolución se realiza de la misma manera, a partir de la selección de la tasa de crecimiento celular en la que de desea trabajar.. 4. Reactores en serie. Muchos procesos industriales requieren varias etapas encadenadas en las que se hace una transformación química distinta en cada una de ellas, y en la que es responsable un microorganismo específico diferente. Esto se denomina mecanismo de reacción. Un ejemplo de mecanismo de reacción se tiene en la producción de metano en fermentaciones anaerobias. Inicialmente la materia orgánica se degrada mediante microorganismos hidrolíticos formando ácidos carboxílicos de cadena corta (ac. pentanoico, butanoico, propanoico). En una segunda etapa estos ácidos carboxílicos son transformados a ácido acético por microorganismos acetogénicos. En la tercera etapa el ácido acético se transforma en metano, dióxido de carbono y agua. Otro ejemplo de mecanismo es proceso de producción de bioetanol a partir almidón. Inicialmente el almidón formado por cadenas largas de glucosa con enlaces α(1-4) debe ser hidrolizado por hongos que posean las encimas α-amilasa, β-amilasa y pululanasa. Estos hongos suelen ser del género Aspergillus sp. o Rhizopus Niveus. En una segunda etapa la 19.
(20) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. glucosa resultante de la hidrólisis debe ser fermentada en alcohol por microorganismos específicos como las levaduras Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Candida shehate, Kluyveromyces marximus, o bacterias Zymomonas mobilis, Clostridium acetobutylicum, Klebsiella oxytoca, y Escherichia coli. Otro mecanismo es necesario en el procesamiento de los materiales lignocelulósicos para obtener bioetanol. Estos materiales están formados por tres estructuras básicas: celulosa, hemicelulosa y lignina. La celulosa y la hemicelulosa están formadas por cadenas de azúcares que pueden ser transformados a bioetanol por fermentación si previamente estos materiales son hidrolizados. El proceso de hidrolización de las fibras de celulosa y hemicelulosa está dificultado por la lignina, producto propilfenólico que las envuelve. El mecanismo del proceso consiste primero en la degradación de la lignina. Esto puede hacerse mediante acción microbiana por ejemplo con hongos Phanerochaete chysosporium. Tras la degradación de la lignina se puede proceder a la hidrólisis de la celulosa y hemicelulosa con microorganismos con las enzimas endo-β-glucanasas, exoβ-glucanasas y β-glucosidasa, presentes por ejemplo en hongos de los géneros Trichoderma, Phanerochaete y Fusaruim. Por último, una vez liberados los azúcares monosacáridos o disacáridos se procede a la fermentación con los mismos microorganismos ya mencionados en el procesamiento del almidón (levaduras y bacterias fermentativas). En estos casos se tiene la opción de hacer crecer dos o más especies de microorganismos en un mismo reactor, de forma que el producto formado por alguno de ellos es sustrato de otro, o utilizar distintos biorreactores en serie haciendo crecer una especie en cada uno de ellos. El uso de un solo reactor tiene el inconveniente de que generalmente cada organismo requiere unas condiciones óptimas de crecimiento distintas, lo que obliga a trabajar en condiciones intermedias. El uso de varios reactores en serie permite trabajar en cada fase del proceso en condiciones óptimas. Análisis de dos biorreactores en serie con procesos distintos Si suponemos dos biorreactores en serie continuos en estado estacionario, el primer biorreactor realizará la primera fase del proceso deseado y poseerá una especie celular concreta, el segundo biorreactor realizará la segunda fase del proceso y tendrá en su interior otra especie celular distinta a la anterior. El primer tanque estará alimentado con un flujo F1 con un sustrato inicial a una concentración So. Al estar en equilibrio la concentración de células, la concentración de sustrato y la concentración de producto en el caldo serán constantes (X1, S1 y P1 respectivamente). El flujo de salida será igual al de entrada y poseerá la misma composición que el caldo interior. El flujo de salida del primer reactor sirve de alimentación del segundo. La diferencia es que así como la alimentación del primer biorreactor se hacía sólo con sustrato, el segundo biorreactor se alimenta con células, sustrato y producto proveniente del primero. Se supone que el producto del primer tanque es el sustrato del segundo. En ocasiones puede ser alimentado con dos flujos, es decir uno proveniente del primer reactor mas otro adicional Ff con concentración Sf. Los volúmenes de los reactores no tienen porqué ser iguales. El objetivo del análisis es determinar la concentración celular, sustrato y producto en cada biorreactor junto la productividad del conjunto.. 20.
