Sistemes antioxidants

Les defenses antioxidants es poden sintetitzar in vivo o obtenir de la dieta. Aquestes inclouen enzims que poden eliminar els ROS (superòxid dismutases, superòxid reductases, catalases i peroxidases), enzims que disminueixen la formació de ROS (proteïnes desacoblants mitocondrials, transferrines, albúmina, haptoglobina, hemopexina, hemo-oxigenases, metaolotioneïnes i poliamines), proteïnes que protegeixen les molècules del dany oxidatiu (xaperones), i molècules que extingeixen els ROS i són oxidades de manera preferent per preservar molècules més importants (carotenoids, glutatió, α-tocoferol, bilirubina, ascorbat, urat, albúmina i plasmalògens). També es podrien classificar com a antioxidants els sistemes de reparació del DNA i dels centres Fe-S o els que degraden els lípids i les proteïnes.

La superòxid dismutasa que conté coure i zinc (CuZn SOD o SOD1) va ser aïllada el 1938 per Mann i Keilin els quals la van anomenar hemocupreïna pel seu color blau/verd. Fins el 1970 McCord i Fridovich no van descriure que podia catalitzar l’eliminació de l’anió superòxid. La SOD1 és un enzim molt resistent; es pot aïllar amb etanol i cloroform, precipitar amb acetona i és molt resistent a la calor i a la desnaturalització. L’enzim s’ha detectat al citosol, els lisosomes, els peroxisomes, el nucli i l’espai intermembranós mitocondrial. Un altre tipus de SOD amb Cu i Zn s’ha detectat a l’espai extracel·lular, i s’anomena SOD3. La SOD1 és dimèrica i té la funció d’accelerar la dismutació de l’O·- gràcies al zinc (que estabilitza) i al coure (que catalitza) del centre actiu. La His61Bt/63Hs

podria donar els protons. La superfície té càrrega negativa i repel l’O·-, excepte per uns “camins o vies” positius que porten al centre actiu. Una altra SOD es va aïllar primer de bacteri va resultar ser de color rosa i més sensible a la purificació. Era la SOD2 o la MnSOD, que sol ser més sensible i conté Mn al centre actiu. Aquesta sol ser tetramèrica en mamífers i es troba als mitocondris. La seqüència d’aminoàcids no està relacionada amb la CuZnSOD (Fridovich, 1995). El ratolí KO de SOD2 viu només deu dies i presenta anormalitats cardíaques, acumulació de greix al fetge i el múscul esquelètic i acidosi metabòlica (Hinerfeld et al., 2004). Amb interferència d’RNA s’ha vist que les mosques amb la MnSOD silenciada tenen menys activitat aconitasa i succinat-deshidrogenasa (Kirby, Hu, Hilliker, & Phillips, 2002). Es creu que el Mn per si sol podria reemplaçar la SOD actuant com a quelant d’O2·- (Al-Maghrebi, Fridovich, & Benov, 2002; Lapinskas, Cunningham, Liu, Fink, & Culotta, 1995).

La catalasa descomposa l’H2O2 en H2O i O2 i està present a tots els òrgans. És molt abundant al fetge i als eritròcits i menys abundat al cor i al cervell. La catalasa consta de quatre subunitats, cada una amb un Fe (III)-hemo al centre actiu que queda a l’interior i es conecta per canals estrets que permeten només el pas d’H2O2. Cada subunitat conté també un NADPH. La major part de catalasa es troba als peroxisomes (excepte als eritròcits). Els mitocondris de cor de rata contenen catalasa a la matriu (Antunes, Han, & Cadenas, 2002; Lardinois, 1995; Reid et al., 1981).

Les glutatió peroxidases (GPX) neutralitzen l’H2O2 acoblant la seva reducció a H2O amb l’oxidació del glutatió reduït (GSH). A més del peròxid d’hidrogen, poden reduir a alcohol altres peròxids, com els hidroperòxids d’AG. Hi ha com a mínim quatre tipus de GPX. La GPX1 és citosòlica i també s’anomena “clàssica”. El plasma conté, sobretot GPX3, que també es troba en altres fluids extracel·lulars però no se sap si hi té activitat perquè la concentració del GSH en plasma és baixa. La GPX2 es troba al tracte gastrointestinal. La GPX4 (o fosfolípid hidroperòxid glutatió peroxidasa) té l’habilitat de reduir els hidroperòxids d’AG i el colesterol esterificat però la seva activitat és baixa a la majoria de teixits. Les GPX1, 2 i 3 estan formades per quatre subunitats que contenen cada una un àtom de seleni (Se) al centre actiu. La GPX4 actua com a monòmer i conté només un àtom de seleni. El seleni pertany al grup VI de la taula periòdica i s’assembla molt al sofre en la

seva química. Al centre actiu s’hi troba en forma de selenocisteïna, una cisteïna on el sofre s’ha reemplaçat per un seleni (R-SeH).

