FACULTAD DE INGENIERÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA
ESCUELA ACADÉMICO
ESCUELA ACADÉMICO
PROFESIONAL DE
PROFESIONAL DE
INGENIERÍA
INGENIERÍA
AGROINDUSTRIAL
AGROINDUSTRIAL
"AÑO DE LA"AÑO DE LA DIVERSIFICACIÓNDIVERSIFICACIÓN PRODUCTIVA Y DEL
PRODUCTIVA Y DEL FORTALECIMIENTOFORTALECIMIENTO DE LA EDUCACIÓN" DE LA EDUCACIÓN"
“INGENIERÍA DE
“INGENIERÍA DE
ENZIMAS”
ENZIMAS”
CURSO:
CURSO:
LAB. ING. DE BIOPROCESOS.
LAB. ING. DE BIOPROCESOS.
CICLO:
CICLO:
VII
VII
DOCENTE:
DOCENTE:
Dr.Ing. CASTILLO CALDERON Augusto.
Dr.Ing. CASTILLO CALDERON Augusto.
INTEGRANTES:
INTEGRANTES:
CORTEZ CRUZ Cristhian.CORTEZ CRUZ Cristhian.
MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela.MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela.
VEGA VIERA, Jhonas AbnerVEGA VIERA, Jhonas Abner
ALVA DE LA CRUZ Katherine Jhovana.ALVA DE LA CRUZ Katherine Jhovana.
CRUZADO RODRIGUCRUZADO RODRIGUEZ Febe EZ Febe Noemi.Noemi.
G-A2
G-A2
PRE- INFORME DEL EXPERIMENTO
PRE- INFORME DEL EXPERIMENTO
INGENIERÍA DE ENZIMAS
INGENIERÍA DE ENZIMAS
I.
I.
INTRODUCCION:
INTRODUCCION:
Las enzimas, los llamados, catalizadores de la
Las enzimas, los llamados, catalizadores de la vida, son sustancias de alta especificidadvida, son sustancias de alta especificidad que permiten que las reacciones biológicas, normalmente poco probable, se realicen y que permiten que las reacciones biológicas, normalmente poco probable, se realicen y permitan el continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podría decirse permitan el continuo movimiento y avance de las reacciones vitales. Podría decirse que son las moléculas dadoras de vida, que han permitido la evolución de las especies que son las moléculas dadoras de vida, que han permitido la evolución de las especies a lo largo de los años.
a lo largo de los años.
Pese a estar presentes desde el origen de la vida, su conocimiento se reduce a tan solo Pese a estar presentes desde el origen de la vida, su conocimiento se reduce a tan solo algunos siglos. Uno de los primeros desarrollos de este tipo se dio hacia la finalización algunos siglos. Uno de los primeros desarrollos de este tipo se dio hacia la finalización los siglos XVIII. Se descubrió la acción química de ciertas sustancias en la digestión, así los siglos XVIII. Se descubrió la acción química de ciertas sustancias en la digestión, así como ciertos extractos sacarificantes. A finales del siglo XIX Buchner obtuvo una como ciertos extractos sacarificantes. A finales del siglo XIX Buchner obtuvo una solución liquida, extraída de levaduras, que cumplía la misma función fermentativa. solución liquida, extraída de levaduras, que cumplía la misma función fermentativa. Con esto se pudo inferir que un agente químico concreto realizaba tales cambios Con esto se pudo inferir que un agente químico concreto realizaba tales cambios dentro de los
dentro de los microorganimicroorganismos.smos.
Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los Las enzimas son catalizadores de origen biológico que parecen cumplir muchos de los requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química: i.-son catalizadores requisitos necesarios para impulsar esta nueva industria química: i.-son catalizadores muy activos en medios acuosos y en
muy activos en medios acuosos y en condiciones muy suaves de temperaturcondiciones muy suaves de temperatura, presión,a, presión, pH, etc. 11.-son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en pH, etc. 11.-son catalizadores muy específicos: pueden modificar un único substrato en una mezcla de substratos muy similares e
una mezcla de substratos muy similares e incluso pueden discernir entre dos isómerosincluso pueden discernir entre dos isómeros de una mezcla racémica de
de una mezcla racémica de un compuesto quiral, iii.- son un compuesto quiral, iii.- son catalizadores muy selectivocatalizadores muy selectivos:s: pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que pueden modificar un único enlace o un único grupo funcional en una molécula que tenga varias estructuras modificables. Así pues, las enzimas parecen en principio muy tenga varias estructuras modificables. Así pues, las enzimas parecen en principio muy útiles para un gran
Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzimaDiseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima Inulinasa
(2,1-Inulinasa (2,1-ββ-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.2.1.7]) de un caldo crudo libre
de células
de células Kluyveromyces marxianusKluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 en sus formas soluble e NRRL Y-7571 en sus formas soluble e
inmovilizada. inmovilizada.
2.2.
2.2.
Objetivos Específicos:
Objetivos Específicos:
Preparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucaresPreparar reactivos y obtener curvas de calibrados de proteínas y azucares reductores DNS.
reductores DNS.
Obtener un Obtener un caldo crudo caldo crudo Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571 producido porproducido por fermentación de un medio optimizado, en matraces.
fermentación de un medio optimizado, en matraces.
Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividadesDeterminar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades
volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo. volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.
Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada.inmovilizada.
Inmovilizar inulinasa en geles.Inmovilizar inulinasa en geles.
Diseñar, montar y poner en marcha el sistema mini-reactor con InulinasaDiseñar, montar y poner en marcha el sistema mini-reactor con Inulinasa inmovilizada. Analizar su
inmovilizada. Analizar su comportamientcomportamiento.o.
III.
III.
CONSIDERACIONES
CONSIDERACIONES
Para el diseño
Para el diseño debes considerar:debes considerar:
Usar soluciones concentradas de Usar soluciones concentradas de sacarosa:0.2Msacarosa:0.2M–– 0.6M 0.6M
Utilizar como soporte alginatUtilizar como soporte alginato de sodio al o de sodio al 1.5% - 4.0% (p/v)1.5% - 4.0% (p/v)
Usar un sistema mini-reactor enzimático por lote Usar un sistema mini-reactor enzimático por lote agitado.agitado.
Definición de UI: Una Unidad Internacional de inulinasa es aquella cantidad de enzima Definición de UI: Una Unidad Internacional de inulinasa es aquella cantidad de enzima necesaria que hidroliza un micromol (1
necesaria que hidroliza un micromol (1
) de azucares de sacarosa por minuto a 55 ) de azucares de sacarosa por minuto a 55 °C°C y pHIV.
RESUMEN:
En esta practica de III unidad trataremos y enfocaremos nuestra atención en la Ingeniería de Enzimas, diseñando y realizando los mismos estudiantes diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima inulinasa de un caldo crudo libre de células de Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571, llevaremos a cabo la obtención
de curva de calibrado de proteínas (Bradford) y DNS (azucares reductores), determinaremos el rango de linealidad y actividad enzimática de la enzima en el caldo crudo e inmovilizaremos la inulinasa en geles. A partir de ellos determinaremos los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada, además de diseñar, y poner en marcha el sistema mini-reactor con inulinasa inmovilizada, al cual analizaremos su comportamiento.