(21) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Figura 6. Esquema de funcionamiento de dos reactores continuos en serie a) Tanque 1 Los parámetros del tanque 1 quedan definidos con las mismas ecuaciones que un reactor continuo simple. Limitando el descenso de la tasa de crecimiento para que siempre esté trabajando en la fase exponencial, por ejemplo 0,85 max , se tiene:. 1 0,85 1 max 1 . 1 . ( S 0 S1 ) . 1 max S1 K s1 S1. 1 Y1 x / s. P1 . F1 V1. X1 0. 1 Y1 x / p. →. F1 1 V1. →. S1 . →. X1 0 →. 1 Ks1 1max 1. X1 . P1 . Y1 x / s F1 ( S 0 S1 ) 1 V1 1 Y1 x / p. X1. Productivi dad tanque 1 (moles/h) F1 P1. b) Tanque 2 El balance de biomasa en el biorreactor 2 quedaría según la ecuación (20) de la cual se obtiene el valor de Ff necesario.. 2 0,85 2 max ,. F2 F1 F f. 0 ( F1 F f ) X 2 V2 2 X 2. (20). 21.
(22) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. F1 F f. 2 . V2. → F2 F1 F f 2 V2. De la ecuación de Monhod se obtiene la concentración de sutrato 2 (Producto 1) que hay en este tanque. Del balance de sustrato se obtiene la concentración celular 2.. 2 . 2 max S 2. S2 . →. K s2 S 2. 2 Ks 2 2 max 2. F1 F f Ff F 1 0 1 P1 Sf S2 2 X 2 → X2 V2 Y2 x / s V2 V2. Y finalmente del balance de producto se obtiene la productividad 0. F1 F f V2. P2 . 1 Y2 x / p. 2 X 2 → P2. Productivi dad (moles/h) F2 P2. Análisis de dos biorreactores en serie con el mismo proceso Supongamos ahora que por razones de espacio deseamos realizar una reacción microbiana en dos tanques en serie. En ambos biorreactores se realiza el mismo proceso, es decir el mismo microorganismo, mismo tipo de sustrato y producto. Podemos decidir que trabajen los dos con la misma µ en la fase exponencial, por ejemplo 0,85 max . Los parámetros del tanque 1 quedan definidos con las mismas ecuaciones que en el caso anterior. En el tanque 2 los balances se modifican del siguiente modo: Balance de biomasa reactor 2 0 F1 X 1 ( F1 F f ) X 2 V2 X 2. . F1 F f V2. → F2 F1 F f V2. Si la limitación del descenso de la tasa de crecimiento celular es la misma en ambos reactores, 1 y 2, se la ecuación de Monhod se deduce que la concentración de sustrato en el caldo de los reactores será la misma.. . max S1 K s S1. . max S 2 K s S2. →. S1 S 2 . Ks max . 22.
(23) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. La condición anterior hace que un flujo adicional de alimentación con concentración Sf >S1 sea absolutamente necesario en el tanque 2, por tanto el balance de sustrato queda definido por la ecuación (21) del cual se obtiene la concentración celular del mismo X2. 0 F1 S1 F f S f ( F1 F f ) S1 0 ( S f S1 ) F f . 1 Yx / s. 1 Yx / s. V2 X 2. V2 X 2 →. (21). X2. Balance de producto reactor 2 F1 F f F 1 P2 2 X 2 → P2 0 1 P1 V2 V2 Y2 x / p Productivi dad (moles/h) F2 P2 Si se decide que los dos reactores trabajen a distinta velocidad de crecimiento celular, tenemos en el tanque 2 lo siguiente:. Balance de biomasa reactor 2 0 F1 X 1 ( F1 F f ) X 2 V2 2 X 2. 2 2 . F1 F f V2. → F2 F1 F f 2 V2. max S 2 K s S2. →. S2 . 2 Ks max 2. Balance de sustrato reactor 2 0 F1 S1 F f S f ( F1 F f ) S 2 . 1 Yx / s. V2 X 2. →. X2. Si Ff es cero, se obliga a que S1 > S2 , lo que implica que 0 ( S1 S 2 ) F1 . 1 Yx / s. V2 X 2 →. X2. Balance de producto reactor 2 F1 F f F 1 P2 2 X 2 → P2 0 1 P1 V2 V2 Y2 x / p Productivi dad (moles/h) F2 P2. 23.