Traces de seleni són essencials a la dieta per proveir selenocisteïnes a la família de les GPX. Si es depriven els rosegadors de seleni, l’activitat de la GPX1 disminueix molt ràpid mentre que la GPX2 i 4 es mantenen, potser perquè tenen un paper més important in vivo. A més, el seleni deu jugar un paper clau al cervell, perquè és l’últim òrgan on s’esgota si els animals es depriven de seleni (Brigelius-Flohé, 1999). Altres proteïnes essencials que contenen seleni són enzims de la síntesi de l’hormona tiroïdal, la selenoproteïna P (que es troba al plasma transportant seleni als teixits i podria actuar com a antioxidant), la selenoproteïna W (que és intracel·lular i també podria tenir propietats antioxidants), la tioredoxina-reductasa i la metionina sulfòxid-reductasa (Burk & Hill, 2005; Jeong, Kim, Chung, Lee, & Kim, 2002). El dèficit de seleni sol ser similar al dèficit d’α-tocoferol i afecta el cor, el múscul i la fertilitat. De fet, normalment es pot contrarestar amb suplements de l’α-tocoferol (Brigelius-Flohé & Traber, 1999; Tramer, Rocco, Micali, Sandri, & Panfili, 1998).

Les ràtios de glutatió reduït i oxidat es mantenen gràcies a les glutatió-reductases, que catalitzen la reacció gràcies al NADPH. Aquests enzims tenen dues subunitats, cada una amb un FAD al centre actiu (Berkholz, Faber, Savvides, & Karplus, 2008; Deponte, 2013). El NADPH s’obté per diferents vies, essent majoritària l’aportació de la via de les pentoses fosfat. El flux d’aquesta via es controla per l’aportació de NADP+, així, si disminueix la ràtio NADPH/NADP+ la via s’accelera. Una altra font (al citosol i, sobretot, als mitocondris) és la isocitrat-deshidrogenasa depenent de NADPH, enzim que a la vegada és diana de les ROS (Maeng et al., 2004).

A més d’actuar com a cofactor pels enzims GPX, el GSH està involucrat en molts altres processos metabòlics, com en el metabolisme de l’ascorbat, en mantenir la comunicació entre cèl·lules a través de les unions gap, i en evitar l’oxidació i l’entrecreuament dels grups tiol de les proteïnes. Com que la concentració de glutatió és alta, la parella GSH/GSSG contribueix de manera important a l’estat redox de la cèl·lula. Si s’assumeix que hi ha una concentració de 10 mM, amb l’1% d’aquest en estat oxidat, el potencial de

reducció és de -250 mV (major al reticle endoplasmàtic perquè hi ha més GSSG i diferent al mitocondri perquè té un pH més alt gràcies al gradients de protons). El glutatió també podria ser el donant de coure a la CuZnSOD. El GSH pot reaccionar amb molts radicals lliures i, com que es troba en concentració molt alta a la cèl·lula, és un dels principals “neutralitzador” de les ROS. A més, com que se sap que pot quelar Cu (i potser també Fe), disminueix la generació de ROS catalitzada per metalls. El GSH es sintetitza al citosol de totes les cèl·lules animals. Els mitocondris contenen entre un 10 i un 20% de glutatió, que es transporta a través de la membrana interna (Fernandez-Checa & Kaplowitz, 2005). La γ-glutamilcisteina-sintetasa (γ-GCS) catalitza la primera i limitant reacció de la síntesi del glutatió. El dipèptid que es forma es converteix a GSH després gràcies a la glutatió- sintetasa. La γ-GCS s’inhibeix per GSH i no està saturada a concentracions normals de cisteïna, així, com més cisteïna, més síntesi de GSH hi ha. El glutatió reduït es troba en un estat constant de renovació, amb una vida mitjana d’uns 3 dies a la sang i de 3 hores al fetge. L’enzim γ-glutamiltranspeptidasa (γGGT) pot trencar el glutatió i transfereix el glutamat a un altre residu de cisteïna, metionina i glutamina extracel·lulars. El dipèptid cys-gly pot ser digerit per les dipeptidases.

