Tipos de enzimas

Las enzimas mayormente estudiadas son las oxidoreductasas, especialmente la deshidrogenasa y la catalasa, por su vinculación con los procesos oxidativos de la materia orgánica, y las hidrolasas por su papel en la descomposición de determinados compuestos orgánicos, y por su relación con el ciclo de nutrientes como el carbono, el nitrógeno, el fósforo y el azufre (Dick, 1994; Nannipieri et al., 2002; Caldwell, 2005).

En este trabajo las actividades enzimáticas objeto de estudio son:

Oxidoreductasa Deshidrogenasa

Hidrolasas

Ciclo de carbono ß-glucosidasa

Ciclo del nitrógeno Proteasa-BAA y Ureasa

Ciclo del fósforo Fosfatasa alcalina

Ciclo del azufre Arilsulfatasa

Deshidrogenasa

La actividad deshidrogenasa es un indicador de la actividad biológica del suelo (Burns, 1978) Esta enzima forma parte de células vivas y no se acumula de forma extracelular en el suelo. Oxida compuestos orgánicos transfiriendo protones y electrones desde sustratos a aceptores. Estas acciones forman parte de los procesos respiratorios de los microorganismos edáficos y están directamente relacionadas con la tipología de suelo y estado hídrico (Kandeler et al., 1996). Esta actividad es indicadora del potencial del suelo para mantener procesos bioquímicos, esenciales para mantener la fertilidad del suelo.

La deshidrogenasa, representa a un conjunto de enzimas, que forman parte del sistema del transporte de electrones del metabolismo del oxígeno. Son enzimas oxidoreductasas que participan en la oxidación biológica de la materia orgánica, transfiriendo hidrogeniones desde substratos a aceptores (Tabatabai, 1982). Las deshidrogenasas son enzimas que sólo se encuentran activas en el interior de las células vivas (Dick, 1994), siendo frecuentes los

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trabajos que consideran adecuado su uso como indicador del estado de la actividad microbiana del suelo (García et al., 1997).

La actividad deshidrogenasa es más alta en suelos inundados, hecho asociado al incremento de este enzima al disminuir el potencial redox (Brzezinska et al., 1998). Con la inundación del suelo se pasa a una situación anaeróbica, condicionando los procesos respiratorios microbianos. Esta actividad enzimática se puede considerar un indicador de la actividad microbiana oxidativa (Casida, 1977; Tabatabai, 1982). La relación entre actividad deshidrogenasa, potencial redox y contenido de hierro ferroso (Fe2+) es un buen ejemplo para ilustrar las respuestas de los microorganismos a los cambios ambientales (Makoi y Ndakidemi, 2008).

También la actividad deshidrogenasa es usada como indicador de la alteración de la actividad microbiana ante plaguicidas (Baruah y Mishra, 1986), metales pesados (Wilke, 1991), prácticas culturales o indicador directo de la actividad microbiana (García y Hernández, 1997).

ß-glucosidasa

La ß-glucosidasa (EC 3.2.1.21) es una enzima relacionada con el ciclo del carbono, que pertenence al grupo de las glucosidasas, enzimas que catalizan la hidrólisis de diferentes glucósidos. En concreto la ß-glucosidasa está implicada en la hidrólisis de la celobiosa, catalizando la hidrólisis de los ß-D-glucopiranósidos en el suelo o en residuos vegetales, el producto es la glucosa, fuente energética para los microorganismos. Las glucosidasas están ampliamente distribuidas por la naturaleza, se han encontrado en suelos, microorganismos y plantas. En el suelo, las ß-glucosiadasas son las glucosidasas que más predominan (Tabatabai, 1982).

Cuantitativamente, la celulosa es el compuesto orgánico más importante, y el proceso de su transformación en el suelo es el más importante del ciclo del carbono (Sinsabaugh et al., 1991). Los vegetales contienen entre un 40 y 70% de celulosa, la cual es continuamente repuesta mediante la fotosíntesis. La descomposición microbiana de la celulosa es un proceso en el que intervienen secuencialmente tres grupos de enzimas (Alexander, 1980; Busto y Perez-Mateos, 1995): primero actúan (1) endo-ß-1,4-glucanasas que catalizan la hidrólisis de enlaces ß-1,4 en la molécula de celulosa. En los extremos libres de las cadenas, la

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intervención de (2) exo-ß-1,4 glucanasas libera celobiosa (disacárido), el cual es finalmente descompuesto por (3) ß-1,4-glucosidasa dando glucosa.