(24) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Reactor continuo con recirculación y purga Se trata de un biorreactor continuo al que se ha acoplado un sistema de separación de biomasa (células) por decantación, filtración o centrifugación, que permite recircular parte de las células que salen por la corriente de salida y aumentar la concentración del reactor. Este tipo de sistemas se caracterizan por dos parámetros: a) Relación de recirculación, R: Es la relación entre el flujo de entrada Fe y el flujo de recirculación FR, de manera que. F R R tal que F Fe FR → F (1 R) Fe Fe b) El factor de concentración del sedimentador respecto al torrente de salida del fermentador, C: Es la relación entre la concentración de células antes del sedimentador X y la concentración de células que es recirculada XR. C. XR X. Figura 7. Esquema de funcionamiento de un reactores continuo con recirculación y purga La definición del sistema es complicada puesto que requiere determinar 17 variables, mostradas en la Tabla 4. Tabla 4. Variables a definir en el diseño de un reactor continuo con recirculación y purga Entrada Salida Recirculación Alimentación Reactor. Flujo (l/h) Fe Fs FR F -. Biomasa (g células/l ) Xs XR Xo X. Sustrato (g sustrato/l ) Se Ss SR So S. Producto (g producto/l ) Ps PR Po P. 24.
(25) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Para resolver el diseño se deben fijar algunas variables tomadas como datos. Estos serán: ‐ Concentración de sustrato de alimentación Se ‐ Limitación de la tasa de crecimiento celular, µ tal que se tiene S por la ecuación de Monhod ‐ Productividad deseada, es decir, gramos de producto obtenidos por unidad de tiempo: Fs Ps La determinación del resto de variables se realiza a partir de las siguientes relaciones: Equilibrio de flujos Dado que es sistema es estacionario se tiene que Fe= Fs. FR R Fe F Fe FR → Fe . 1 F 1 R. Equilibrio de concentraciones de productos La productividad es dato, gramos o moles de producto extraídos del sistema por unidad de tiempo Productividad Ps Fs Se parte de dos balances: antes del reactor se realiza una dilución del producto en recirculación pasando de concentración PR a Po, de la cual sale la ecuación (22); después, en el sedimentador que produce una división de caudal, parte del flujo sale del sistema y otra parte retorna al reactor. Esta división de caudal permite escribir la ecuación (23). La división de caudal no produce dilución por lo que P Ps PR F Po FR PR. (22). F P FR PR Fs Ps. (23). Se demuestra que si P Ps tenemos de (23) lo siguiente F P FR PR Fs Ps → (1 R) Fe P R Fe PR Fe P , (1 R) P R PR P → P Ps PR . De (22) se obtiene F Po FR PR → Po . R Ps 1 R. Del balance de producto se obtiene la concentración de células en el biorreactor dP F 1 ( P0 P) X 0 dt V Yx / p 25.
(26) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Yx / p Fs P dP Fs .P R 1 (1 R ) ( 1) X 0 → X V dt V 1 R Yx / p Equilibrio de concentraciones de sustrato Se es dato. De la limitación de la tasa de crecimiento celular, µ se tiene S, concentración de sustrato en el interior de reactor, por la ecuación de Monhod. . max S Ks S. →. S. Ks max . Antes del reactor se realiza una mezcla de caudales con sustrato de la cual sale la ecuación (24); después, en el sedimentador se produce una división de caudal, parte del flujo sale del sistema y otra parte retorna al reactor. Esta división de caudal permite escribir la ecuación (25). F S FR S R S e RS R Fe Se FR S R F S0 (24) → S o e e F R 1. Fs S s FR S R F S (25) → Ss . F S FR S R (1 R ) Fe S R Fe S R (1 R ) S R S R Fs Fe. La división de caudal no produce dilución por lo que S=Ss=SR., es decir que la partición de caudal no influye en las concentraciones de los flujos resultantes. Por lo que S RS So e R 1. Del balance de sustrato dentro del biorreactor se obtiene F, caudal que se extrae del interior del reactor. dS F 1 (S 0 S ) X 0 dt V Yx / s. → F. 1 Yx / s. V. X S0 S. Determinación de concentraciones celulares Del balance de sustrato dentro del biorreactor se obtiene X, y por otra parte X R C X Las células provenientes del retorno (recirculación) son diluidas antes del biorreactor obteniendo la ecuación (26). X 0 F X R FR (26) → X 0 1 R Fe C X R Fe →. X0 . CR X 1 R. 26.
