El primer punto a tener en cuenta a la hora de realizar cada trasplante de células madre fue tener la certeza de que las células que se iban a trasplan- tar estuviesen vivas y fuesen funcionales. Las células sobrantes tras los dife- rentes trasplantes sufrieron las mismas manipulaciones que las inyectadas a los ratones receptores, por lo que constituyeron una buena muestra para com- probar esta viabilidad. El hecho de que no incorporasen el colorante Azul Tripán demuestra su supervivencia a lo largo del proceso de extracción; la ca- pacidad de proliferar y diferenciarse en cultivos demuestra su funcionalidad. De esta manera, podíamos estar seguros de que las células trasplantadas tenían al menos la capacidad de reconstituir la médula ósea eliminada de los ratones receptores (Whetton y Graham, 1999). En cuanto al número de células inyecta- das, existen trabajos que demuestran que una sola célula trasplantada es ca- paz de reconstituir la totalidad de la médula ósea (Krause et al., 2001). En nuestro caso, no pretendimos ajustar la cantidad de células trasplantadas ni estudiar esta capacidad de reconstrucción de la médula ósea. Por el contrario, el objetivo de nuestro trabajo fue conseguir el trasplante más efectivo posible, como herramienta de terapia celular, sin poner en riesgo la supervivencia de los receptores. De esta manera, la cantidad de células empleada, 7,5 millones, fue similar a la empleada en trabajos previos (Priller et al., 2001b; Álvarez- Dolado et al., 2003), obteniendo resultados positivos.
Los dos métodos de ablación empleados –radiación y busulfán- se con- sideran mecanismos efectivos para eliminar la médula ósea de los ratones re- ceptores. En el caso de la radiación, se eligieron 7.5 Gy como dosis mínima suficiente para realizar su cometido, la denominada dosis letal mínima (Recio, 2008; Díaz et al., 2011; Recio et al., 2011). Por su parte, el busulfán es uno de los componentes químicos empleados de forma rutinaria para la realización de estos experimentos (Locatelli et al., 1994; Espejel et al., 2009), junto con otros como el treosulfán (Scheulen et al., 2000) o la fludarabina (Casper et al., 2004). De todas formas, cada vez que se procedió a la ablación de médula ósea por cualquiera de los dos métodos, se seleccionaron algunos animales como con- troles sin trasplante. En todos los casos, estos controles de ablación murieron, corroborándose así la efectividad de los métodos empleados.
Una prueba fehaciente de la eficacia del trasplante fue la supervivencia de los ratones trasplantados. Sólo en contadas ocasiones se produjo la muerte de alguno de estos animales. Estos escasos eventos no se debieron al proceso de ablación y fallo en la incorporación de las células trasplantadas, sino a otras causas comunes de mortalidad en un animalario. Podría concluirse así que el trasplante de médula ósea fue seguro y viable, permitiendo la supervivencia de la práctica totalidad de los animales trasplantados.
El hecho de la supervivencia de los animales trasplantados puede impli- car que los métodos de ablación empleados no fuesen suficientes para destruir la médula ósea de los animales receptores. De esta manera, la supervivencia de estos animales pudo deberse no a un éxito del trasplante, sino a que un re- manente de células de la médula ósea propia hubieran podido regenerarla. Pa- ra descartar esta posibilidad se llevó a cabo el análisis periódico de la sangre periférica de los animales trasplantados, como buen indicador de la reconstitu- ción de la médula ósea por las células exógenas (Díaz et al., 2011; Recio et al., 2011). El incremento progresivo del porcentaje de células sanguíneas positivas para la GFP demostró claramente la sustitución progresiva de las células de la sangre de los animales receptores por aquéllas derivadas de la nueva médula ósea. En el caso de los animales irradiados a P19 y trasplantados a P20, tanto en ratones silvestres como en ratones PCD, este porcentaje llegó a niveles si-
milares a los de los ratones donantes, por lo que se prueba definitivamente la eficacia del trasplante.
En el caso de los ratones sometidos a ablación química y trasplantados a P0, los niveles de células positivas para GFP en la sangre, aunque se incre- mentaron de forma progresiva, no llegaron a niveles tan altos como en el caso anterior. El periodo de supervivencia de estos animales fue menor, por lo que no transcurrió un tiempo suficiente para la sustitución completa de la sangre de estos ratones receptores. Sin embargo, los niveles de GFP en la sangre de ra- tones irradiados y trasplantados a P20 a edades de supervivencia similares fueron también superiores. Para explicar este hecho, hay que tener en cuenta que el trasplante de los ratones a P0 se realizó por vía intrahepática de forma análoga a trabajos relacionados (Espejel et al., 2009). Dado el pequeño tamaño de los animales receptores, no descartamos que en algunos casos el trasplante pudiera haberse quedado en el peritoneo. El trasplante intraperitoneal, aunque ha sido previamente utilizado (Mezey et al., 2000; Corti et al., 2002; Álvarez- Dolado et al., 2003), presenta desventajas con respecto al trasplante intraveno- so (Recio, 2008). Además, hay que tener en cuenta que se ha sugerido que la radiación incrementa o acelera el proceso de reconstitución sanguínea en ani- males trasplantados (Nygren et al., 2008). No se sabe a ciencia cierta si en es- tos animales en concreto el proceso de incorporación del trasplante y la susti- tución progresiva de la sangre fueron más lentos y pudieran requerir de perio- dos de supervivencia aún mayores, pero entonces no tendría sentido para el objetivo buscado: ver las posibilidades de terapia celular antes de la degenera- ción de las células de Purkinje.
Finalmente, es necesario señalar la presencia de algunos animales tras- plantados a P0 con porcentajes de células positivas para la GFP en sangre muy reducidos. Como hemos visto anteriormente, la incorporación del trasplan- te en la sangre es más lenta en los animales trasplantados a P0. Además, es posible que en esos casos, los métodos de ablación y trasplante no funciona- sen de forma adecuada. Estos sujetos se retiraron del estudio para evitar posi- bles resultados erróneos.