Cepa biosensora Moléculas señal
C. violaceum CV026
C4-HSL, C6-HSL, C8-HSL, 3-oxo-C4-HSL, 3-oxo-C6-HSL, 3-oxo-C8-HSL,
benzoilacetil-HSL, C4-homocisteín tiolactona, C6-homocisteín tiolactona, 3-oxo-C6-homocisteín tiolactona
C. violaceum VIR07 C8-HSL, C10-HSL, C12-HSL, C14-HSL, C16-HSL, 3-oxo-C8-HSL, 3-oxo-C10-HSL, 3-oxo-C12-HSL
2.8.2. Calibración del ensayo de detección de AHLs en placa de Petri
El ensayo de detección de AHLs en placa de Petri, fue llevado a cabo empleando las cepas biosensoras CV026 y VIR07 de C. violaceum, como así también distintas cepas productoras de AHLs. Las cepas de C. violaceum fueron sembradas en placas conteniendo medio de cultivo sólido LB. Las cepas productoras de AHLs fueron sembradas perpendicularmente a las cepas biosensoras de manera tal que crecieran cercanas a estas últimas (Figura. 4). Posteriormente, las placas se incubaron a 30ºC registrando el crecimiento y la inducción de las cepas biosensoras a distintos tiempos. Las cepas productoras de AHLs empleadas en esta calibración fueron: B. cepacia ATCC 25416, S. marcescens AS-1, A. tumefaciens R10, P. aeruginosa PAO1 y B. pertussis Tohama I. Cada cepa biosensora se sembró además frente a sí misma con el fin de corroborar que no eran capaces de generar su propia inducción.
2.8.3. Bioensayo de detección de AHLs por difusión
La detección de acil-homoserín lactonas se aplicó también sobre los extractos obtenidos a partir de los distintos cultivos de organismos del CBc, mediante el bioensayo de Figura 4. Esquema de sembrado de cepas para la detección de AHLs en placa de Petri. Las cepas biosensoras se sembraron perpendicularmente a cepas productoras de AHLs de manera que crecieran próximas y así permitir su inducción. Cada cepa biosensora se enfrentó a sí misma para confirmar que no tiene la capacidad de activar su propia inducción.
Cepas productoras
de AHLs
Cepa biosensora B Cepa biosensora A
164
detección por difusión descripto por Morohoshi y colaboradores (56), utilizando las cepas biosensoras de C. violaceum. Brevemente, 50 ml de medio de cultivo LB semi-sólido (0,75% v/v de agar) fue inoculado independientemente en una relación 10:1 con un cultivo en fase exponencial de las cepas biosensoras de C. violaceum (CV026 y VIR07). Los medios semi- sólidos inoculados fueron transferidos a placas de Petri para luego colocar sobre la superficie del agar solidificado, discos de papel Whatman con un diámetro de 8 mm. Posteriormente, 15
μl de so e ada te de ulti o e t ifugados . p , o te idos a pa ti de ulti os
líquidos y de crecimiento en biofilm, fueron aplicados sobre los discos de papel. Luego, las placas se incubaron a 30ºC durante 16-18 h. La presencia de AHLs en los extractos se determinó a través de la formación de halos de color violeta. El nivel de producción de AHLs por parte de los distintos tipos de cultivos de cBc se evaluó a través de los diámetros correspondientes a los halos de coloración. Se utilizaron extractos de cultivos líquidos de las cepas productoras de AHLs, para la obtención de controles positivos de la inducción de las cepas biosensoras por acción de dichas moléculas. Asimismo, se ensayaron como controles negativos extractos de los medios de cultivo líquidos SS y LB sin inocular como controles negativos. Este experimento se repitió al menos 2 veces utilizando extractos independientes de las cepas.
2.8.4. Identificación de AHLs mediante métodos fisicoquímicos
Los extractos obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivo en biofilm de B. contaminans fueron estudiados mediante espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier y cromatografía líquida-espectrometría de masas con el fin de corroborar la detección de las AHLs e intentar dilucidar sus estructuras moleculares
2.8.4.1. Espectroscopía infrarroja con transformada de Fourier
La espectroscopía infrarroja (FT-IR) fue utilizada para la identificación de bandas de absorción características de las AHLs, potencialmente presentes en extractos concentrados de cultivos en biofilm de aislados de B. contaminans, según el procedimiento descripto por Chhabra y colegas (12). Asimismo, extractos concentrados obtenidos a partir de cultivos líquidos de B. cepacia ATCC 25416 y P. aeruginosa PAO1ATCC 27853 fueron empleados como
o t oles positi os de AHLs. T ei ta μl de ada e t a to o e t ado fue o olo ados e
celdas de ZnSe (13×2 mm, Korth Kristalle GmbH, Alemania) y secados durante 60 min a temperatura ambiente con el fin de obtener films transparentes sobre la superficie de las celdas. Seguidamente, las celdas fueron leídas en un espectrómetro Spectrum One (Perkin-
165
Elmer, EUA) en modo absorbancia, bajo una purga continua de aire seco evitando así las interferencias causadas por vapor de agua. Los espectros IR se adquirieron en el intervalo de 4000 a 650 cm-1, a una velocidad de medición de 1cm/s, mediante 64 escaneos y una resolución de 6 cm-1. El ajuste de dichos parámetros se llevó a cabo por medio del programa Spectrum 3.0 (Perkin-Elmer, USA). A partir de los espectros IR, se calcularon sus respectivas derivadas segundas aumentando de esta manera la resolución de los picos de absorción (59). Las derivadas segundas fueron empleadas para la detección de los máximos correspondientes a la absorción de grupos funcionales propios de los distintos tipos de moléculas AHLs, los cuales se ubican en rangos específicos del espectro IR. Es importante destacar que en estos rangos espectrales no se ubican otros grupos funcionales pertenecientes a moléculas biológicas solubles en solventes no polares. En la Tabla 3 se detallan los grupos funcionales característicos de cada tipo de AHL, junto con su ubicación en el espectro IR. Dichos grupos funcionales fueron utilizados para dilucidar el tipo de molécula de AHL (N-acil HSL, N-3-oxo- alcanoil HSL y N-3-hidroxi-acil HSL) presente en los extractos.