(27) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Tras el biorreactor en el sedimentador sí existe una concentración de células en el retorno, por tanto se obtiene el balance de la ecuación (27) X F X s Fs X R FR (27) →. Xs . X F X R FR X (1 R) Fe X C R Fe Fs Fe. X s ((1 R C R ) X Ejemplo 5 Se desea poner a punto un biorreactor de tanque agitado continuo con recirculación para fermentación alcohólica con una productividad de 500 g de alcohol por hora. El volumen del tanque es de 1000 l. El sistema trabaja bajo glucosa como sustrato limitante, el rendimiento biomasa vs sustrato es de 0,5 y el rendimiento biomasa vs producto es de 2,23 La concentración de glucosa en el alimento Se = 10 g/l. Las constantes cinéticas del microorganismo son m µ=0,2 h-1 y Ks=1,3 g/l. El factor de concentración del sedimentador respecto al torrente de salida del fermentador es de C=1,5 y la relación de recirculación es de 0,7. Considerando el sistema al estado estacionario, determínese. a) Flujos de alimentación del reactor y recirculación b) La concentración de sustrato y producto en el torrente de recirculación c) La concentración de biomasa en el reactor, a la salida del sistema, y en la corriente de recirculación a) Cálculo de concentraciones celulares Si se desea una productividad Ps Fs P Fs = 500 g de alcohol/h X . Yx / p Fs P 2,23 500 4,305 g/l V 0,26 1000. X R C X 1,5 4,305 6,458 g/l X0 . CR 1,5 0,7 X 4,305 = 2,659 g/l 1 R 1 0,7. X s (1 R C R) X = (1 0,7 1.5 0,7) 4,305 = 2,798 g/ml b) Determinación de concentraciones de sustrato Se =10 g/l 27.
(28) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Si limitamos la tasa de crecimiento celular tal que > 0,70 max se tiene S por la ecuación de Monhod S SR Ss . Ks max . . 0,70 1,3 = 0,454 g/ml 1 0,70. S RS =9,81 g/ml So e R 1. c) Determinación de flujos Del balance de sustrato dentro del biorreactor se obtiene F. F. 1 Yx / s. V. 1 4,305 X 1000 0.26 =238,28 l/h = 9,91 0,454 S 0 S 0,5. F Fe FR → Fe . 1 238,28 140,17 l/h 1 0,7. FR R Fe = 0,7 140,17 98,12 l/h Fe= Fs d) Determinación de concentraciones de productos P PR Ps . Po . Productividad 500 = 3,56 g/l Fs 140,168. R 0,7 Ps 3,56 1,47 g/l 1 R 1 0,7 Fin.. 5. Determinación de los parámetros cinéticos de una cepa. Como se ha mostrado en el apartado anterior, la determinación de los flujos y la concentración de los distintos componentes en el reactor requieren el conocimientos de los parámetros cinéticos y rendimientos, µmax, Ks, Yx/s. Yx/p. Estos parámetros pueden ser encontrados en la literatura para numerosas especies celulares, no obstante has variaciones entre cepas y generalmente la determinación de estos parámetros se debe hacerse de forma experimental en laboratorio. Existen básicamente dos tipos de experimentos: reacción en discontinuo (tipo batch) y reacción en continuo.. 28.
