Son escasos los estudios en los que se ha cuantificado el nivel de ADN de
Brucella spp. en muestras clínicas (Debeaumont et al., 2005; Navarro et al., 2006;
Queipo-Ortuño et al., 2008(a); Vrioni et al., 2008).
Se ha postulado que la determinación de la carga bacteriana podría, en teoría, ser útil para la predicción de recidivas, determinar la severidad de la enfermedad, la necesidad de un nuevo tratamiento antimicrobiano, o para evaluar cómo y cuando el
patógeno se ha erradicado (Vrioni et al., 2008). Sin embargo, hasta la fecha ninguna de estas posibilidades se han comprobado. La mayoría de los estudios anteriormente citados, describen el nivel de ADN bacteriano en el diagnóstico del episodio agudo (Debeaumont et al., 2005; Navarro et al., 2006).
En el presente estudio, no encontramos diferencias estadísticamente significativas en la carga bacteriana entre los pacientes con brucelosis crónica y los sujetos asintomáticos con antecedentes de brucelosis, tanto para las muestras de sangre como para las muestras de suero. Tampoco encontramos diferencias entre los pacientes con enfermedad focal y los pacientes con síntomas inespecíficos. Por lo tanto, atendiendo a estos resultados, parece que la determinación de la carga bacteriana carece de utilidad en la valoración de la severidad de la enfermedad.
Sólo hay un trabajo en el que se ha comparado la carga bacteriana entre un grupo de pacientes con brucelosis aguda y un grupo control, en el que se han incluido sujetos asintomáticos con una historia previa de brucelosis (Queipo-Ortuño et al., 2009). En este estudio, los autores sugieren un punto de corte de 5 x 103 copias/ml para la distinción entre brucelosis activa y brucelosis pasada. No podemos comparar la carga bacteriana cuantificada en los pacientes crónicos con la obtenida por estos autores, debido a que comparan el grupo de asintomáticos con un grupo de pacientes con brucelosis aguda. Además, se utilizan diferentes ensayos, curvas estándar y métodos de extracción de ADN y la cuantificación se expresa en distintas unidades. En un estudio anterior, nuestro grupo valoró el ensayo de PCRQtr descrito en el presente estudio para el diagnóstico de pacientes con brucelosis aguda (Navarro et al., 2006). En dicho estudio, encontramos que la carga bacteriana media fue de 103 copias/ml, superior a la cuantificada en los pacientes con brucelosis crónica y los sujetos asintomáticos en los que se ha cuantificado del orden de 102 copias/ml. Probablemente, si comparáramos la carga bacteriana entre el grupo de pacientes agudos y el grupo de asintomáticos encontraríamos diferencias, de acuerdo a lo descrito por estos autores (Queipo y cols., 2008(a)).
De entre los estudios que han empleado ensayos de PCR convencional, algunos han descrito que la intensidad de la banda amplificada es más débil en pacientes
crónicos que en agudos (Nimri et al., 2003; Shestopalov et al., 1999; Zheludkov et al., 2003). Otros estudios, sin embargo, describen que la intensidad de la señal es la misma tanto para los pacientes con brucelosis aguda como para los pacientes con brucelosis crónica (Elfaki et al., 2005(a)).
Otra de las posibles aplicaciones de la determinación de la carga bacteriana es su utilidad en la respuesta al tratamiento. En el presente estudio, la carga bacteriana media descendió significativamente tras el tratamiento antimicrobiano, tanto en los pacientes con enfermedad focal como en los pacientes con síntomas inespecíficos. Sin embargo, este descenso en la carga bacteriana media no guardó relación con una buena evolución. El único paciente en el que se observó mejoría clínica con negativización del ensayo de PCRQtr fue el paciente nº 1 con un absceso esplénico que recibió tratamiento antimicrobiano durante más de un año. A la vista de estos resultados, se podría plantear la aplicación de tratamientos más prolongados, monitorizando la carga bacteriana y los titulos de anticuerpos frente a Brucella spp.
LIMITACIONES
DEL
DIAGNÓSTICO
MOLECULAR
DE
LA
BRUCELOSIS CRÓNICA
Una de las características principales observadas en el presente estudio ha sido la detección intermitente del ADN de B. melitensis. La detección intermitente sugiere que la sensibilidad analítica del ensayo de PCRQtr se ve comprometida cuando la bacteria o su ADN están presentes a bajos niveles. Sin embargo, esto mismo ha sido observado por otros autores para el diagnóstico del episodio agudo cuando la carga bacteriana es mayor (Navarro et al., 2006; Maas et al., 2007).
