Sol. B: Concentración enzimático inulinasa. Sol. C: Solución sustrato sacarosa 20 g/L
Tabla 01: Técnica experimental para determinación de parâmetros cinéticos: Nº muestra Solución A (ml) Solución B (ml) Solución C (ml) Concentración de sacarosa g/l 1 26 1 3 2 23 1 6 3 20 1 9 4 18 1 11 5 15 1 14 6 12 1 17 7 9 1 20 8 6 1 23 9 3 1 26 10 0 1 29
Tabla 02: Datos experimentales azucares DNS DNS min 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 6 10 15
ZARAGOZA– ESPAÑA; cap. 6.
Guisan, J.M.; Bastida, A.; Balnco, R.M.; and Fernández-Lafuente, R. 1997 A.
Immobilization of enzymes on gíioxil-agarose: Strategies for enzyme stabilization by multipoint attachment. En: immobilization of Enzymes and cells. 1, 277-287. (Ed: Gordon, F.) Editorial: Bickerstaff. Humana Press Inc
Guisan J.M; Polo, E.; Agudo, J.; Romero, M.D.; Alvaro, G. and Guerra, M.J. 1997 B.
Immobilization-stabiiization of termolysin onto activated agarose gels. Biocatal. Biotransf. 15, 159-173.
Ingeniería Bioquímica, QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, primera edición. México,
edit. Alhomba, 1981
SCRIBAN RENE; Biotecnologia Segunda Edicion 1985; Editorial El Manual
Moderno, S.A., de C.V. ; Mexico, D.F.; pp. 254 – 315.
Zhenming Chi & Zhe Chi & Tong Zhang & Guanglei Liu & Lixi Yue. Inulinase-
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https://davidbq3.wordpress.com/2013/04/15/ingenieria-de-enzimas-y-sus-
diversas-aplicaciones/
UNIDAD III 78
ACTIVIDAD
MESES
JUNIO JULIO
Martes 16 Jueves 25 Martes 30 Miércoles 1 Martes 7 Martes 14 Viernes 17 Jueves 23 Viernes 24 Recoleccion de materiales: (instrumentos,
reactivos esterilización) X Preparación de reactivos X
Obtención de curva de calibrado de
proteínas y de azúcares reductores DNS X
Recolección de Guía e Información X
Presentación del pre-informe X
Obtención de un caldo crudo de
Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 X X
Rango de Linealidad y Actividad Enzimática X
Determinación de los parámetros cinéticos
de la Enzima Soluble X
Inmovilizar Inulinasa en Geles X
Diseñar y montar el sistema mini-reactor con Enzima inmovilizada, para determinar
los parámetros cinéticos de la enzima.
X
Presentación final del informe X
Un procedimiento simple para la determinación de la concentración de la proteína en soluciones es el análisis de la proteína de Bradford que fue descrito primero por Bradford (Bradford et el al., 1976).
Este método se basa en utilizar un colorante hidrofóbico (comassie blue G-250) cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo que al entrar en contacto con la parte hidrofóbico del interior de una proteína se fija. Las proteínas se unen a la forma azul para formar un complejo proteína-colorante con un coeficiente de extinción mayor que el colorante libre. La determinación del contenido proteico de una muestra requiere la comparación del valor de absorbancia de la muestra con los obtenidos a partir de cantidades conocidas de proteínas, con los que se construye una curva de calibración: a mayor cantidad de proteínas, mayor color desarrollado y por lo tanto, mayor absorbancia, es por ello que se considera un cromóforo exógeno. Es un método que depende de la interacción relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es sensible a la presencia de contaminantes tales como los restos de detergentes y líquidos orgánicos, ya que las proteínas pueden perder su estabilidad y perder su forma nativa, lo que provocaría la perdida de la unión entre el cromóforo y la zona hidrofóbica de las proteínas. Para determinar la concentración total de proteína se realiza una curva de calibración empleando una proteína patrón que generalmente es la seroalbumina bovina. Se preparan tubos testigos con distintas cantidades de proteína y otra disolución llamada“blanco” que solo contiene agua y reactivo Bradford y en los tubos
testigos se les mantiene constante el reactivo Bradford siendo los volúmenes de todos los tubos iguales. Una vez preparados los tubos se mide la absorbancia a cada uno de ellos a una longitud de onda de 595nm, es calibrado el equipo con el tubo blanco (no contiene proteína) de esta manera se construye la gráfica de absorbancia vs concentración. GACESA P. y HUBBLE J. Tecnología de Enzimas 1990
Preparación del reactivo:
- Añadir 1 ml del reactivo de Bradford a los tubos estándar y muestras problemas
preparadas.
- Dejar a temperatura ambiente.
- Leer Absorbancia a 595 nm frente al blanco. - El color es estable 1 hora.
- Se tomó 10 microlitros de cada muestra ya diluidas y se depositó en diferentes
alícuotas, a cada una de ellas se le adicionó 990 microlitros de agua destilada.3.
- Colocar en siete tubos de ensayo albumina en diferentes proporciones 0, 5, 10,
25,40, 50 y 60 microlitros, añadir agua destilada hasta tener un volumen de 200microlitros y posteriormente agregar 800 microlitros de reactivo de Bradford.