(29) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Experimento de discontinuo Consiste en hacer crecer una cepa en una concentración conocida de sustrato, y analizar la variación de concentración celular, sustrato y producto en intervalos de tiempo determinados. La determinación de la concentración celular en la disolución se puede hacer por varias técnicas: • Recuento directo: consiste en la observación al microscopio de volúmenes muy pequeños de suspensiones de celulares. Se usan unos portaobjetos especiales denominados cámaras de Petroff-Hausser. Para que la medida sea correcta es necesario que la densidad de células sea del orden de 105 por ml.. Figura 8. Diagrama de las celdas del portaobjetos Petroff-Hausser Tabla 4. Área y volumen de las celdas de los portaobjetos Petroff-Hausser Tipo de cuadro. Area. Volumen [ml]. 2. [cm ]. Cuadrado total. 1.00 x 10. Cuadrado grande. 4.00 x 10. Cuadrado pequeño. 2.50 x 10. -2. -4 -5. 2.00 x 10 8.00 x 10 5.00 x 10. -5. -7 -8. Factor [1/Vol.] 5.00 x 10 1.25 x 10 2.00 x 10. 4. 6 7. •. Medida de células por dispesión de la luz: el sistema se basa en que las células en suspensión dispersan la luz causando la turbidez del cultivo. La turbidez depende de la masa en suspensión y, por tanto, midiendo esta se puede estimar aquella. Este es el parámetro de medida más fácil de usar en los cultivos de laboratorio. La densidad de células debe ser del orden de 105 por ml.. •. Medida usando contadores electrónicos de partículas. Estos sistemas no nos indican si las partículas corresponden a células vivas o muertas; pero nos pueden dar una idea del tamaño de las partículas.. •. Medida de parámetros bioquímicos tales como la cantidad de ADN, ARN, proteínas, peptidoglicano, etc. por unidad de volumen.. 29.
(30) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. •. Medida de actividad metabólica de las bacterias como que respiran producen una disminución del potencial redox del medio en que se encuentran como consecuencia del consumo de oxígeno (utilización de colorantes sensibles a oxidación-reducción tales como el azul de metileno).. Si el sustrato es glucosa su concentración se puede medir haciéndola reaccionar con ácido 3,5-dinitrosalicilico (DNS), el cual se oxida a ácido 3-amino-5-dinitrosalicilico pasando de un color amarillo a un color rojizo, la concentración de glucosa se mide a través de la lectura de la absorbancia en un espectrofotómetro a 575 nm, habiendo realizado una calibración previa. Para el cálculo de los parámetros cinéticos se toman logaritmos en la ecuación de la X concentración de células en función del tiempo (ecuación x). Si se representa el ln Xo En función del tiempo, la curva es una recta en la que la pendiente es la tasa de crecimiento y el término independiente el producto t lag del cual se obtiene el tiempo de letargo. X X oe. . t tlag. . ln. X t tlag Xo. Ejemplo 6 Los datos siguientes corresponden al crecimiento de Rhodospirillum rubrum sobre ácido acético. Calcúlese la duración del periodo de latencia en este cultivo y el tiempo de duplicación. X (g/L) 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0002 0,0012 0,0027 0,0061 0,0135 0,0301 0,0670 0,1492 0,3320 0,7398 1,6445 2,0500 2,2100 2,3500 2,4000 2,4500 2,4500 2,4700 2,4800 2,4800. 3,0 2,5 X (g/l). Tiempo (h) 0 15 30 45 60 80 100 110 Fase de 120 crecimiento 130 exponencial 140 150 160 170 Fase 180 estacionaria 190 200 210 220 230 240 260 270 280. Fase de letargo. 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0. 100. 200. 300. t (h). Figura 9. Variación de la concentración de células del biorreactor del ejemplo 4. 30.
(31) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Para el cálculo se determina el logaritmo neperiano de la relación que existe entre la concentración celular y la concentración inicial. A partir de este valor se representa una recta en función del tiempo cuya pendiente es la tasa de crecimiento celular.. LN(X/Xo). 100. 0,003. 2,603. 110. 0,006. 3,418. 120. 0,014. 4,212. 130. 0,030. 5,014. 140. 0,067. 5,814. 150. 0,149. 6,615. 160 170. 0,332 0,740. 7,415 8,216. LN(X/Xo). Tiempo (h) X (g/L). 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 0,0. y = 0,0801x - 5,4003. 0,0. 50,0. 100,0 t (h). 150,0. 200,0. Figura 10. Liberalización de la variación de células ln2 t lag 5,4003 , 0,0801 h 1 , t lag 67,4 h , t d 8,65 h . . Fin.. Ejemplo 7 Se ha llevado a cabo una fermentación aerobia en discontinuo del microorganismo con Candida Rugosauna concentración inicial de ácido oleico de 4 g/l. En el transcurso de la fermentación se ha realizado el seguimiento de la biomasa. Los resultados se recogen en la siguiente tabla A partir de estos datos calcular: 1) La velocidad específica de crecimiento 2) El rendimiento biomasa / sustrato. Biomasa Sustrato (g/l) (g/l) 8 0 0,48 5 0,6 7,94 1 7,60 10 1,5 7,18 12 14,5 3,1 5,81 5,8 3,50 16 8,9 0,85 17,25 9,6 0,25 20 9,5 0,34 23. Biomasa (g/l). t (h). 12 10 8 6 4 2 0 0. 5. 10. t (h). 15. 20. 25. Figura 11. Variación de la concentración de células del biorreactor del ejemplo 5. 31.