La descomposición completa de la celulosa a glucosa requiere la presencia de ß-glucosidasas que catalizan el paso limitante de la degradación de la celulosa, eliminando celobiosa (la celobiosa actúa inhibiendo la actuación de las exo-ß-glucanasas). Según García et al. (1994) la actividad ß-glucosidasa es un indicador de la biomasa microbiana del suelo, pudiendo reflejar además, el estado de la materia orgánica en el suelo y posibles desequilibrios entre la mineralización y la humificación.

Hay muchas evidencias de que la actividad ß-glucosidasa se origina a partir de enzimas abióticos (enzimas de origen biológico excretados al medio edáfico) que están, mayoritariamente, inmovilizadas adsorbidas al complejo arcillo-húmico (Busto y Perez- Mateos, 1995; Hopes y Burns, 1987).

Bandick y Dick (1999) proponen el uso de la actividad ß-glucosidasa como indicador de la calidad del suelo, al reflejar la capacidad del suelo de estabilizar la materia orgánica, detectando cambios en el contenido de la materia orgánica del suelo no perceptibles mediante otros métodos rutinarios de análisis de suelos (Dick, 1994). En esta línea, Stott et al. (2010) proponen el uso de la actividad BG como indicador de calidad del suelo, estableciendo niveles de actividad específica (actividad absoluta del enzima referido al contenido de carbono orgánico del suelo) para evaluar de forma temprana la tendencia del suelo a aumentar o disminuir la reserva de materia orgánica.

Acosta-Martinez y Tabatabai (2000) argumentan el interés de esta actividad para medir cambios provocados por la acidificación del suelo, debidos al manejo agronómico.

Los metales pesados también inciden negativamente sobre la actividad ß-glucosidasa: Geiger

et al. (1993) constatan una fuerte reducción de la actividad ß-glucosidasa afectando a la

descomposición de los residuos vegetales cuando el suelo está contaminado con metales pesados.

Proteasa

En los ecosistemas naturales y en los sistemas agrícolas que prescinden del uso de fertilizantes nitrogenados de síntesis (por ejemplo la agricultura ecológica) el nitrógeno que

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aprovecha la vegetación y los propios microorganismos procede de la mineralización del nitrógeno orgánico. Las enzimas encargadas de catalizar la transformación del nitrógeno proteico a peptídico y, posteriormente, a aminoácidos son las proteasas y peptidasas. La actividad proteásica del suelo proviene de distintos tipos de residuos de plantas, microorganismos y animales edáficos (Bonmatí et al, 2003). Entre las proteasas se pueden diferenciar las capaces de degradar sustratos proteicos (por ejemplo la gelatina, caseina y la albúmina) y proteasas que degradan sustratos más sencillos (por ejemplo N-benzoil-L- arginina amida y N-benziloxicarbonil derivados de L-fenilalanil L-leucina y glicil L- fenilalanina) (Bonmatí et al., 2003).

Las proteasas desempeñan un papel importante en la mineralización de las moléculas proteínicas, proceso regulador de la disponibilidad de nitrógeno para las plantas y los microorganismos. Estas enzimas esta generalmente asociadas a coloides orgánicos e inorgánicos (Burns, 1982; Nannipieri et al., 1996). Se ha constatado la actividad proteasa a partir del complejo húmico, en suelos agrícolas (Hayano et al., 1987), en compost de recogida municipal (Rad et al., 1995) o en bosques o praderas permanentes (Nannipieri et al, 1980,1982).