- Colocar en otros diez tubos de ensayo 10 microlitros de albumina de las diferentes
alícuotas, 2 muestras de cada alícuota, 190 microlitros de agua destilada y 800microlitros de reactivo de Bradford.
- Posteriormente se medirá la absorbancia a cada una de las soluciones que
contienen los tubos. Estas soluciones deberán ser depositadas en las celdas para que puedan ser leídos por el espectrofotómetro. El tubo uno se tomará como muestra blanco ya que no contiene albumina.
SCRIBAN RENE; Biotecnología Segunda Edición 1985 Comparación con otros métodos:
Este método de BRADFORD (con un rango de linealidad entre 1 y 1.5 ug) es derivado de los colorímetros al igual que método de lowry, una de las ventajas de este método es que es muy sensible pero al trabajar con detergentes muestra cierta interferencia. A comparación del método de LOWRY que es o tiene bastante sensibilidad pero en el trabajo muestra inconvenientes por que no todas las proteínas reaccionan igual, muestra muchas interferencias como detergentes no iónicos, sulfato amónico etc. Se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico, también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye a la absorbancia total. Emilio Fernández (Departamento de Bioquímica y Biología Molecular). Suelter CH (1985).
MÉTODO DEL DNS
Los azúcares reductores son monosacáridos que poseen grupos carbonilos libres, que se obtienen de la hidrólisis ácida y térmica de los polisacáridos. Además de ser la inulinasa una enzima nativa de la levadura lechera Kluyveromyces marxianus, es especialmente
adecuada para la aplicación industrial, por tener la mejor velocidad de crecimiento que cualquier otro microbio eucariote, termo tolerante, con habilidad para crecer sobre los 52 ºC, capacidad de asimilar un amplio rango de azúcares claves, como la lactosa e inulina y una alta capacidad secretoria de enzimas líticas, hacen de éste microorganismo líder de todas las levaduras para muchos procesos biotecnológicos. Kluyveromyces marxianus es
una especie que incorpora muchos sinónimos, se describe como una levadura homotálica, hemiascomyceto, es filogenéticamente relacionada aSaccharomyces cerevisiae y es una
especie hermana de la mejor conocidaKluyveromyces lactis. (Lane y Morrissey, 2010).
Preparación del reactivo:
- Se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua.
- Paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un
Procedimiento:
- Se precisa realizar los siguientes pasos para el análisis de la muestra: - Se añade 1 mL de reactivo DNS a un 1 mL de muestra a analizar.
- Se mantiene la mezcla en baño de agua a ebullición durante 5 minutos para luego
enfriar con agua helada.
- Añadir 10 ml de agua destilada, y se deja reposar por 15 minutos, luego agitar. - Se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando agua como blanco.
- La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de
calibrado.
- La curva de calibrado para el azúcar se obtiene a partir de muestra de
concentración conocida y analizadas según este procedimiento. Seminario, J.; Valderrama, M.; Manrique, I. 2003
SEGÚN INMOBILIZED ENZYMES: THEORY, METHODS OF STUDY AND APPLICATIONS.PDF:
Aunque se han desarrollado y aplicado muchas técnicas de inmovilización a numerosos enzimas, se reconoce que no existe un método universal válido para todos los enzimas en todos los casos. No obstante, gracias a toda la información disponible en la actualidad, se pueden hacer generalizaciones sobre cada método de inmovilización (Tabla 2) y así, podremos seleccionar el más adecuado para cada aplicación específica. La elección ha de tener en cuenta las condiciones de la reacción biocatalizada, el tipo de reactor que se vaya a utilizar, el tipo de sustrato que tenga que ser procesado y otros factores.
Fuerza de
Unión Débil Media
Débil-
Media Media Fuerte
Actividad
Enzimática Media-Alta Baja Baja Media Alta Regeneración
Soporte Posible Imposible Imposible Posible Difícil Coste Proceso Medio-Alto Medio Medio Bajo Alto
Estabilidad Media Alta Alta Baja Alta
Validez General General Limitada General Limitada
Resistencia
Microbiana SI SI SI NO NO
En general, los métodos de preparación difícil y de mayor coste proporcionan biocatalizadores más estables y duraderos; en cambio aquellos métodos más sencillos como el atrapamiento o la adsorción, donde la unión de la enzima con el soporte es débil, originan derivados inmovilizados que presentan pérdidas de actividad y que deben ser repuestos continuamente. Una vez elegido el método más conveniente, los derivados que preparemos deben estar caracterizados según las indicaciones establecidas por el Working Party on Immobilized
Biocatalysts(16):
Descripción general
1. Esquema de reacción 2. Enzimas a insolubilizar 3. Tipo de soporte empleado 4. Método de inmovilización
Preparación:
1. Condiciones de reacción 2. Rendimiento en peso seco
1. Configuración del biocatalizador 2. Grado de hinchamiento
3. Grado de compresibilidad en columna
4. Abrasión en sistemas de agitación 5. Velocidad mínima de fluidización
Cinética: 1. Estabilidad de la enzima almacenada 2. Estabilidad operacional 3. Posibilidad de reutilización 4. Grado de conversión 5. Limitaciones difusionales