Se utilizaran soluciones concentradas de sacarosa: 0,2 M – 0.6 M y como soporte,
alginato de sodio al 1.5%-4.0 % (p/v)
V.
FUNDAMENTO TEORICO:
5.1.
ENZIMAS:
Los enzimas son proteínas que catalizan reacciones químicas en los seres vivos. Los enzimas son catalizadores, es decir, sustancias que, sin consumirse en una reacción, aumentan notablemente su velocidad. No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran las que espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
5.1.1. CARACTERISTICAS DE LAS ENZIMAS:
Desde el punto de vista químico, las enzimas están formadas de carbono (C), Hidrógeno (H), oxigeno (O), Nitrógeno (Ni), y Azufre (S) combinados, pero siempre con peso molecular bastante elevado y común propiedades catalíticas específicas. Su importancia es tal que puede considerarse la vida como un "orden
actividad de enzima.
Las enzimas son catalizadores de naturaleza proteínica que regulan la velocidad a la cual se realizan los procesos fisiológicos, producidos por los organismos vivos. En consecuencia, las deficiencias en la función enzimática causan patologías.
Las enzimas, en los sistemas biológicos constituyen las bases de las complejas y variadas reacciones que caracterizan los fenómenos vitales. La fijación de la energía solar y la síntesis de sustancias alimenticias llevadas a cabo por los vegetales dependen de las enzimas presentes en las plantas. Los animales, a su vez, están dotados de las enzimas que les permiten aprovechar los alimentos con fines energéticos o estructurales; las funciones del metabolismo interno y de la vida de relación, como la locomoción, la excitabilidad, la irritabilidad, la división celular, la reproducción, etc. Están regidas por la actividad de innumerables enzimas responsables de que las reacciones se lleven a cabo en condiciones favorables para el individuo, sin liberaciones bruscas de energía a temperaturas fijas en un medio de pH, concentración salina, etc.; prácticamente constante.
A diferencia de un catalizador inorgánico que interviene en numerosas reacciones las enzimas producidas por los organismos vivos habitualmente solo catalizan un tipo de reacción o solo una reacción determinada; la especificidad de las enzimas es tan marcadas que en general actúan exclusivamente sobre sustancias que tienen una configuración precisa; por ejemplo, si solo atacan a los aminoácidos que tienen su carbono , asimétrico, con estructura L-, no muestran la menor actividad sobre formas idénticas de dichos aminoácidos, pero que sean del tipo D.
Así, la enzima se combina con un sustrato (S) que se transforma en un producto (P). El tiempo que tarda una determinada cantidad de S en transformarse en P es lo que caracteriza a la enzima, y se denomina velocidad o actividad enzimática (v) que se define como cantidad de sustrato transformado o de producto formado en la unidad de tiempo.
Para muchas enzimas, la velocidad de catálisis, v, varía con la concentración de sustrato (S) y además depende de una constante de velocidad K y de su inversa, en la forma que muestra la fig.1 y 2.
Los parámetros cinéticos de una enzima, Vmáx. y KM pueden calcularse utilizando
distintos tipos de representación gráfica. Uno de ellos es el de dobles recíprocos que aparece en la figura 2 y se utiliza posteriormente en esta práctica.
Cálculo gráfico.
Figura 3: Gráfico V vsS
Figura 1: representación de v en función de [S], para una enzima que obedece la cinética de Michaelis-Menten.
Figura2: representación de dobles recíprocos de la cinética enzimática
0 v V S V S V m m En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será:
v = k 3 [E – S]
El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión
equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha desarrollado la siguiente ecuación:
Así tendremos:
5.1.3. EFECTO DEL PH Y DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
- Efecto del pH:
Afecta al estado de disociación de los grupos, aunque todas las proteínas no se ven afectadas de igual forma porque algunas no tienen grupos disociables. La mayor parte de los enzimas tienen un pH óptimo. Si hay pequeños cambios de pH no se desnaturaliza el enzima. El pH puede afectar de dos maneras:
La unión del sustrato es mejor o peor que antes. Que afecte a la velocidad catalítica de la reacción.
La velocidad enzimática se mide en M/t y la actividad enzimática en mol/t, y la unidad internacionalmol/min, cantidad de enzima que transforma un micromol de
sustrato en producto en un minuto en condiciones óptimas. Otra unidad es la cantidad enzimática que se requiere para transformar 1 mol/s y se la llama katal. - Efecto de la temperatura:
Cuando la temperatura sube la velocidad de reacción aumenta. Existe una temperatura máxima a la cual la proteína se desnaturaliza dejando de ser funcional. La mayor parte de las enzimas se desnaturalizan a unos 50º C. La ribonucleasa se desnaturaliza a temperaturas superiores a los 70 º C.
5.2.
INULINASA:
En 1900, se observó por primera vez, que Saccharomyces marxianus, poseía la capacidad de crecer sobre sustratos que contenian inulina como fuente de carbono, hecho que se atnbuyó a la producción de un tipo de enzima, a la cual se le denominó como inulinasa (2-p-D-fiuctan fructohidrolasas EC. 3.2.1.7), ya que es capaz de degradar este tipo de sustrato. Se han aislado enzimas con actividad de D-fructosidasa (inulinasa) de plantas, bacterias, hongos y levaduras. Esta actividad de inulinasa representa un uso potencial para la obtención de fructosa a nivel industrial a partir de desechos agrícolas, por lo que estas enzimas han sido estudiadas ampliamente
La obtención de estas enzimas a partir de plantas presenta el inconveniente de que es muy difícil aislarlas y, además, tienen una marcada actividad de invertasa, por lo que actualmente se utilizan las enzimas de fuentes microbianas. Las enzimas del tipo inulinasa producidas por diferentes microorganismos como los hongos: Aspergillus ficuum y
P-hctosidasa.
Estudios realizados sobre la producción de inulinasa por Kluyveromices marxianus,
demostraron que el extracto de levadura es la mejor fuente de nitrógeno para la producción de esta enzima. Se ha reportado que K. fiagilis produce cantidades
equivalentes de inulinasa en un intervalo amplio de pH (3.5-6.0), que la aireación es un factor determinante para el crecimiento de esta levadura y para la producción de la enzima, y que la temperatura óptima para obtener una mayor actividad se encuentra entre 30 y 40°C.
En diferentes especies de Kluyveromices se ha demostrado que a diferencia de la invertasa, la cual se encuentra principalmente dentro de la célula, la inulinasa es una glicoproteína extracelular, parcialmente asociada a la pared celular y parcialmente excretada al medio de cultivo, aunque también se ha encontrado enzima unida a la célula en cantidades apreciables. La diferencia en la localización de estas enzimas se (atribuye, principalmente, al papel fisiológico que desempeñan en el metabolismo del microorganismo que las produce.
