Variabilidad genética en poblaciones apomícticas

En un principio, se pensaba que la apomixis llevaría a las especies a un callejón sin salida desde el punto de vista de la evolución (Darlington, 1939; Stebbins, 1950); sin embargo, se ha demostrado que las poblaciones de especies apomícticas presentan una considerable diversidad genética, la cual podría deberse al flujo génico desde poblaciones diploides sexuales simpátricas (Daurelio et al., 2004; Garcia et al., 2007; Sartor et al., 2013) a través de puentes triploides (Quarin et al., 1992), sexualidad residual en individuos apomícticos (Rebozio et al., 2011; Sartor et al., 2013) o mutaciones (Hörandl y Paun, 2007). A pesar de ello, es aceptado que éstas poblaciones presentan uno o pocos genotipos predominantes, probablemente debido a que éstos tienen una mejor adaptación a nichos ecológicos específicos, por lo que queda en evidencia que es esperable una mayor diversidad entre poblaciones que dentro de ellas (Gornall, 1999; Richards, 2003; Paun et al., 2006; Gutierrez- Ozuna et al., 2009). Un estudio reciente, realizado en poblaciones naturales de P. simplex, ha reportado que el 85% de la diversidad genética en los apomícticos es explicado por variaciones entre poblaciones, mientras que solo el 15% está dentro de las poblaciones (Brugnoli et al., 2014). Resultados similares fueron reportados por Paun et al. (2006), García et al. (2007) y Sartor et al. (2013) en poblaciones naturales de varias especies apomícticas. Reyno et al. (2012) realizaron un estudio de variabilidad genética en colecciones naturales de P. notatum en Uruguay, a partir de marcadores moleculares de ISSR, reportando una distribución casi equitativa de la variación intra- e interpoblaciones; sin embargo, los autores aclaran que esto probablemente se deba al hecho de que las poblaciones estuvieron representadas por unos pocos individuos (1 a 6), los cuales a su vez fueron colectados en base a variaciones fenotípicas para su uso en un programa de mejora, por lo que la variabilidad intra-poblacional podría estar sobreestimada por el método de muestreo.

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El conocimiento de la diversidad genética es de gran importancia en el planeamiento de programas de mejoramiento y para la conservación de los recursos genéticos de las especies vegetales (Cidade et al., 2008). Estos estudios pueden ser realizados mediante el uso de marcadores morfológicos y/o moleculares, siendo los primeros extensamente utilizados, hasta antes del desarrollo de las técnicas de análisis molecular, y posteriormente fueron paulatinamente reemplazados por estos últimos, debido al limitado número de marcadores morfológicos informativos para una población y a los problemas de variación según el ambiente. Los primeros estudios de diversidad molecular fueron realizados con aloenzimas y proteínas de reserva, los cuales presentaban la ventaja de ser codominantes, pero aun así, fueron reemplazados paulatinamente por marcadores más informativos como los basados en la variación del ADN. Estos últimos pueden ser divididos en 5 principales categorías:

1. Ensayos basados en la digestión del ADN con endonucleasas y posterior hibridación, como los RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) (Botstein et al., 1980). 2. Ensayos realizados a partir de la amplificación del ADN, como los RAPD (Random

Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990) e ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat) (Fang y Roose, 1997).

3. Ensayos realizados mediante la amplificación selectiva de fragmentos de restricción del ADN, denominados AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) (Vos et al., 1995).

4. Evaluaciones basadas en la amplificación de secuencias repetitivas del ADN, de 1 a 6 pb de longitud, conocidos como microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeat) (Litt y Luty, 1989; Tautz, 1989).

5. Ensayos mixtos basados en la detección de mutaciones puntuales a nivel de pares de bases, denominados SNP (Single Nucleotide Polymophism) (Lindblad-Toh et al., 2000).

En los últimos tiempos, el uso de la secuenciación genómica se ha extendido rápidamente, debido a la gran cantidad de información obtenida por estas técnicas y a los avances tecnológicos que permitieron que este tipo de estudios sean cada vez menos costosos y se pongan al alcance de un mayor número de laboratorios. Esta nueva tecnología se ha extendido rápidamente en las especies de mayor interés agronómico, como los cultivos mayores y hortícolas; sin embargo, aún no está muy difundido en los cultivos de interés forrajero, y en particular en gramíneas megatérmicas como es el caso de P. notatum.