Les glutatió-S-transferases (GST) acostumen a catalitzar la conjugació del glutatió amb els xenobiòtics per detoxificar-los. Sembla ser que moltes GST serveixen com a proteïnes transportadores d’hemo, bilirubina, pigments de la bilis i hormones tiroïdals i esteroïdals. Les GST citosòliques formen dímers de diferents subunitats codificades per diferents gens (com a mínim se n’han identificat set en mamífers). Les subclasses alfa, mu i pi són les més abundants i augmenten quan s’exposen els animals a xenobiòtics a través dels elements de resposta antioxidant (ARE). Algunes GST tenen activitat semblant a les GPX i poden catalitzar les reaccions amb peròxids orgànics i GSH formant GSSG i alcohols. Es creu que algunes GST podrien jugar un paper protector en la peroxidació lipídica i metabolitzar els productes finals tòxics com el 4-hidroxinonenal (Hayes, Flanagan, & Jowsey, 2005). La majoria del glutatió està lliure però també pot estar formant disulfurs mixtes amb altres compostos que continguin tiols com les cisteïnes, el coenzim A o residus amb tiols de proteïnes (entre elles la CuZnSOD). Si els tiols de proteïnes reaccionen amb el GSSG s’anomena S-glutatiolació proteica, la qual, a vegades, pot inactivar les proteïnes. Entre aquestes es troben la G3PDH, l’enolasa, l’isocitrat-

deshidrogenasa, la fosfofructoquinasa i l’adenilat-ciclasa. El complex I també pot ser glutatiolat provocant l’augment de producció d’O2·- (Beer et al., 2004). L’acumulació de GSSG també pot inhibir la síntesi proteica. En cèl·lules exposades a estrès oxidatiu, els disulfurs mixtes de glutatió amb proteïnes i altres tiols s’acumulen tant a mitocondris com a citosol. Per una banda, el GSSG es podria mantenir baix pel fet de ser tòxic, però per l’altra es pot mirar com una modificació protectora, ja que en ser reversible, pot protegir els grups tiols de les proteïnes d’oxidacions més greus. Axí, la cèl·lula podrà recuperar les proteïnes usant GSH quan l’equilibri redox es restauri. Les glutaredoxines (GRX) són les encarregades d’accelerar la “desglutatiolació”. Aquestes es troben a mitocondris, nucli i citosol i poden reduir-se directament per GSH (Ghezzi, Bonetto, & Fratelli, 2005; Shelton, Chock, & Mieyal, 2005).

Els enzims proteïna disulfur isomerasa (PDI) que s’han tractat anteriorment són xaperones que assisteixen a les proteïnes durant el plegament. Es troben a l’ER a concentracions prop de mM i catalitzen la formació de ponts disulfur nous o la reorganització dels ja existents. La ràtio GSH/GSSG és menor al ER per afavorir la formació de ponts disulfur (Gruber, Cemazar, Heras, Martin, & Craik, 2006).

Les tioredoxines (TRX) funcionen reduïnt la ribonucelòtid reductasa (l’enzim que catalitza la formació de deoxiribonucleòtids des de ribonucleòtids) i les metionina sulfòxid reductases (enzims que reparen el dany oxidatiu als residus de metionina de les proteïnes). Les TRX són polipèptids de baix pes molecular i n’hi ha de diferents, essent més estudiades la TRX1 (citosòlica) i la TRX2 (mitocondrial). Aquestes contenen dos grups –SH que formen un disulfur quan s’oxida i redueix la proteïna oxidada que li fa de substrat. Moltes proteïnes tenen dominis similars a les TRX, com per exemple les GPx, les GST i les PDI. In vivo, les TRX es redueixen gràcies a les tioredoxina-reductases (TRR), enzims que contenen seleni (com a selenocisteïna) i FAD, i usen NADPH per a reduir-se (Nordberg & Arnér, 2001; Rhee, Yang, Kang, Woo, & Chang, 2005).