Se han desarrollado y reportado diferentes procedimientos para la purificación y caracterización de la inulinasa producida por diferentes microorganismos. En el caso de la inulinasa producida por K. fragilis, esta fue semipurificada inicialmente por Snyder y
Phaff", los cuales introdujeron el uso de la relación S/I para diferenciar la actividad de inulinasa, (valores menores a 50 de esta relación, indican actividad de inulinasa); y posteriormente fue purificada por Grootwasink y colaboradores (tabla II), así como por otros investigadores.
Workman y Day purificaron la inulinasa producida por Kluyveromices fiagilis,
encontrando que dicha enzima es una glicoproteina con un contenido de carbohidratos del 66% en peso, estable a 50 °C, con un pH óptimo de 4.5, cuya actividad disminuye a
el peso molecular de la enzima purificada, la posible conformación de ésta, y tampoco reportan datos acerca de la determinación de la Km sobre inulina.
5.2.1. HIDROLISIS ENZIMATICA DE LA INULINA: INULINASAS
La inulinasa o β-1,2-fructan-fructanohidrolasa es la enzima encargada de
hidrolizar los enlaces β-1,2 fructano de la inulina. La hidrólisis completa de la inulina
lleva a la formación de fructosa y glucosa, cuya concentración es proporcional al grado de polimerización (DP) inicial de la inulina.
La inulinasa puede obtenerse de dos orígenes diferentes: origen vegetal (Diente de león, achicoria, alcachofa de Jerusalén, etc.) y origen microbiano.
5.2.2. MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE INULINASAS
La inulinasa puede ejercer dos efectos sobre las moléculas de inulina, por lo que se puede clasificar dos tipos de inulinasas: endo-inulinasas y inulinasas. La
exo-depende de la fuente microbiana de la cual se obtuvo la inulinasa. De las diferencias en las propiedades moleculares entre los dos tipos de enzima destaca el peso molecular.
5.2.3. PROPIEDADES CINETICAS
Estudios realizados sobre la bioquímica de las inulinasas producidas por diferentes microorganismos demostraron que éstas tienen la misma especlficidad por el tipo de sustrato, pero muestran diferencias en la estabilidad, pH y temperatura óptimos para la actividad enzimática.
5.2.4. APLICACIONES:
5.3.
INMOVILIZACION DE ENZIMAS:
La inmovilización de enzimas es una técnica que se viene estudiando desde hace mucho tiempo. Si nos remontamos al año 1916, encontramos que, dos científicos, Nelson y Griffin utilizaron preparaciones de invertasa inmovilizada por adsorción a carbón activo. Pero la historia más reciente de la utilización de estas técnicas se remonta allá por los años 50, cuando Grubhofer y Schleith inmovilizaron pepsina, carboxipeptidasa, ribonucleasa y diastasa en poliaminoestireno diazotizado. En 1956, Mitz empleó la unión iónica de catalasa a DEAE-Celulosa y más tarde, en 1963, se intentan inmovilizar los primeros compuestos por atrapamiento, por Bernfeld y Wan que realizaron preparaciones de tripsina, papaína, amilasa y ribonucleasa inmovilizadas en geles de poliacrilamida. En 1971, Gregoriadis inmovilizó amiloglucosidasa sobre liposomas (Battaner 1998.). Varios científicos, han estudiado muy a fondo todo tipo de interacciones que se establecen entre la enzima y el soporte, el tipo de grupos que se encuentran involucrados y las características más importantes de las mismas (Guisan y col. 1993).
Las enzimas son biocatalizadores con excelentes propiedades para su utilización como catalizadores industriales, pero presentan algunos problemas. Uno de estos problemas es que son moléculas solubles, con lo que, su separación de los medios de reacción y su posterior reutilización puede ser complicada.
Por ello se hace conveniente la inmovilización de la enzima previa a su utilización. La inmovilización de las enzimas simplifica la recuperación y reutilización del soporte, evitando la contaminación de los productos por la enzima (muy importante sobre todo en tecnología de alimentos), permite simplificar el diseño y control de los reactores, etc.
5.3.1. REACTORES CON ENZIMAS INMOVILIZADAS:
Por ser este tipo de reactores únicos en cuanto a sus características y en virtud de que la ingeniería de enzimas inmovilizadas aún se encuentra en sus inicios, es muy difícil establecer generalizaciones, pues en el mejor de los casos la experiencia es limitada. En cierta forma los problemas son parecidos a los de la catálisis heterogénea clásica, pero como existen pocos casos prácticos, se toman éstos a manera de ejemplos ilustrativos. El tipo de reactor, su comportamiento cinético y la transferencia de masa
la reacción y el modo de operación del reactor. Ya han sido considerados dos tipos de reactor; solo resta por analizar el batch. Los otros reactores, no ideales, generalmente
se comportan en regiones delimitadas por los casos ideales.
Para un reactor batch, considerando una cinética de tipo Michaelis-Menten, se puede
obtener la ecuación integrada entre el tiempo cero al tiempo t:
=
− ln(1−)
Donde t= tiempo para alcanzar la conversión X
Se pueden obtener ecuaciones similares para una cinética de tipo Michaelis-Menten reversible, para casos de inhibición competitiva por producto e inhibición por sustrato.
5.4.
MÉTODO DE LOS INVERSOS O LINEWEAVER – BURKE
Emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke, para un modelo cinético simple.
Cuyo recíproco es:
Donde V es la velocidad de reacción, Km es la constante de Michaelis-Menten, Vmax es la velocidad máxima, y [S] es la concentración de sustrato.
La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el Km y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas el valor de -1/Km. Fuente: Lineweaver, H; and Burk, D. (1934). «The Determination of Enzyme
Dissociation Constants». Journal of the American Chemical Society 56: 658 —666.
5.4.1. INCONVENIENTES DEL MÉTODO
Como requiere de dobles inversos, pequeños errores experimentales pueden conducir
a grandes errores.
a) Materiales
Tubo de ensayo
Matraz
Celdas para espectrofotómetro
Micropipeta b) Instrumentos y Equipos Balanza analítica Espectrofotómetro c) Reactivos Agua destilada Azul de Coomassie G-250 Etanol al 98% Ácido fosfórico al 85% Reactivo de Bradford
6.2.
Determinación de azucares reductores mediante el método del
DNS
a)
Materiales Pipetas Tubos de ensayo Celdas Hielob)
Instrumentos e Equipos6.3.
Metodología de la obtención del caldo crudo de
Kluyveromyces MarxianusNRRL Y-7571
a) Materiales
Vaso precipitado
Probeta
Tubo para centrifuga
b) Instrumentos e Equipos Centrifuga Refrigeradora pH metro c) Reactivos Levadura desecada Fosfato de sodio
6.4.
Determinación del rango de linealidad y actividad de la enzima
a)
Materiales Tubos de ensayo Vaso precipitado Micropipetab)
Instrumentos e Equipos Cubos de hielo Equipo de baño maría
Agitador automatico
pH metro
c)
Reactivos Matraces
Tubos de ensayo
Vaso precipitado
Jeringa
b)
Instrumentos e Equipos Equipo de baño maría
c)
Reactivos Alginato de sodio
Invertasa
Solución de CaCl20.1M y 0.05M
6.6.