(32) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. X1 X 0 → S 0 S1. t (h). Biomassa (g/l). 0. 0,48. Yx / s . 9,5 0,48 1,17 g biomasa/g sustrato 8 0,34. LN(X/Xo). 5. 0,6. 10. 1. 0,73. 12. 1,5. 1,14. 14,5. 3,1. 1,87. 16. 5,8. 2,49. 17,25 20 23. 8,9 9,6 9,5. 2,92. LN(X/Xo). Yx / s . 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 0,00. y = 0,306x - 2,4387 R² = 0,9858. 0. 5. 10 t (h). 15. 20. Figura 12. Linealización de la variación de concentración de células. 0,306 h 1 , t lag 2,387 , t lag 7,93h. Fin,. Experimento en continuo Como se ha mostrado en los ejemplos 4 y 5 no es posible calcular la constante de saturación Ks de un experimento donde no se determine la velocidad de crecimiento celular. En un reactor experimental trabajando en discontinuo la tasa de crecimiento celular se puede estimar midiendo la variación de concentración en periodos muy cortos de tiempo mediante la ecuación (28). Pero esta estimación soso sirve si el intervalo t1-t2 es pequeño,. . X1 X 0 X 0 (t1 t 0 ). (28). Otra opción es realizar el experimento en un reactor continuo en laboratorio a través de una pequeña bomba peristáltica de alimentación y evacuación de caldo. Determinando las condiciones de trabajo para distintas tasas de crecimiento celular se representa las inversas de la tasa de crecimiento frente a la inversa de la concentración de sustrato. A partir de la ecuación de Monhod se puede comprobar que esta relación es un línea recta cuya pendiente es Ks/ µmax y el término independiente es la 1/µmax. Las diferentes tasas de crecimiento se consigue modificando el caudal de alumentación puesto que µ=F/V.. . max S Ks S. →. 1. . . 1. max. . KS 1 max S. 32.
(33) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Ejemplo 8 En la tabla siguiente se indican las concentraciones de sustrato y biomasa en un biorreactor continuo de tanque agitado operando en estado estacionario a varias velocidades de dilución. Si la concentración de sustrato en la alimentación es de 70 g/l calcular los valores de las constantes de Monod KS y µmax y los rendimientos. A la tasa de crecimiento también se le llama dilución. En la tabla se muestran las inversas de la tasa de crecimiento y la inversa de la concentración de sustrato cuya relación lineal se representa en la gráfica. µ (h-1). 1/mu. 0.30 0.25 0.20 0.12 0.08. Sustrato (g/l) 4.5 4.1 1.6 0.8 0.4. Biomasa (mg/l) 3.26 3.36 3.96 4.06 4.16. 14 12 10 8 6 4 2 0 0,00. 1/µ 3.33 4.00 5.00 8.33 12.50. 1/S 0.22 0.24 0.63 1.25 2.50. Yx/s 0.0000498 0.0000510 0.0000579 0.0000587 0.0000598. y = 3,9714x + 2,7881 R² = 0,9891 1,00. 2,00. 3,00. 1/S. Figura 13. Relación entre la inversa de la tasa de crecimiento y la inversa de la concentración de sustrato 1. KS. max. 3.9714 ,. 1. max. . 1. max. . KS 1 max S. 2.7881 , K S 1.424 g/l , max 0.3586 h -1. Fin. A través de este tipo de ensayo se puede determinar el tipo de inhibición que producen distintas sustancias. Una sustancia con inhibición competitiva la recta que relaciona 1/µ y 1/S tendrá un cambio de pendiente respecto a la recta obtenida sin inhibición tomada como control, pero tendrá el mimo término independiente (punto de corte con la abscisas). En una inhibición no competitiva la recta se modificaran ambos, la pendiente y el término independiente, respecto al del control.. 33.