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Varios estudios de diversidad genética usando marcadores moleculares han sido realizados en poblaciones naturales de P. notatum. Daurelio et al. (2004) determinaron mediante el uso de marcadores RAPD que las poblaciones apomícticas simpátricas a diploides sexuales presentaban mayor diversidad que aquellas alopátricas, y plantearon la hipótesis de la existencia de un flujo génico entre éstas poblaciones, probablemente gracias a la formación de individuos triploides apomícticos, los cuales actúan como puente para la generación de nuevos tetraploides, mediante la formación de híbridos BIII (Quarin et al., 1992). Espinoza et al. (2006) no lograron detectar una alta diversidad genética, mediante el uso de AFLP, en una colección de germoplasma de 31 individuos apomíctico de P. notatum, como tampoco encontraron correlación entre distancia genética y geográfica. Cidade et al. (2008) y Reyno et al., (2012) encontraron que los marcadores de ISSR logran relevar un alto grado de diversidad genética en colecciones de P. notatum de Brasil y Uruguay, respectivamente. En ambos trabajos se encontró una muy baja o nula correlación entre distancia genética y geográfica.

Morgante & Olivieri (1993) identificaron un gran número de regiones repetitivas de microsatélites en el genoma vegetal, principalmente AT, estando estas regiones ubicados en promedio una cada 50 Kb, lo que las convierte en marcadores de gran utilidad en estudios poblacionales, entre otros usos. Cidade et al. (2009; 2010) lograron generar varios cebadores de microsatélites para P. notatum, destacando el alto contenido de información polimórfica (PIC) revelado por este tipo de marcadores y su utilidad para ser usados en especies afines a P. notatum (Cidade et al., 2010). Los marcadores de SSR tienen la ventaja de ser reproducibles (Jones et al., 1997), lo que permite obtener resultados comparables entre diferentes laboratorios, co-dominantes (Shattuck-Eidens et al., 1990; Senior & Heun, 1993; Senior et al., 1996) y multialélicos (Ching et al., 2002), lo que los convierte en marcadores altamente informativos y por lo tanto de gran utilidad en la evaluación de variabilidad genética.

Otra herramienta de utilidad para evaluar la variabilidad genética, sobre todo en estudios dirigidos al mejoramiento vegetal, es el uso marcadores morfológicos y agronómicos, que si bien no son numerosos y en general se encuentran influenciados por variaciones ambientales, tienen la ventaja de brindar información de gran utilidad en la identificación y selección de genotipos superiores en programas de mejoramiento. Algunos caracteres morfológicos como el largo y ancho de hoja, y habito de crecimiento, fueron útiles para diferenciar las variedades botánicas de P. notatum var. saurae (2x) y P. notatum tetraploide (4x) (Blount y Acuña, 2009). De Moraes Fernandes et al. (1973) utilizaron características

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citológicas, junto a variables como hábito de crecimiento, largo y ancho de hoja, pilosidad de la lámina, longitud de racimos, tipo de lígula y características de las espiguillas para diferenciar 4 grupos taxonómicos de P. notatum del estado de Rio Grande do Sul (Brasil). Barreto (1974) y Cando Dorow (1993) utilizaron caracteres similares para diferenciar formas típicas de la especie en Brasil; sin embargo, debido a la alta variabilidad presente en la especie y al escaso número de individuos analizados, estos grupos no están claramente delimitados, generando algunas confusiones en su determinación (Cidade et al., 2008; 2013). Cidade et al. (2013) evaluaron la diversidad morfológica de un grupo de individuos de

P. notatum colectados en Brasil, en base a variables vegetativas (largo y ancho de vaina, largo y ancho de lámina) y reproductivas (altura de inflorescencia, número de racimos, largo y ancho de espiguilla), reportando una amplia diversidad para todos los caracteres evaluados, lo que dificulta su agrupamiento en grupos taxonómicos informales. De todas formas, los autores lograron identificar 3 grandes grupos taxonómicos (saurae, latiflorum y

notatum), principalmente en base a las diferencias en largo y ancho de las espiguillas, ya que el resto de los caracteres presentaban una distribución más continua y solapamientos entre grupos.

Estos avances en la caracterización de la diversidad genética, a nivel de poblaciones naturales y bancos de germoplasma, sumado al desarrollo de marcadores moleculares confiables y de alto valor en la detección de variabilidad genética, fueron considerados antecedentes importantes para llevar a cabo la evaluación de la transferencia de la diversidad presente en el germoplasma tetraploide apomíctico hacia la población tetraploide sintética sexual, y la evaluación de su variabilidad a nivel molecular y morfo-agronómico, lo cual permitirá generar información de utilidad para los programas de mejoramiento en la especie.