Diseño y montaje del sistema mini reactor con invertasa
inmovilizada, para determinar los parámetros cinéticos de la
enzima.
a)
Materiales Matraces Tubos de ensayo Pipeta Micropipeta Viales Pinzasb)
Instrumentos e Equipos Shaker Olla Mechero bunsen EspectrofotómetroVII.
PROCEDIMIENTO:
7.1.
Determinación de proteínas: Método de Bradford
Bradford, M. 1976, un método rápido y sensible para la cuantificación de las
cantidades de microgramos de proteína utilizando el principio de unión a
proteínas del tinte.
Por una hora
DISOLVER ETIQUETAR AÑADIR AFORAR AGITAR FILTRAR GUARDAR REPOSAR 0.1 azul de coomassil G-250 100 ml de H3PO4al 85%
A 1 litro con agua destilada
Con al odón
7.2.
Determinación de azucares reductores mediante el método de
DNS
Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en aproximadamente 20 ml de agua, paralelamente se disuelve el DNS en pequeñas cantidades con ayuda de un agitador magnético y calentando. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de 50 mL y se agita hasta la completa disolución de todos los componentes, para posteriormente aforar hasta 50 mL. LEER Agua helada Absorbancia AÑADIR CALENTAR ENFRIAR AÑADIR AGITAR 1 ml de DNS Por 5 minutos 10 ml de agua destilada
La concentración se obtiene interceptando la medida de
absorbancia en la curva de calibrado.
7.3.
Metodología de la obtención del caldo crudo de
Kluyveromyces MarxianusNRRL Y-7571
Tomamos con una jeringa 50 ml del caldo de kluveromyces marxianus que se encontraba en el biorreactorCentrifugamos el caldo para poder eliminar las celulas de kluveromyces marxianus y quedarnos solamente con el sobrenadante, es decir un caldo crudo de inulinasa libre de celulas
kluveromyces marxianus NRRL-7571
Obtenemos el caldo crudo de inulinasa
Mantenemos el caldo bajo refrigeracion
Guardamos 3 ml del caldo en viales para los demas grupos
El caldo crudo contiene sustancias químicas, subproductos o residuos que pueden inhibir la actividad catalítica de la enzima inulinasa, por ello hay que concentrar para que la actividad enzimática aumente, es decir aumentar el poder catalítico de la enzima.
7.4.
Determinación del rango de linealidad y actividad enzimática
(actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.
La experiencia se realizará a diferentes diluciones del extracto bruto enzimático,
1:1, 1:2, 1:3………, se graficará la concentración de Sustrato o Producto contra
Tiempo de reacción y se expresará correctamente los valores de las actividades
volumétrica (UI/ml) y específica (UI/mg).
PREPARAR DETERMINAR AGREGAR COLOCAR AGREGAR CALENTAR LLEVARLOS 5 Tubos de ensayo 2,9 ml de solución sacarosa
A baño maría (40ªC – 3 min)
Por 3 min a 100ªC 0.1 ml caldo crudo
Refrigeración
7.5.
Método de inmovilización de invertasa en alginato de sodio
El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que
la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la
inhibición, amplia el intervalo de pH óptimo y reduce las posibles
contaminaciones microbianas.
EMPACAR CALENTAR MEZCLAR GOTEAR REPOSAR LAVARLOS TOMAR La mezcla en 30 ml de solución CaCl2 15 min a 80ªC 1 ml de invertasa y cargar en una jeringaEn refri eración or 30 min
Con solución CaCl2 al 0.5 M
PREPARAR
Solución de alginato de sodio 2%
PONER
REALIZAR
Dentro de un mini reactor
A hervir por 3 min y enfriar 1020 ml por cada 4 horas
En la práctica de inmovilización de
inulinasa, se utilizó un mini-reactor.
Este está comprendido por un
recipiente rígido de vidrio, el cual
desempeña la función de un reactor por
lotes. Este está empacado por otro
recipiente más grande el cual cumple la
función de chaqueta térmica, que va
permitir mantener la temperatura ideal
de reacción enzimática
En la figura también se puede notar unas mangueras, las cuales permiten el
transporte del oxígeno, ya que la baja solubilidad del oxígeno en el medio acuoso
significa que éste debe suministrarse de manera continua mientras se elimina el
dióxido de carbono y otros gases producidos en el proceso. El agitador magnético
cumple la función de homogenizar, ya que si el reactor está bien mezclado, el
roducto osee la misma com osición ue el lí uido resente en el reactor.
Ingreso de
oxigeno
Salida de CO2
otros ases
Agitador
magnético
Baño María a
45°C
INMOVILIZACION DE ENZIMAS
METODO (ATRAPAMIENTO EN GEL)FUNDAMENTO TEORICO:
El método de inmovilización es por unión química. Se debe procurar que la inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición, amplia el intervalo de pH óptimo y reduce las posibles contaminaciones microbianas.
MATERIALES: Alginato de sódio al 2% Solución de CaCl2 0,1M y 0,5M. Jeringa Matraces Mechero Mini-reactor
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
PRIMERA ETAPA:
Una disolución de 25ml de Alginato de Sodio al 5%
PREPARAR
CALENTAR En baño María a 80ºC por algunos minutos
AGITAR Con la varilla, hasta que se diluya toda la solucion
COLOCAR En la estufa durante 15 minutos
ENFRIAR A baño María a 45ºC por 5 minutos
DIVIDIR Lo obtenido en 3 vasos pequeños para cada grupo(A, B y C)
25ml agua destilada 0.5g alginato
OBTENER
Del vasito correspondiente para nuestro grupo. 5ml de solución
AGREGAR
5ml de solución 1ml caldo crudo
Vaso precipitado
COLOCAR A 45ºC en baño María
AGITAR Con la varilla hasta obtener una solución
TERCERA ETAPA:
En el agitador magnético un vaso a baño con hielo
COLOCAR
COLOCAR A una bureta completando con 15ml de agua destilada
AGREGAR Al vaso a baño con hielo en el agitador magnetico
35ml CaCl2 (0.1M)
5ml con la jeringa de lo obtenido en la primera etapa
EXTRAER
AGREGAR Al vaso de la segunda etapa que se encuentra en el agitador GOTA A GOTA
DEJAR Reposar en refrigeración por 2 horas
LAVAR Con CaCl2 los beats
ELIMINAR El sobrenadante
CUARTA ETAPA (En el mini-reactor):
Al mini-reactor que se encuentra a 55ºC
AGREGAR
TOMAR Muestras cada 30 minutos durante 4 horas
HERVIR Cada muestra por 3 minutos
45ml Sacarosa Beats, 20ml tam on
ENFRIAR
En agua helada
GUARDAR Cada muestra en cada vial
LEER Absorbancias tras haber realizado DNS con las
1
•Prepara una disolución de alginato de sodioal 2% y calentar a 80ºC por 15 minutos y luego enfriar a 45ºC.
2
•mezclar con 1 mL del preparadoDe la disolución anterior tomar 5 mL, invertasa y cargar toda una jeringa provista de aguja.3
•Con la jeringa gotear la mezcla
MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE
INVERTASA EN ALGINATO DE SODIO
4
•Empacar los “beads” dentro delmini-reactor a 40°C, que tiene 20ml de tampon y 25ml std.