(34) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. . Sin inhibición. Inhibición competitiva. Inhibición no competitiva. max S Ks S. max . S Ks a S. max a. 1. →. S Ks S. →. →. 1. 1. . . . . 1. max 1. max a. max. . KS 1 max S. . KS a 1 max S. . KS a 1 max S. Ejemplo 9 Se obtienen los siguientes datos de velocidad de reacción primero con ausencia de sustancias inhibidoras (control) y después bajo la presencia de L y M, en la concentración que se indica en la tabla, que son inhibidores de esta enzima. Las unidades de velocidad son siempre en nmol/min. Determínese gráficamente qué tipo de inhibición causan L y M y determina las constantes aparentes a y Ki. µ(control) (min-1) 16,67 20,00 24,70 30,00 50,50 66,67 70,00 71,50 80,00 81,00. S (mM) 0,20 0,25 0,33 0,50 1,00 2,00 2,50 3,33 4,00 5,00. µ con L (6µM) 5,75 7,69 10,00 14,29 25,00 40,00 45,45 52,63 57,14 62,50. µ con M (30 µM) 5,56 6,67 8,33 12,11 16,67 22,22 23,81 25,64 26,67 27,77. A partir de los datos de la tabla del enunciado se calculan las inversas de la tasa de crecimiento y de la concentración de sustrato en cada uno de los experimentos. A partir de éstas se representan las rectas correspondientes.. 1/ µ 0,06 0,05 0,04 0,03 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01. 1/s 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,50 0,40 0,30 0,25 0,20. 1/ µ L 0,17 0,13 0,10 0,07 0,04 0,03 0,02 0,02 0,02 0,02. 1/ µ M 0,18 0,15 0,12 0,08 0,06 0,05 0,04 0,04 0,04 0,04. 34.
(35) 1/µ. Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 0,00. y = 0,0299x + 0,0294 R² = 0,998 y = 0,0317x + 0,0086 R² = 0,9965 y = 0,01x + 0,0105 R² = 0,9965 1,00. 2,00. 3,00. 4,00. 5,00. 6,00. 1/S Control. Con Inhibidor L. Control. KS. max. 0,010 ,. 1. max. Con Inhibidor M Con inhibidor L. 0,011 min,. K S 0,952 mM , max 95,238 min -1. K S a. max. 0,032 ,. 1. max. 0,009 min,. K S a 3,686 , max 116,279min -1 K S 0,952 mM , a 3,870 , K i 0,0021mM Inhibición competitiva. Con inhibidor M. K S a. a. 0,0294 min, max max K S a 3,686 , K S 1,017 mM , a 2,8 , K i 0,0017mM 0,0299 ,. Inhibición no competitiva. Fin.. 6. Bombas y conexiones. Una vez calculados los flujos de entrada y salida del bioerreactor se pueden dimensionar las bombas. La bomba convierte energía mecánica, procedente de un motor eléctrico (o endotérmico), en energía hidráulica. La potencia hidráulica (Nh) se manifiesta en hacer circular un caudal de un fluido (Q) a determinada presión (P). Nh Q P El caudal de un circuito indica la cantidad de fluido que circula en un conducto por unidad de tiempo. Resulta, por tanto, del producto de la velocidad de circulación del fluido (v) por la sección de la tubería (S). 35.