Tabla 3. Grupos funcionales característicos de los distintos tipos de moléculas AHLs y su ubicación en el espectro IR
AHLs Grupo Funcional Rango Espectral (cm-1)
N-acil-HSLs C=O (Anillo lactona) 1780-1792 C=O (Amida) 1643-1647
N-3-oxo-alcanoil-HSLs C=O (Anillo lactona) 1781-1793 C=O (Cetona) 1710-1724 C=O (Amida) 1648-1654
N-3-hidroxi-acil-HSLs C=O (Anillo lactona) 1774-1778 C=O (Amida) 1638-1642 Los grupos funcionales característicos de las distintos tipos de moléculas de AHLs y sus rangos específicos de ubicación espectral fueron extraídos del trabajo publicado por Chhabra y colegas(12).
2.8.4.2. Identificación de AHLs mediante HPLC MS/MS-MRM
Extractos de cultivos de B. contaminans fueron analizados mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem con monitoreo de reacción multiple (HPLC MS/MS-MRM) basándonos en el trabajo de Gould y colegas (33), con el fin de lograr la separación e identificación de moléculas del tipo AHLs. El proceso de separación se llevó a cabo mediante elución por gradiente y la identificación a través de las transiciones molecula +
166
H del ión (M+H) 102 correspondiente al grupo lactona. Del mismo modo, se analizaron estándares de AHLs y extractos obtenidos de cultivos de cepas productoras de AHLs, con el objeto de registrar los picos correspondientes a las transisiones de masa MRM de dichas moléculas y sus respectivos tiempos de retención. A partir de los datos obtenidos se llevó a cabo una comparación con los resultados conseguidos a partir de los extractos de aislados de B. contaminanas y la cepa de referencia B. cepacia ATCC 25416. Para aquellas AHLs que no se dispuso de estándar, se evaluó el tiempo de retención relativo y la transición específica de masa con los obtenidos de los estándares analizados. El grado de concentración correspondiente a los estándares y extractos de cultivo, se expresó a través de las unidades Megacounts y kilocounts en el eje vertical de cada cromatograma. Este estudio de identificación fue realizado en el CIMA (Centro de Investigaciones en Medio Ambiente, CONICET-UNLP) con la colaboración del Dr. Damián Marino.
2. 9. Análisis estadístico
En el caso de las variables categóricas (expresión de exoenzima, EPS y señales de QS) en las que sólo se registró información cualitativa (ausencia o presencia), se recurrió a pruebas no paramétricas. Las diferencias se evaluaron a través una tabla de contingencia usando la
p ue a de χ2
(Chi-cuadrado de Pearson).
Para los casos de formación de biofilms o secreción de lipasas, en los cuales se registró información de tipo cuantitativa, se realizó un análisis de varianza (ANOVA). En primer lugar se realizó la prueba de normalidad (Kolmogorov-Smirnov, y en el caso de n menor a 50 se utilizó Shapiro-Wilk) y se probó la homocedasticidad (igualdad de varianza) con la prueba de Levene. Para evaluar la significancia de las diferencias, en el caso de varianzas iguales se realizaron las pruebas post-hoc de DMS y Tukey (p < 0,05) y en el caso de varianzas no homogéneas se comprobó mediante la prueba de Games-Howell. Se utilizo para el cálculo de todos los casos la plataforma estadística SPSS Statistics 17.0. y los gráficos fueron construidos utilizando Excel 2010.
167
RESULTADOS
3.1. Cinética de crecimiento de aislados clínicos de B. contaminans en cultivos líquidos
Se evaluó en primer lugar el comportamiento en cuanto a la cinética de crecimiento en el medio de cultivo LB en sistema batch de 10 aislados clínicos de B. contaminans (tomados al azar de nuestro banco de cepas). Por medio de las curvas de crecimiento obtenidas se determinó que a partir de las 10 h de incubación, la mayoría de los aislados clínicos analizados alcanzaron la fase estacionaria. De la comparación entre las curvas se aprecia que los aislamientos clínicos estudiados poseen gran variabilidad fisiológica, bajo las mismas condiciones experimentales. En la fase estacionaria del crecimiento los aislados clínicos examinados exhibieron valores de DO650 desde 1,7 a 3,5. Asimismo, para calcular la velocidad
específica de crecimiento se corrigieron los valores de DO650 por biomasa X (g/l) (Figura 6) y se
calculó el logaritmo natural de los valores de X para graficarlos en función del tiempo de incubación (gráficos no mostrados). A partir de estos gráficos se determinó la ecuación de la recta cuyo valor de la pendiente corresponde a la velocidad específica de crecimiento (). Este parámetro se utilizó para el cálculo del tiempo de duplicación o tiempo generacional de las muestras analizadas. De esta manera se determinó que los aislamientos clínicos ensayados crecen con diferente velocidad específica de crecimiento. No se observó diferencias significativas (p < 0,05) entre los aislamientos recuperados de infecciones crónicos y los demás aislados. En la Tabla 4 se detallan los valores de velocidad específica de crecimiento y tiempo de duplicación para los aislados clínicos mencionados.