5
• Luego tomar 1000ul de muestracada 30min por 4 horas.
6
• Cada muestra se pone a hervir por 3min, luego se enfría en agua helada y guardar en cada vial.
Finalmente realizar DNS a las 8 muestras obtenidas
Cuando se efectúa una reacción enzimática, se observa, un aumento en la concentración del producto y una disminución en la concentración del sustrato hasta que la reacción termina o alcanza su punto de equilibrio.
Se trabajó a diferentes concentraciones de enzima. Donde obtuvimos absorbancias de las muestras, a diferentes concentraciones de enzima para diferentes tiempos donde a cada uno se le restó el error de los blancos de enzima y sustrato, y obtuvimos nuevos datos los cuales son mostrados a continuación:
TABLA A.1-GRUPO A: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL
RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
A-3
A-2
A-1
Tiempo (h) Tiempo (Min) Tubo Lectura (540 nm) Lectura (540 nm) Lectura (540 nm) 0 0 1 0.787 0.383 0.575 0.08 5 2 0.395 0.696 0.635 0.17 10 3 0.79 1.234 0.977 0.25 15 4 0.506 0.794 1.135 0.33 20 5 0.495 0.976 1.203 Blanco sustrato 0.037 0.002 0.043 Blanco enzima 0.003 0.036 0.055
TABLA A.1-GRUPO B: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL
RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
B-3 B-2 B-1 Tiempo (h) Tiempo (Min) Tubo Lectura (540 nm) Lectura (540 nm) Lectura (540 nm) 0 0 1 0.151 0.079 0.065 0.08 5 2 0.314 0.562 0.655 0.17 10 3 0.675 0.9 0.416 0.25 15 4 0.462 0.693 0.739 0.33 20 5 0.479 0.785 0.864
UNIDAD III
36
TABLA A.1-GRUPO C: DATOS DE ABSORVACIA PARA LA DETERMINACIÓN DEL
RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
C-3 B-2 Tiempo (h) Tiempo (Min) Tubo Lectura (540 nm) Lectura (540 nm) 0 0 1 0.155 0.221 0.08 5 2 0.389 0.398 0.17 10 3 0.599 0.749 0.25 15 4 0.411 0.375 0.33 20 5 0.45 0.618 Blanco sustrato 0.011 0.042 Blanco enzima 0.075 -0.008
DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD DE LA ENZIMA
Para determinar la actividad de la enzima, tenemos que obtener la cantidad de producto (azucares reductores) que estas degradando a partir del sustrato Sacarosa. Así tenemos que:
= ∆
∆ (
∗)
Tenemos que: CURVA DE CALIBRADO DE AZUCARES REDUCTORES
ABS= A(AZUCARES REDUCTORES) + B
Donde:
A: PENDIENTE=0.6012 B: INTERCEPTO=0.0037 Así tendremos:
= . – 0.0037
0.6012
ABS=0.6012 Azucares reductores +0.0037UNIDAD III 37
A-3 1:4 A-2 1:2 A-1 1:1
TIEMPO (Min) Tubo ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) 0 1 0.787 1.315 1.315 1.236 0.383 0.643 0.643 0.568 0.575 0.963 0.963 0.787 5 2 0.395 0.663 2.653 2.574 0.696 1.164 5.819 5.744 0.635 1.062 10.624 10.448 10 3 0.79 1.320 5.281 5.202 1.234 2.059 10.294 10.218 0.977 1.631 16.312 16.137 15 4 0.506 0.848 6.782 6.704 0.794 1.327 13.268 13.193 1.135 1.894 18.940 18.765 20 5 0.495 0.830 6.636 6.557 0.976 1.630 16.296 16.220 1.203 2.007 20.072 19.896 Blanco sustrato 0.037 0.068 0.068 0.002 0.009 0.009 0.043 0.078 0.078 Blanco enzima 0.003 0.011 0.011 0.036 0.066 0.066 0.055 0.098 0.098
UNIDAD III 38
TABLA A.1-GRUPO B: OBTENCIÓN DEL PRODUCTO EN LA DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD.
SACAROSA 20 G/L) B-3 1:4 B-2 1:2 B-1 1:1 TIEMPO (Min) Tubo ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) ABS (540 nm) P (g/L) P' (g/L) P'' (g/L) 0 1 0.151 0.257 0.257 0.097 0.079 0.138 0.138 0.047 0.065 0.114 0.114 0.034 5 2 0.314 0.528 2.114 1.953 0.562 0.941 9.410 9.319 0.655 1.096 5.478 5.398 10 3 0.675 1.129 4.516 4.355 0.900 1.503 15.032 14.941 0.416 0.698 6.981 6.901 15 4 0.462 0.775 6.197 6.037 0.693 1.159 17.383 17.292 0.739 1.235 12.354 12.273 20 5 0.479 0.803 6.423 6.263 0.785 1.312 19.678 19.588 0.864 1.443 14.433 14.352 Blanco sustrato 0.0710 0.1243 0.1243 0.053 0.094 0.094 0.039 0.071 0.071 Blanco enzima 0.0180 0.0361 0.0361 -0.006 -0.004 -0.004 0.002 0.009 0.009
UNIDAD
UNIDAD III III 3939
C-3 C-3 1:5 1:5 C-2 C-2 1:31:3 TIEMPO TIEMPO (Min) (Min) Tubo
Tubo ABS ABS (540 (540 nm) nm) P P (g/L) (g/L) P' P' (g/L) (g/L) P'' P'' (g/L) (g/L) ABS ABS (540 (540 nm) nm) P P (g/L) (g/L) P' P' (g/L) (g/L) P'' P'' (g/L)(g/L)
0 0 11 0.155 0.155 0.264 0.264 0.264 0.264 0.109 0.109 0.221 0.221 0.374 0.374 0.374 0.374 0.2180.218 5 5 22 0.389 0.389 0.653 0.653 2.613 2.613 2.457 2.457 0.398 0.398 0.668 0.668 3.341 3.341 3.1853.185 10 10 33 0.599 0.599 1.002 1.002 4.010 4.010 3.855 3.855 0.749 0.749 1.252 1.252 6.260 6.260 6.1056.105 15 15 44 0.411 0.411 0.690 0.690 5.518 5.518 5.363 5.363 0.375 0.375 0.630 0.630 6.299 6.299 6.1446.144 20 20 55 0.450 0.450 0.755 0.755 6.037 6.037 5.882 5.882 0.618 0.618 1.034 1.034 10.341 10.341 10.18610.186 Blanco sustrato Blanco sustrato 0.011 0.011 0.024 0.024 0.024 0.024 0.042 0.042 0.076 0.076 0.0760.076 Blanco enzima Blanco enzima 0.075 0.075 0.131 0.131 0.131 0.131 -0.008 -0.008 -0.007 -0.007 -0.007-0.007
UNIDAD
UNIDAD
III
III
40
40
FIGURA A.2 - GRUPO A: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y FIGURA A.2 - GRUPO A: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y ATRAVES DE ESOATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICADETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
FIGURA A.2
FIGURA A.2–– GRUPO B: GRUPO B: PERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO YPERFIL PARA DETERMINAR EL VALOR DEL PRODUCTO Y
ATRAVES DE ESO
ATRAVES DE ESO DETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICADETERMINAR RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA ENZIMA EN EL
DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)CALDO CRUDO (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
0.000 0.000 5.000 5.000 10.000 10.000 15.000 15.000 20.000 20.000 25.000 25.000 0 0 55 1100 1155 2200 2255 P P ( ( g g / / L L ) ) Tiempo (min) Tiempo (min) ((11::44)) ""((11::22))"" ""((11::11))"" 00 22 44 66 88 10 10 12 12 14 14 16 16 18 18 20 20 00 55 1100 1155 2200 2255 P P ( ( g g / / L L ) ) Tiempo (min) Tiempo (min) B B--3 3 11::44 BB--2 2 11::11 BB--1 1 11::22 CC--2 2 11::33