Un paso crítico antes de la realización de cualquier ensayo de PCR convencional o en tiempo real es que el método de extracción de los ácidos nucleicos realice una lisis completa de la bacteria. En 1982, Moriyón y Berman observaron que la envoltura celular de Brucella spp. es más resistente que la de otras bacterias Gram negativas como
Escherichia coli a detergentes no iónicos, agentes utilizados por la mayoría de los
Tan importante como lo anterior es que el método de extracción proporcione un ADN puro, esto es, libre de componentes propios de la muestra o del mismo método que puedan inhibir la reacción de amplificación. Se han descrito numerosos componentes de la sangre como el grupo hemo de la hemoglobina, los iones calcio, el ADN de los leucocitos, la lactoferrina, la IgG o, componentes añadidos como el EDTA o la heparina que podrían inhibir la reacción de amplificación dando lugar a falsos negativos (Al-Soud et al., 2000; Al-Soud y Rådström, 2001; Morata et al., 1998; Navarro et al., 2004; Queipo-Ortuño et al., 2008). Recientemente, Queipo-Ortuño y cols. han comparado siete de los kits de extracción de ADN más utilizados en el mercado (Queipo et al., 2008b). Para ello inocularon muestras de suero con la cepa vacunal Rev-1 de B. melitensis. De entre todos los kits utilizados, el de MoBio, el mismo que se ha utilizado en el presente estudio, demostró ser el más eficiente, aportando el ADN más puro, el menor tiempo de ejecución, menor coste por muestra analizada y siendo el único en el que no se observó contaminación de los controles negativos de extracción (Queipo-Ortuño et al., 2008b). Por otra parte, también es importante que la extracción del ADN se realice de forma adecuada. La mayoría de los
kits comerciales utilizan etanol para precipitar los ácidos nucleicos. Si el etanol no se
elimina correctamente, un exceso del mismo puede inhibir la reacción de amplificación (Espy et al, 2006).
Como control de inhibición de la reacción de amplificación se recomienda el uso de controles internos positivos (IPC, de la terminología inglesa “internal positive
control”), esto es, la adicción de una pareja de cebadores a la mezcla de reacción para la
amplificación de una secuencia genómica altamente conservada. Hasta la fecha sólo un estudio relacionado con la detección de ADN Brucella spp. en muestras clínicas ha incluido un IPC a la mezcla de reacción (Vrioni et al., 2008). Sin embargo, estos autores no detallan ni la secuencia amplificada ni los cebadores utilizados. Tampoco describen si hubo ausencia de amplificación de este control en las muestras evaluadas. Otros autores, en la evaluación de un ensayo de PCR convencional o en tiempo real sobre cultivo puro, han incluido como IPC la amplificación de ADN de Campylobacter spp. (Bogdanovich et al., 2004; Lübeck et al., 2003) o del bacteriófago λ (Al-Dahouk et al., 2007). En un estudio anterior, nuestro grupo abordó la posibilidad de una inhibición de
la reacción de amplificación. Para ello, añadimos a la mezcla de reacción una pareja de cebadores específicos que amplifican una secuencia del gen k-ras humano (datos no mostrados). Las diez muestras de ADN evaluadas procedían de pacientes diagnosticados de brucelosis aguda que se encontraban en tratamiento antimicrobiano y que previamente habían sido positivas para el ensayo de PCRQtr. Observamos que hubo amplificación de la secuencia del gen humano en todas las muestras analizadas, sin embargo, la amplificación del ADN de B. melitensis no tuvo lugar en la mayoría de ellas. Estos resultados sugieren que no hay inhibición de la enzima ADN Taq polimerasa sino más bien que el ADN genómico humano interfiere en la reacción de amplificación (Navarro et al., 2004) o que las cantidades pequeñas de ADN de Brucella spp. pueden no amplificarse incluso en los ensayos más sensibles. Se ha descrito que los dNTPs, el MgCl2 y la enzima ADN Taq polimerasa pueden dirigirse a la amplificación
del IPC (Navarro, 2009). En lo sucesivo desestimamos el uso de este IPC porque para la visualización del producto amplificado era necesario realizar un gel de agarosa lo que, además de suponer un riesgo de contaminación importante entre muestras, restaba rapidez y sencillez al ensayo de PCRQtr, razones principales de su utilización.