Les peroxiredoxines (PRX) són una família de peroxidases que redueixen el peròxid d’hidrogen i altres peròxids orgànics. Són homodímers i no contenen grups prostètics, així que la reacció redox depèn de les cisteïnes dels centres actius. N’hi ha tres tipus, les

típiques amb 2-cys, les atípiques amb 2-cys i les d’1-cys. En tots els casos, el peròxid oxida un grup –SH de la peroxiredoxina i forma un àcid sulfènic que reacciona amb un altre grup –SH per formar un disulfur. En les PRX típiques el segon tiol és de la segona subunitat i en les atípiques de la mateixa subunitat. En les PRX d’1-cys no se sap qui és el reductant que regenera el grup –SH. Sembla que les PRX són més importants a l’hora d’eliminar els peròxids que la catalasa o la GPX1 i poden arribar a ser l’1% de la proteïna soluble total de les cèl·lules de mamífer. S’en coneixen fins a sis tipus, les PRX1, 2 i 6 són citosòliques, la PRX3 és mitocondrial, la PRX4 extracel·lular i d’ER, i la PRX5 és mitocondrial i peroxisomal (Rhee et al., 2005).

Altres compostos que contenen sofre també actuen d’antioxidants. En mamífers trobem l’ergotioneïna (d’origen vegetal i fúngic) que té una funció desconeguda però que in vitro pot quelar ferro i coure, a més de reaccionar amb diferents espècies radicals (Akanmu, Cecchini, Aruoma, & Halliwell, 1991).

Una altra estratègia de defensa antioxidant és “segrestar” els metalls de transició més reactius amb les espècies radicals, que són el coure i el ferro. Les proteïnes que participen en el control del ferro són la transferrina, la lactoferrina i les ferritines. Pel coure existeixen la ceruloplasmina, la transcupreïna, la mateixa albúmina i altres xaperones (Prohaska & Gybina, 2004; Walter et al., 2002). També les metal·lotioneïnes (MT) poden segrestar coure (també zinc i magnesi). Aquestes tenen un pes molecular molt baix i es troben al nucli i al citosol de les cèl·lules eucariotes. Existeixen tres isoformes, l’MT-I i l’MT-II, que són ubiques, i l’MT-III, que es troba al cervell i al ronyó. Aquestes tenen moltes cisteïnes que poden lligar els metalls amb enllaços tiolats (Conrad, Grabowski, Walter, Sabia, & Richardson, 2000; Tapia et al., 2004). Les hemooxigenases (HO) es troben a l’ER i catalitzen la descomposició del grup hemo en biliverdina, alliberant ferro i CO. La biliverdina es converteix a bilirubina gràcies a l’enzim-biliverdina-reductasa del citsosol. Hi ha tres isoformes, l’HO-2 és constitutiva, l’HO-1 és induïble en resposta a l’estrès, i l’HO-3, que té poca activitat i actua més aviat de proteïna que uneix hemo. No són ben bé antioxidants perquè descomposen el grup hemo que és pro-oxidant generant un antioxidant (bilirubina) i un altre pro-oxidant (ferro) (Morse & Sethi, 2002). Cal dir que el cor és particularment sensible a l’NTBI, potser perquè té poques defenses antioxidants

(l’activitat catalasa cardíaca és lleu i les activitats de les SOD i les GPx només moderades). També ho són les cèl·lules β-pancreàtiques (Halliwell & Gutteridge, 2007).

Figura 38. Esquema dels diferents enzims antioxidants. Principals enzims que detoxifiquen les espècies radicals de l'oxigen i el nitrogen. CAT (catalasa), SOD (superòxid dismutasa), GPX (glutatió peroxidasa), GR (glutatió-reductasa), GST (glutatió-S-transferasa), PRX (peroxiredoxina), HO (hemo-oxigenasa) (H. Zhu, Zhang, Amin, & Li, 2008).