La Gráfica nos indica el rango de linealidad de la enzima; la curva obtenida se basa en la La Gráfica nos indica el rango de linealidad de la enzima; la curva obtenida se basa en la reacción enzimá
reacción enzimática y su dependencia tica y su dependencia con el con el tiempo. La forma de la tiempo. La forma de la curva curva representa larepresenta la velocidad de formación de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de velocidad de formación de productos en el tiempo a diferentes concentraciones de enzima, los cuales demuestran que a una mayor concentración de enzimas el rango de enzima, los cuales demuestran que a una mayor concentración de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima disminuye, enton
disminuye, entonces diríamos si se trabajara con ces diríamos si se trabajara con diluciones menores, diluciones menores, como lo realizó elcomo lo realizó el grupo
grupo A-3 (1:4), A-3 (1:4), A-2 (1:2) A-2 (1:2)yy A-1 (1:1) A-1 (1:1)demostraríamodemostraríamos que s que a una mayor a una mayor concentraciónconcentración de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su de enzimas el rango de linealidad de reacción es mayor y por lo tanto mantiene su capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad capacidad catalítica durante más tiempo y mientras éste se vaya diluyendo la capacidad catalítica de la enzima disminuye.
catalítica de la enzima disminuye. Inicialmente
Inicialmente, las , las reacciones transcurren linealmentreacciones transcurren linealmente, pudiéndose e, pudiéndose tomar la tomar la pendiente dependiente de esta recta como veloc
esta recta como velocidad inicial .A(1:1) y B(1:1) tidad inicial .A(1:1) y B(1:1) tiempos iempos mas largos, el progreso de lamas largos, el progreso de la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reaccion se debe a la reacción se aparta de la linealidad. Esta caída de la velocidad de reaccion se debe a la
0.000 0.000 1.000 1.000 2.000 2.000 3.000 3.000 4.000 4.000 5.000 5.000 6.000 6.000 7.000 7.000 00 55 1100 1155 2200 P P ( ( g g / / L L ) ) Tiempo (min) Tiempo (min) C-3 1:5 C-3 1:5
UNIDAD III
42
inactivación de enzima, etc. La máxima fiabilidad en la determinación de la actividad de un enzima la suministra el valor de velocidad inicial o velocidad durante el tramo inicial de progreso lineal de la reacción.
La actividad catalítica de la enzima depende tanto de su capacidad de adsorción sobre el sustrato, como de la formación del complejo activo enzima-sustrato. Este último aspecto estará controlado por aquellos factores que afectan a la accesibilidad del sustrato (configuración física, morfología, cristalinidad y estructura química), a las características de la proteína enzimática a las concentraciones relativas de sustrato y enzima, así como de los parámetros físicos de reacción como temperatura y transferencia de masa.
La literatura para explicar la hidrólisis de la sacarosa, mediante la Inulinasa nos dice:
El proceso de extracción de la inulinasa, además de determinar el rendimiento y si la enzima es extracelular o intracelular, determina otras características como su peso molecular (MW), su modo de acción sobre la molécula de inulina, su actividad hidrolítica sobre la sacarosa, respuesta a los cambios de pH y temperatura, propiedades cinéticas y efecto de la concentración de sustrato (Chi et al., 2009).
Se ha determinado que las inulinasas pueden ejercer dos modos de acción diferentes sobre la molécula de inulina, una acción extrema y una acción interna, correspondiendo dos clases de inulinasas llamadas exo-inulinasas y endo-inulinasas respectivamente. Las exo-inulinasas (74 KDa, pH 5.1 – 7.0) empiezan con la separación de la primera
molécula de D-fructosa y va hasta el último enlace para liberar glucosa de la unidad de sacarosa y la endo-inulinasa (64 KDa) actúa sobre enlaces internos y rinde un conjunto de inulo-oligosacáridos (inulotriosa, inulotetrosa y inulopentosa) pero sin actividad invertasa. Estas propiedades dependen del origen microbiano de la enzima. De este punto de vista la mejor cepa sería la que tenga ambas propiedades, como el caso del A. ficuum (Pandey et al., 1999), dado que una mezcla de endo y exo inulinasa puede resultar en una mejor conversión de inulina a fructosa que solo utilizar enzimas puras aisladas, dado que las endo-inulinasas romperían las moléculas de inulina en muchos oligosacáridos, aumentando así los puntos de ataque para las exo-inulinasas, con el consecuente incremento de la velocidad de reacción de inulina a fructosa.
levaduras que en aquellas obtenidas a partir de mohos (Ricca et al., 2007). Notoriamente una actividad invertasa de inulinasa es deseable. Laloux et al. (1991) sostienen que las inulinasas poseen sitios catalíticos comunes, pero diferentes sitios de enlace para la hidrólisis de inulina y sacarosa.
La actividad y estabilidad depende de la respuesta de la enzima a los cambios de temperatura y pH. Los valores de temperatura y pH dependen del tipo de microorganismo usado como fuente, generalmente se da valores más altos para bacterias y levaduras que mohos. Así se tienen los rango de valores de pH, para mohos 4.5– 7.0, para levaduras 4.4- 6.5 y para las bacterias 4.8 – 7.0 (Ricca et al., 2007). Singh
et al. (2007b), determinaron que la exo-inulinasa de Kluyveromyces marxianus YS-1 exhibió considerable actividad a un valor de pH óptimo de 5.5 en que mantuvo estable su actividad catalítica al 100% durante 3 h a la temperatura óptima de 50 ºC. Se observa que todavía existe la necesidad de investigar la actividad y estabilidad de la inulinasa contra la temperatura, así como los modelamientos y simulación de procesos o cinética de desactivación de la enzima.
Efecto de la temperatura:
La temperatura es un factor que puede influir considerablemente en la velocidad de la reacción. Los pequeños cambios tienen una influencia considerable. La temperatura óptima para la mayoría de las reacciones está entre los 30 a 40º C.