(36) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Q vS. Generalmente los biorreactores requieren presiones pequeñas aunque la alimentación y evacuación de caldo se suelen hacer por la parte inferior para evitar la entrada accidental de aire, que podría contaminar el proceso. La presión necesaria en la bomba se calcula de acuerdo a la ecuación de Benouilli.. Pbomba. . Pbomba. . P v 2 P v 2 Ppérdidas z o o o z1 1 1 2g 2g. P1 Po v12 vo 2 Ppérdidas ( z1 z o ) 2 g 2 g . Donde z o Po y vo son la altura, presión y velocidad de circulación antes de la bomba y v2 v 2 z1 , P1 y V1 después de la bomba. 1 o y Po suelen ser cero y z1 es la altura del 2g 2g medio de cultivo dentro del reactor Se entiende por desplazamiento o cilindrada de la bomba, el volumen de fluido activado por revolución; la posibilidad de regulación de la velocidad de giro, permite una variación continua de caudal suministrado por las bombas, principalmente en las máquinas de paletas y pistones. No obstante no todo el volumen de fluido movilizado por la bomba se integra en el caudal útil proporcionado, pues existe una recirculación en su interior debido a las pequeñas holguras de los elementos impulsores. Además de estas recirculaciones pueden existir fugas al exterior originadas por la imperfección de la estanqueidad. A la relación entre el caudal útil que proporciona la bomba y el caudal total que pone en movimiento se le denomina rendimiento volumétrico.. v . Q Q qi q e. donde Q es el caudal útil proporcionado por la bomba, qi caudal que recircula en el interior y qe es el caudal que se pierde por fugas al exterior. De la presión generada en el interior de la bomba, también existe una parte que se pierde por las turbulencias existentes en el fluido o por el rozamiento de las partículas con las superficies internas del propio dispositivo. Por tanto, también será necesario definir un rendimiento hidráulico, que será la relación entre la presión real disponible a la salida de la bomba y la presión generada en su interior.. 36.
(37) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. h . P P Pi. siendo P la presión a la salida de la bomba y Pi pérdidas de presión en el interior. Además en el acoplamiento bomba-motor existen rozamientos entre las piezas que componen los diferentes elementos. Esto dará lugar a unas pérdidas de energía mecánica. La relación entre la energía mecánica utilizada para su transformación en energía hidráulica y la consumida se denomina rendimiento mecánico m . Finalmente la potencia hidráulica obtenida será N h Q P , y la potencia demanda al motor vendrá dada por QP N demand v h m Las bombas quedan definidas a partir de sus curvas características. Las curvas características de una bomba relacionan el caudal y la presión proporcionados, indicando el rendimiento total obtenido. Las bombas las podemos clasificar en rotativas o de movimiento alternativo. Las bombas rotativas para su funcionamiento requieren que estén cebadas, es decir, llenas de fluido. Éstas pueden ser centrífugas, de engranajes, de paletas, o persistálticas. Las bombas de movimiento alternativo pueden ser de membrana o de pistones. Bombas rotativas de engranajes o lóbulos Estas máquinas son de construcción sencilla, utilizan ruedas dentadas o de lóbulos, entre cuyos intersticios queda retenido el fluido. Suelen ser de tamaño reducido, fácil acoplamiento y de mayor tolerancia a la suciedad. De forma general, las máquinas de engranajes y lóbulos pueden trabajar con presiones máximas de 140 bares, aunque existen modelos 250 bares; los caudales pueden oscilar de 1 a 600 1/min, y la velocidad de giro se sitúa sobre un valor máximo de 2400 rev/min.. Figura 14. Bombas rotativas de engranajes y lóbulos. 37.
(38) Aprovechamiento de la biomasa para uso energético. Bombas paletas Estas bombas están constituidas por una cámara fija llamada estator de diseño circular o elíptico y un rotor en el que unas paletas sueltas van alojadas en unas ranuras que permiten su desplazamiento por su interior. En estas máquinas el rotor se encuentra descentrado respecto al estator. El desplazamiento de las paletas hacia el exterior chocando contra el estator es debido a la fuerza centrífuga del movimiento giratorio. Al sobresalir empuja al fluido haciéndolo discurrir por un volumen variable lo que le confiere la presión. La cilindrada se puede regular variando la excentricidad.. Figura 15. Bomba rotativa de paletas Las máquinas de paletas equilibradas se han diseñado para trabajar con presiones de un orden similar a las de engranajes. En las desequilibradas no sobrepasan los 70 bar; los caudales y velocidades de giro son de mayor valor (de 2 - 950 litros/min y 4000 rev/min como máximo), y mejoran los rendimientos totales. Bombas peristálticas Las bombas peristálticas constan de una tubería de goma flexible y un rotor con varias levas. Al girar las levas van presionando la goma empujando el fluido que queda ocluido en la tubería. Este proceso es llamado peristalsis por similitud a los sistemas biológicos de transporte como en el aparato digestivo. Este tipo de bombas es el más usado cuando se desean condiciones elevadas de asepsia, para evitar contaminaciones del cultivo, dado que permite una desinfección sencilla pasando un fluido desinfectante limpiador por la tubería.. 38.
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