Ureasa

La ureasa (EC 3.5.1.5) es responsable de la hidrólisis de la urea formando NH4+ y CO2. El

amoniaco, en condiciones básicas se puede volatilizar, pero en suelos biológicamente activos es oxidado a nitrato, forma preferente de asimilación del nitrógeno por las plantas. En agricultura la función de la ureasa es crucial en la regulación del suministro de nitrógeno, sobre todo si se aplican fertilizantes ureicos, hecho que ha favorecido que sea una de las enzimas más estudiadas (Sastre y Lobo, 2003).

La ureasa, originada por plantas (Polacco, 1977) y microorganismos se encuentra en el interior de células vivas y también en forma extracelular asociada a complejos arcillo- húmicos (Burns, 1986; Mobley y Hausinger, 1989). La estabilidad de este enzima está afectada por varios factores: la ureasa asociada a complejos arcillo-húmicos es más estable que si se encuentra en la solución del suelo (Burns, 1986); además los complejos ureasa- humus son muy resistentes a agentes desnaturalizadores como son altas temperaturas o ataques proteolíticos (Nannipieri et al., 1978). En cambio, la ureasa extraída de plantas o microorganismos y aplicada al suelo es rápidamente degradada por enzimas proteolíticas

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(Zantua y Bremner, 1977). Este hecho hace suponer que una fracción significativa de actividad ureolítica es realizada por ureasa extracelular estabilizada en el complejo arcillo- húmico. La actividad ureasa puede estar influida por muchos factores: prácticas agronómicas, contenido en materia orgánica (Tabatabai, 1977), enmiendas orgánicas, metales pesados (Yang et al., 2006) o temperatura (Kissel et al., 1988).

Fosfatasa alcalina

Las formas de absorción más común del fósforo en el suelo por los vegetales es H2PO4-

(supone el 94% a pH=6). Al aumentar el pH aumenta la forma soluble dominante pasa a ser HPO42- (supone el 86% a pH=8). Estas formas se reparten entre la solución del suelo, en el

medio acuoso y adsorbidas al complejo de cambio, a los coloides de hierro y aluminio y a los carbonatos de calcio. Existe un equilibrio entre el fósforo adsorbido al complejo adsorbente y el presente en la solución del suelo, constituyendo las formas de fósforo asimilables (Brady y Weil, 2010).

Una parte mayoritaria del fósforo presente en el suelo no es directamente asimilable por las plantas formando compuestos altamente insolubles (formas típicas en el suelo como el apatito) y otros compuestos formados por precipitación de formas solubles, ya sea a pH muy ácido, formando fosfatos de hierro y aluminio o a pH básico, formando fosfatos cálcicos cristalizados de tipo apatito (Frossard et al., 1995). También, los fosfatos pueden integrarse o quedar inmovilizados en redes cristalinas de minerales de arcilla. Otra forma en que se encuentra el fósforo es como integrante de la materia orgánica, estando sometido a la dinámica de mineralización, igual que ocurre, por ejemplo, con el nitrógeno. Las formas orgánicas incluyen mono y diésteres de fosfato, fosfatos de inositol, polifosfatos orgánicos y fosfonatos (Condron et al., 2005).

En suelos agrícolas con alta fertilización química y pocas aportaciones de residuos orgánicos, con poca materia orgánica, domina la fracción inorgánica (típicamente alrededor del 70%), mientras que en sistemas más equilibrados combinando fertilizantes orgánicos y minerales las fracciones orgánicas e inorgánicas se equilibran (50% cada fracción) y en los sistemas seminaturales, con escasas aportaciones de fertilizantes el fósforo inorgánico solo supone alrededor de un tercio del total (Stutter et al., 2015).

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Aunque los microorganismos son los principales productores de fosfatasas, las plantas también pueden excretar fosfatasas ácidas. Las plantas han desarrollado mecanismos para tolerar bajas disponibilidades de fósforo, aumentando la síntesis de dichas fosfatasas ácidas, que se incrementan en condiciones de baja disponibilidad de fósforo (Miller et al., 2001; George et al., 2011). Del mismo modo, las leguminosas secretan mayores cantidades de fosfatasa ácida que los cereales, probablemente debido a sus altas exigencias de fósforo en el proceso de fijación simbióntica de nitrógeno (Li et al., 2004). A pesar de la síntesis de fosfatasas ácidas por las plantas, hay evidencias de que en suelos con altos contenidos de fósforo orgánico y alta actividad biológica se facilita la asimilación de fósforo a los cultivos herbáceos (Simpson et al., 2012). Precisar esta contribución es muy difícil ya que, a nivel microbiológico, se dan continuos procesos de inmovilización, remineralización e hidrólisis extracelular a través de las fosfatasas (Bünemann, 2015).