Cuando la temperatura llega a cierto valor variable, según la enzima de que se trate, esta empieza a desnaturalizarse y la velocidad de las reacciones comienza a disminuir. La temperatura óptima es la resultante de dos procesos: el incremento de la velocidad de reacción con la temperatura y el incremento de la desnaturalización térmica de la enzima por encima de la temperatura crítica. La mayor parte de las enzimas se inactivan a temperaturas superiores a 55– 60º C. es por ello que en la presenta práctica se trabajó
UNIDAD III
44
Efecto del pH:
La mayor parte de las enzimas tienen un pH característico en el cual su actividad es máxima. Ese pH se llama pH óptimo. Por encima y por debajo de este pH la actividad declina.
La curva de actividad de la Enzimas con el pH tiene generalmente una forma acampanada.
Cuando los valores de pH son muy ácidos o muy alcalinos, no solo se modifica el sitio activo, sino que se altera la estructura terciaria de toda molécula, pudiendo llegar a la desnaturalización y no habrá actividad enzimática. Mientras que en la práctica utilizamos una solucióntampón citrato-fosfato 0.05Ma un pH de 5.
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA (ACTIVIDADES
VOLUMÉTRICA Y ESPECÍFICA) DE LA ENZIMA EN EL CALDO CRUDO.
Cinética enzimática:
Se entiende por cinética enzimática, el análisis cuantitativo del efecto de cada uno de los factores que intervienen en la expresión de la actividad enzimática, evaluada a través de la velocidad de la reacción catalizada.
Las variables más importantes en cinética enzimática son el tiempo de hidrólisis, la concentración de enzima, de sustrato y la temperatura Ahora, calculamos la actividad enzimática, a partir de:
= ∗ () ∗
∗ ∗
∗
∗
UNIDAD III 45
TABLA A.4-GRUPO A: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA
(SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
y = 0.3806x + 1.0745 R² = 0.9838 y = 0.965x + 0.6846 R² = 0.9982 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 P ( g / L ) Tiempo (min)
A-3 1:4 A-2 1:2 A-1 1:1
DILUCION PENDIENTE RL (g/l.hr.) PENDIENTE e (g/l) t (min) linealidad A-1 E 1:1 1.5350 0.2169 10 A-2 E 1:2 0.9650 0.2169 10 A-3 E 1:4 0.3806 0.2169 15
TABLA A.5-GRUPO B: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA
GRÁFICA (SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
DILUCION PENDIENTE RL (g/l.hr.) PENDIENTE e (g/l) t (min) linealidad B-2 E 1:1 1.4894 0.3797 10 B-1 E 1:2 0.7102 0.3797 20 C-2 E 1:3 0.5886 0.3797 10 B-3 E 1:4 0.4044 0.3797 15 y = 0.4044x + 0.0775 R² = 0.9957 y = 0.5886x + 0.3129 R² = 1 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 P ( g / L ) Tiempo (min) B-3 1:4 B-2 1:1 B-1 1:2 C-2 1:3
TABLA A.6-GRUPO C: RESULTADOS DE LA DETERMINACIÓN DE LA
ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ATRAVES DE LA PENDIENTE DE LA GRÁFICA
(SOLUCION SATD. SACAROSA 20 G/L)
DILUCION PENDIENTE RL(g/l.hr.) PENDIENTE e (g/l) t (min)
linealidad
C-3
E 1:5
0.3432
0.0545
15
La actividad volumétrica se determina para los rangos de linealidad, indicando la cantidad de enzima que es capaz de transformar 1 micromol de sustrato en un minuto.
La actividad específica se determina para los rangos de linealidad, indicando que para cada miligramo de proteína hay una cantidad de enzimas que transforman 1 micromol de sustrato en un minuto
Ahora, si queremos determinar la actividad específica, tendremos que determinar la concentración de enzima en mg/ml, a partir de:
y = 0.3432x + 0.3719 R² = 0.9844 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 P ( g / L ) Tiempo (min)
Donde:
A: PENDIENTE=8.0803
B: INTERCEPTO=0.1062
Así tendremos:
(/) = + 0.0068
0.4187
Tiempo (hr) mg Proteina/L caldo CONCENT PROTEINA
(g/L) ABS(595nm) 0 154.765 0.155 0.058 2 133.270 0.133 0.049 4 116.551 0.117 0.042 6 83.114 0.083 0.028 8 319.561 0.320 0.127 10 142.823 0.143 0.053 12 321.949 0.322 0.128 24 209.697 0.210 0.081 26 114.163 0.114 0.041 28 221.638 0.222 0.086 30 216.862 0.217(PROMEDIO) 0.084
Entonces, tendremos que:
DILUCION
PENDIENTE
RL (g/l.min.)
PENDIENTE
E (g/l)
ACVTIVIDAD
(UI/ml)
A.E
(UI/mg)
y = 0.4187x - 0.0068
CURVA DE CALIBRADO DE PROTEINAS (GRUPO B)
ABS= A(PROTEINA) + B
Donde:
A: PENDIENTE= 0.4187
B: INTERCEPTO= -0.0068
Así tendremos:
=
+ 0.0068
0.4187
DilucionTiempo
(hr)
mg Proteina/L caldo
CONCENT
PROTEINA (g/L)
ABS(595nm)
1:1
0
147.600
0.148
0.055
1:3
2
306.663
0.307
0.036
1:5
4
379.747
0.380(PROMEDIO)
0.025
Entonces, tendremos que:
DILUCION
PENDIENTE
RL (g/l.min.)
PENDIENTE
E (g/l)
ACVTIVIDAD
(UI/ml)
A.E
(UI/mg)
B-2
E 1:1
1.4894
0.3797
24.8234
24.8234
B-1
E 1:2
0.7102
0.3797
11.8375
23.6750
C-2
E 1:3
0.5886
0.3797
9.8104
29.4311
B-3
E 1:4
0.4044
0.3797
6.7402
26.9610
y = 0.4187x - 0.0068
Donde:
A: PENDIENTE= 0.4187
B: INTERCEPTO= -0.0068
Así tendremos:
= −
− 0.0068
0.4187
DilucionTiempo
(hr)
mg Proteina/L caldo
CONCENT
PROTEINA (g/L)
ABS(595nm)
"1:1"
0
95.056
0.095
0.033
"1:2"
2
95.056
0.095
0.033
"1:3"
4
133.270
0.133
0.049
"1:4"
6
54.454
0.054(PROMEDIO)
0.016
Entonces, tendremos que:
DILUCION
PENDIENTE
RL (g/l.min.)
PENDIENTE
E (g/l)
ACVTIVIDAD
(UI/ml)
A.E
(UI/mg)
C-3
E 1:5
0.3432
0.0545
5.720
28.600
y = 0.4187x - 0.0068
[ ] de Enzima
av (UI/ml)
ae (UI/mg)
A-1
E 1:1
25,583
25,583
B-2
E 1:1
24,8234
24,8234
A-2
E 1:2
16,084
32,168
B-1
E 1:2
11,8375
23,6750
C-2
E 1:3
9,8104
29,4311
B-3
E 1:4
6,7402
26,9610
A-3
E 1:4
6,343
25,373
C-3
E 1:5
5,720
28,600
La Gráfica anterior nos indica que la actividad catalítica de la enzima no sólo se ve
afectada por el tiempo, sino también va disminuyendo conforme la concentración
de la misma disminuya en el medio, ya que mientras más diluida se encuentre
menor será el poder catalítico. Por otro lado, si la concentración de la enzima
aumenta la actividad aumenta.