Moltes molècules de baix pes molecular, a més a més del glutatió, i altres compostos amb sofre poden actuar d’antioxidants. Algunes es sintetitzen in vivo i altres s’obtenen de la dieta. Entre aquestes hi ha la taurina i la hipotaurina, les poliamines, els plasmalògens i els productes derivats del triptòfan. També la bilirubina, els α-cetoàcids (piruvat, glioxilat i α-cetoglutarat poden reaccionar amb el peròxid), la melatonina, l’àcid lipoic (component de la piruvat i la α-cetoglutarat-deshidrogenasa que pot reaccionar amb diferents radicals i unir ferro i coure), el coenzim Q (que a més de participar a l’ETC es troba en membranes i lipoproteïnes, inhibeix la peroxidació lipídica i pot regenerar l’α-tocoferol), l’àcid úric (que com a urat està present en altres dosis i fa de scavenger de diversos radicals) i els dipèptids que contenen histidina (que es troben a concentracions altes en múscul i que poden quelar coure amb l’anell imidazol a més de diferents radicals, peròxids i aldehids). Dels compostos provinents de la dieta destaquen l’àcid ascòrbic (o vitamina C), la vitamina E, els carotenoids (o vitamina A) i els fenols vegetals (Halliwell & Gutteridge, 2007).

113

Per una banda, la miocardiopatia és un dels problemes més importants en l’FRDA i la pateixen gairebé tots els malalts en graus diferents (Harding, 1981). Tot i que la fallida cardíaca és la causant de la majoria de les morts (Hanley, Corrigan, Mohammad, & MacMahon, 2010), es troba poca literatura, ja que la majoria de publicacions es centren en la neuropatologia. Des de 1966, hi ha menys de 200 publicacions sobre el cor, en canvi n’hi ha més de 2500 sobre aspectes neurològics de la malaltia (Payne, 2011). D’altra banda, els models animals d’FRDA han estat molt importants per entendre la biologia bàsica i les implicacions clíniques de la malaltia, tot i que cadascun d’ells té les seves limitacions. El primer ratolí model va ser creat al laboratori de Puccio: KO condicional depenent de Cre restringit a cor i cervell o a cor i múscul esquelètic (Puccio et al., 2001). L’excisió de l’exó 4 provoca una reducció total de frataxina, fet que difereix dels humans malalts, els quals tenen un nivell residual baix i variable d’expressió de la proteïna frataxina. Aquests ratolins tenen un fenotip molt fort i el 80 per cent moren abans de 30 dies. L’altra estratègia utilitzada ha estat generar ratolins KI amb el gen humà que conté les expansions del trinucleòtid GAA. S’ha fet servir als laboratoris de Pook (Al-Mahdawi et al., 2008) i de Pandolfo (Miranda et al., 2002). Tot i que el genotip s’assembla més al de la malaltia, el fenotip d’aquests animals és menys sever, i al cap d’un any de vida encara no tenen una patologia clara a nivell cardíac. A més, pel que fa a la investigació in vitro amb cultius cel·lulars, no s’ha estudiat el dèficit de frataxina en miòcits cardíacs. Malgrat que recentment s’han publicat treballs que usen iPSC derivades a cardiomiòcits, l’eficiència de diferenciació és baixa i les cèl·lules no adopten del tot les propietats típiques dels cardiomiòcits (Hick et al., 2013; J. Liu et al., 2011). Tenint en compte aquests antecedents, els objectius d’aquest estudi són els següents:

1. Analitzar el metabolisme del ferro i dels centres ferro-sofre en aquest model 2. Estudiar la funció mitocondrial i el metabolisme energètic d’aquests miòcits 3. Analitzar l’estat oxidatiu i les defenses antioxidants d’aquestes cèl·lules

117

1. ANIMALS D’EXPERIMENTACIÓ

Per aquest estudi s’utilitzen rates de la soca Sprague Dawley de l’espècie Rattus norvegicus mantingudes en condicions estàndars i amb menjar i aigua disponibles ad libitum. Les condicions de cria segueixen la normativa de la Generalitat de Catalunya (DECRET 214/1997, de 30 de juliol, pel qual es regula la utilització d'animals per a l’experimentació i per a altres finalitats científiques) pel que fa a la temperatura, la humitat, els cicles de llum/foscor controlats, la higiene, el menjar i la beguda. Els procediments d’experimentació han estat evaluats i aprovats pel Comitè Ètic d’Experimetació Animal (CEEA) de la Universitat de Lleida (UdL). Els animals nounats es sacrifiquen per decapitació d’acord amb la guia American Veterinary Medical Association

(AVMA) Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2013 Edition.

2. TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR