Técnicas Genéticas

2.3.1. Extracción de ADN genómico

El ADN se preparó según el protocolo modificado de Sambrook (40). A partir de un cultivo de 24hs en Agar Tripticase Soja (ATS, Oxoid) incubado a 37 °C se tomaron colonias individuales y se resuspendie o e μl de sa osil al , %. Luego de e t ifuga se

resuspendió el sedimento en NaCl, se vortexeó y volvió a centrifugar. La lisis enzimática se

log ó esuspe die do el pellet e μl de sa a osa al % e TE T is-Base 0,1%, EDTA 0,1%)

μl de lisozima (5mg/ml) (Sigma, USA) en TE. Luego de incubar a 37°C por 60 minutos se agregó sarcosil 5% y se mezcló por inversión; nuevamente se incubó a 37°C por una hora.

Luego se ag ega o μl de síli a %, se i u ó po a i utos, se esuspe dió se

centrifugó 1 minuto a 5000 r.p.m. El sedimento se lavó tres veces con solución de lavado (TE, Etanol 25% y NaCl 1M) y se dejó secar a temperatura ambiente por treinta minutos. Se

esuspe dió el sedi e to e agua destilada esté il μl se i u ó a °C por quince minutos. Finalmente se vortexeó y centrifugó en caliente para desprender el vidrio y se pasó el sobrenadante -conteniendo el DNA- a un tubo nuevo. La concentración de DNA se obtuvo midiendo la relación de absorbancia a 260/280 nm a través del espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific) (Figura 2). Las extracciones fueron almacenadas a -20 °C o utilizadas inmediatamente.

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2.3.2. Amplificación por PCR de los genes recA, gyrB y lepA

Se aisló el ADN genómico total, como se describió anteriormente, y luego se llevó a cabo la amplificación de los genes mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el par de cebadores que hibridan con el extremo 5´ y el 3´ del locus del gen correspondiente (Tabla 5) (26).

Tabla 5: Cebadores específicos utilizados en identificación de aislados del cBc.

Gen Secuencia Tamaño Referencia

Amplificación

recA Fw-1 (recA-1) 5´- GATAGCAAGAAGGGCTCC -3´ 1.041 pb (3) Rv-2(recA-2) 5´- CTCTTCTTCGTCCATCGCCTC -3´ gyrB Fw-1 5´- CGACAACTCGATCGACGA - 3´ 1.900 pb (3)(44) Rv-2 5´- CGGATCCATSGTSGTTTCC - 3´ lepA Fw-1 5´- GGCATCAAGGAACTGACG- 3´ 700 pb (3) Rv-2 5´- CGTGAAGGTCGACATGCT- 3´ Secuenciación

recA Fw-1 (recA-3) 5´- TGACCGCCGAGAAGAGCAA -3´ (3)

Rv-2 (recA-4) 5´- GACCGAGTCGATGACGAT- 3´

gyrB Fw-1 5´- CGACAACTCGATCGACGA - 3´ (3)

Rv-2 5´- GACAGCAGCTTGTCGTAG -3´

lepA Fw-1 5´- GGCATCAAGGAACTGACG- 3´ (3)

Rv-2 5´- CGTGAAGGTCGACATGCT- 3´

Figura 2. Interfase del software NanoDrop 2000c (Thermo Scientific). A modo de ilustración, se observa la concentración y pureza de ADN que se obtiene mediante la técnica empleada.

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A u olu e fi al de μl o te ie do μl de DNA olde - g/μl ; se le adi io a , μl del p i e fo a d p ol/μl ; , μl del p i e e e se p ol/μl ; , μl de Buffe PCR X Quiage ; , μl de dNTPs Quiage , M po ada u o de los u leótidos);

, μl de la e zi a Ta poli e asa I it oge B asil U/μl , μl de agua destilada. Las

condiciones de reacción fueron las siguientes: desnaturalización inicial a 94°C por un minuto; 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 45 segundos; annealing de los primers a 58°C por 1 minuto; extensión a 72°C por 2 minutos; una extensión final de 5 minutos a 72°C se aplicó a todos los ciclos térmicos. La amplificación se llevó a cabo en un termociclador My Cycler Thermal Cycler (BIO-RAD, USA). Los productos de PCR se resolvieron empleando geles de agarosa al 1% suplementados con bromuro de etidio (5mg/ml). La visualización de una banda única en cada caso permite la asignación del aislado al CBc.

2.3.3. Polimorfismos en la longitud de fragmentos de restricción (RFLP)

La técnica de RFLP (del inglés Restriction Fragment Length Polymorphism).

poli o fis os e la lo gitud de los f ag e tos de est i ió (37) se basa en emplear secuencias específicas de nucleótidos en el DNA que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restricción (también llamadas endonucleasas de restricción) y que varían entre individuos. Sobre los fragmentos o genes amplificados obtenidos usando la técnica de PCR se llevó a cabo una digestión con la enzima de restricción BsuRI (Fermentas), también denominada HaeIII (Promega). Los perfiles de fragmentos de restricción obtenidos fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa y comparados con aquellos que se obtuvieron empleando cepas de referencia en nuestro laboratorio o con perfiles reportados previamente en bibliografía (11)(7)(26). El procedimiento y las características de la reacción de PCR-RFLP empleando se indican en la Tabla 6.

Tabla 6. Características y condiciones de reacción para el empleo de la enzima de restricción BsuR1- Hae III.

Secuencia de

reconocimiento Mezcla de reacción Condiciones de reacción

’- G G - C C- ’ ’ - C C G G - ’ H2O dest. Est. 4 l Buffer C* 4 l BSA 10X 1 l Producto PCR 20 l Hae III 1,5 l -Incubación 2h a 37 °C. -Electroforesis en gel de agarosa al 2% suplementado con bromuro de etidio (5mg/ml).

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2.3.4. Análisis virtual del patrón de los productos de digestión producidos por la Enzima

HaeIII del gen gyrB - (RFLP in silico)

Se evaluó del potencial de la técnica de PCR-RFLP-HaeIII sobre el gen gyrB como una herramienta complementaria para confirmar la identificación a nivel de especie en ciertos aislados pertenecientes al cBc cuya identificación resulta incierta empleando otras técnicas moleculares. El procedimiento consiste en examinar de manera virtual los productos de la

aplicación RFLP-gyrB-HaeIII mediante el programa informático NEBcutter V2.0

(http://tools.neb.com/NEBcutter2/). Este programa trabaja con una secuencia del gen a analizar, que puede provenir de en un archivo local o un archivo reportado del NCBI Genbank. Dicho programa calcula todos los marcos de lectura abiertos (ORFs) y muestra las enzimas de restricción que podrían ser utilizadas para escindir cada ORFs hallado y generar corridas electroforéticas en geles con distinta concentración y composición. Finalmente, en los geles se observará la longitud de los fragmentos generados por los cortes de la enzima y una imagen hipotética del patrón de bandas observado en determinada condición de trabajo.

En nuestro esquema, el amplicón del gen gyrB es obtenido a partir de una región delimitada por el cebador foward (Fwd) del gyrB del esquema MLST (http://pubmlst.org/bcc/) y el reverse (Rvs) pc9r previamente descripto por Tabacchioni y colegas (44). Las Figuras 3 muestra los sitios de cortes para la secuencias del gen gyrB para B. cenocepacia y B. lata, mientras que en la Figura 4 se puede observar el tamaño de los fragmentos cortados y su resolución en un gel de agarosa al 2%.

A

B

Figura 3. Se indican los sitios de cortes con la enzima de restricción HaeIII sobre la secuencia nucleotídica del gen gyrB depositada en el GenBank obtenido de A) cepa B. cenocepacia J2315 (www.ncbi.nlm.nih.- gov/Genbank). Imagen tomada de B) la cepa B. lata 383 (www.ncbi.nlm.nih.- gov/Genbank). Imagen tomada de http://tools.neb.com/NEBcutter2/showdig.php?.

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