Es decir la actividad se hace mayor cuando el extracto enzimático no está diluido,
pero cuando se hace diluciones, la actividad disminuye. Esto se hace
principalmente con el fin de poder obtener mayor linealidad a cualquier
concentración de enzima, empleando menores tiempos.
0.000 5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 E 1:1 E 1:1 E 1:2 E 1:2 E 1:3 E 1:4 E 1:4 E 1:5 A c t i v i d a d ( U I / m g ) CONCENTRACION DE ENZIMA
Nº
sol. Std
(µl)
TAMPON
(µl)
CONCENT
PROTEINA (g/L)
Absorbancia
leída 595 nm
Absorbancia
corregida
1
100
0
0.5
0.796
0.219
2
80
20
0.4
0.729
0.152
3
60
40
0.3
0.683
0.106
4
50
50
0.25
0.667
0.090
5
40
60
0.2
0.657
0.080
6
20
80
0.1
0.617
0.040
7
10
90
0.05
0.589
0.012
8
0
100
0
0.577
0.000
La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentración
conocida de una solución estándar de albumina suero de bovino y
analizadas según este procedimiento
y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825 -0.050 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A b s o r b a n c i a [] g/L CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)
PARA DETERMINAR:
Nº
Tiempo
(hr)
mg
Proteína
/L caldo
CONCENT
PROTEINA
(g/L)
ABS(595nm)
1
0
154.765
0.155
0.058
2
2
133.270
0.133
0.049
3
4
116.551
0.117
0.042
4
6
83.114
0.083
0.028
5
8
319.561
0.320
0.127
6
10
142.823
0.143
0.053
7
12
321.949
0.322
0.128
8
24
209.697
0.210
0.081
9
26
114.163
0.114
0.041
10
28
221.638
0.222
0.086
11
30
216.862
0.217
0.084
Conc. Proteína a 30h 0.216861715)
(
)
(
enzima
ml
enzima
mg
e
ሾ ሿ/= +.
.
y = 0.4187x - 0.0068 R² = 1 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 A B S [ ] P1 100 0 0.5 0.796 0.219 2 80 20 0.4 0.729 0.152 3 60 40 0.3 0.683 0.106 4 50 50 0.25 0.667 0.090 5 40 60 0.2 0.657 0.080 6 20 80 0.1 0.617 0.040 7 10 90 0.05 0.589 0.012 8 0 100 0 0.577 0.000
PARA DETERMINAR:
y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825 -0.050 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A b s o r b a n c i a [] g/L CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)Conc. Proteina a 30h
0.379746835
Nº
Tiempo
(hr)
mg Proteina/L caldo
CONCENT
PROTEINA (g/L)
ABS(595nm)
1
0
147.600
0.148
0.055
2
2
306.663
0.307
0.036
3
4
379.747
0.380
0.025
a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia
b) Mg de proteínas vs. Absorbancia
y = -0.0001x + 0.0742 R² = 0.9967 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.000 50.000 100.000 150.000 200.000 250.000 300.000 350.000 400.000 A B S P (Mg proteina/Lcaldo) y = -0.1276x + 0.0742 R² = 0.9967 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 A B S [ ] PNº sol. Std (µl) TAMPON (µl) CONCENT PROTEINA (g/L) Absorbancia leida Absorbancia corregida 1 100 0 0.5 0.796 0.219 2 80 20 0.4 0.729 0.152 3 60 40 0.3 0.683 0.106 4 50 50 0.25 0.667 0.090 5 40 60 0.2 0.657 0.080 6 20 80 0.1 0.617 0.040 7 10 90 0.05 0.589 0.012 8 0 100 0 0.577 0.000
PARA DETERMINAR:
y = 0.4187x - 0.0068 R² = 0.9825 -0.050 0.000 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 A b s o r b a n c i a [] g/L CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD Linear (CURVA DE CALIBRADO DE BRADFORD)Nº Tiempo (hr) mg Proteina/L caldo CONCENT PROTEINA (g/L) ABS(595nm)
1 0 95.056 0.095 0.033
2 2 95.056 0.095 0.033
3 4 133.270 0.133 0.049
4 6 54.454 0.054 0.016
a) Concentración Proteínica vs. Absorbancia
b) Mg de proteínas vs. Absorbancia
Conc. Proteina a 30h
0.054454263
y = 0.4187x - 0.0068 R² = 1 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.000 0.020 0.040 0.060 0.080 0.100 0.120 0.140 A B S [ ] P y = 0.0004x - 0.0068 R² = 1 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.000 20.000 40.000 60.000 80.000 100.000 120.000 140.000 A B S P (Mg proteina/Lcaldo)1 26 1 3 2,00 2 - A 23 1 6 4,00 3 - B 20 1 9 6,00 4 - C 18 1 11 7,33 5 - A 15 1 14 9,33 6 - B 12 1 17 11,33 7 - C 9 1 20 13,33 8 - A 6 1 23 15,33 9 - B 3 1 26 17,33 10 - C 0 1 29 19,33
Reemplazando en:
Concentraciones de sustrato (g/l):
Para obtener la concentración de productos, así tendremos
min
ABSORBANCIAS
2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 0,079 0,098 0,146 0,149 0,092 0,141 0,109 0,369 0,201 2 0,136 0,141 0,103 0,148 0,102 0,050 0,05 0,058 0,087 6 0,291 0,352 0,278 0,326 0,204 0,125 0,181 0,161 0,235 10 0,407 0,503 0,450 0,508 0,292 0,185 0,282 0,259 0,410 15 0,557 0,708 0,670 0,782 0,439 0,260 0,408 0,404 0,598PRODUCTOS
= .( (/)) +.
= + .
.
×
y = 0.2328x + 0.238 y = 0.4092x + 0.1851 y = 0.4517x + 0.0456 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 0 5 10 15 20 P r o d u c t s ( g / L ) Tiempo (min)
A
A1 A2 A3 y = 0.2976x + 0.2774 y = 0.3543x + 0.2742 y = 0.4169x + 0.3014 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 8.000 0 5 10 15 20 P r o d u c t s ( g / L ) Tiempo (min)B
B1 B2 B3 y = 0.3584x + 0.0683 y = 0.2181x + 0.1608 y = 0.6515x + 0.105 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 P r o d u c t s ( g / L )C
C1 C2 C32 –A1 4,00000 0,23279 3-B1 6,00000 0,29763 4-C1 7,33333 0,35844 5.A2 9,33333 0,40919 6-B2 11,33333 0,35430 7-C2 13,33333 0,21814 8-A3 15,33333 0,45171 9-B3 17,33333 0,41688 10-C3 19,33333 0,65147
Si la concentracion de la Enzima aumenta, la actividad aumenta. Asimismo si se tiene una mayor concentracion de sustrato, la velocidad de reaccion aumenta, esto debido a que la enzima tendra un mayor poder catalítico, esto se debe a que existira
0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 P r o d u c t o ( g / L ) Tiempo(min)