Las fosfatasas incluyen un amplio grupo de enzimas capaces de catalizar la hidrólisis de esteres y anhídridos del ácido fosfórico, desempeñando un papel crucial en el ciclo del fósforo (Speir y Ross, 1978; Juma y Tabatabai, 1978), estando correlacionadas con la disponibilidad de fósforo para las plantas y el crecimiento vegetal por lo que se consideran buenos indicadores de la fertilidad del suelo (Eivazi y Tabatabai, 1977; Dick et al., 2000).

La fosfatasa alcalina (fosfohidrolasa monoéster ortofosfórico, EC 3.1.3.1) presenta un óptimo de actividad en pH alcalino (Tabatabai, 1982). La actividad de la fosfatasa alcalina en los suelos tiene un origen microbiano, debido a la ausencia de esta enzima en las plantas superiores.

Arilsulfatasa

La asimilación de azufre por las plantas es en forma de sulfato (SO4=). En el suelo el azufre

inorgánico está mayoritariamente en forma de SO4=, ya sea en forma soluble o adsorbido a los

coloides del suelo. Además en los suelos calcáreos puede encontrarse asociado a carbonatos de calcio y en ocasiones los suelos están enriquecidos en este elemento, formando horizontes gípsicos o petrogípsicos. A pesar de la presencia de suelos enriquecidos en este elemento, en la mayoría de casos los sulfatos disponibles para las plantas ya sea en forma soluble o adsorbida no suele sobrepasar el 10% del total (Marschner, 2011). El azufre presente en la

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materia orgánica del suelo o de los fertilizantes orgánicos requiere del proceso de la mineralización para pasar a las formas inorgánicas.

Nguyen y Goh (1994) señalan que la mayoría del azufre de los suelos esta en forma orgánica y en praderas de clima templado el azufre orgánico supone más del 95% del total mientras que el resto está en formas solubles o adsorbidas. Los procesos de mineralización e inmovilización dependen de las tasas de mineralización del carbono por lo que cambios en el manejo del suelo o aplicaciones de materia orgánica afectan a la disponibilidad de este elemento (Knights et al., 2001). La disponibilidad del azufre de las formas orgánicas dependerá de la hidrólisis extracelular de los ésteres de sulfato u oxidación intracelular de materia orgánica soluble absorbida por microorganismos edáficos para obtener energía, aprovechando el sulfato como subproducto (Dodgson et al., 1982). En general, estos procesos dependen de sulfatasas, las cuales pueden ser pueden ser de origen animal, vegetal y microbiano, aunque son mayoritariamente de origen microbiano (Kertesz, 1999). En la naturaleza se encuentran diversos tipos de sulfatasas: arilsulfatasas, alquilsulfatasas, esteroidesulfatasas, mirosulfatasas, etc.

Las arilsulfatasas (EC 3.1.6.1) son enzimas muy extendidas en la naturaleza y en los suelos (Gupta et al., 1993); son responsables de la hidrólisis de los ésteres de sulfato en el suelo (Kertesz y Mirleau, 2004) siendo secretadas por bacterias, en respuesta a limitaciones de azufre, presentando una relación directa con la biomasa microbiana y las tasas de inmovilización (Klose y Tabatabai, 1999; Vong et al., 2003). Catalizan la hidrólisis de éster sulfatos, aromáticos y no aromáticos, mediante división de los enlaces O-S (Tabatabai, 1982). Teniendo en cuenta la importancia del azufre en la nutrición vegetal, el conocimiento sobre el papel que desempeñan las fosfatasas así como los grupos de microorganismos específicos que intervienen en el ciclo orgánico del azufre, son aspectos claves para asegurar un suministro adecuado de este elemento (Kertesz y Mirleau, 2004).