EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE UN RESIDUO VEGETAL DE CRISANTEMO DEGRADADO POR Pleurotus ostreatus EN UN PROCESO DE COMPOSTAJE
EN MICROCOSMOS
ÁNGELA ADRIANA VARGAS RODRÍGUEZ
CINDY CAROLINA ROMERO GUTIERREZ
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el titulo de
MICROBIÓLOGAS INDUSTRIALES
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de julio de 1946
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE UN RESIDUO VEGETAL DE CRISANTEMO DEGRADADO POR Pleurotus ostreatus EN UN PROCESO DE COMPOSTAJE
EN MICROCOSMOS
ÁNGELA ADRIANA VARGAS RODRÍGUEZ
CINDY CAROLINA ROMERO GUTIERREZ
______________________________ ____________________________
Dra. INGRID SCHULER, PhD Dr. JANETH DEL CARMEN ARIAS, M Sc.
Decano Académica Facultad de Ciencias Directora de carrera Microbiología Industrial
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C
EVALUACIÓN DEL EFECTO DE LA APLICACIÓN DE UN RESIDUO VEGETAL DE CRISANTEMO DEGRADADO POR Pleurotus ostreatus EN UN PROCESO DE COMPOSTAJE
EN MICROCOSMOS
ÁNGELA ADRIANA VARGAS RODRÍGUEZ
CINDY CAROLINA ROMERO GUTIERREZ
APROBADO
______________________________ ____________________________
BALKYS QUEVEDO HIDALGO MARCELA FRANCO CORREA
Directora Co- Directora
_________________________
ADRIANA MATIZ VILLAMIL
Jurado
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BOGOTÁ, D.C
DEDICATORIA
Le dedico este trabajo a Dios en primer lugar; Sin Él nada de esto hubiera sido posible,
A mis padres y hermanos; porque gracias a su apoyo, A su amor, a su confianza y a su esfuerzo,
Este trabajo es hoy una realidad. A los amores de mi vida,
Por sacarme sonrisitas y momentos de alegría,
A todos y cada una de las personas que se involucraron en este proceso, ¡Porque este esfuerzo fue de todos, este logro es para todos!
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darnos la oportunidad de llegar hasta este punto en nuestra carrera y
de vivir esta experiencia tan enriquecedora,
A nuestras familias y amigos por su constante apoyo, paciencia y por permitirnos
ver siempre lo mejor en cada obstáculo,
A Cultivos del Norte S.A por prestarnos sus instalaciones para el desarrollo de
este proyecto así como por la colaboración de sus trabajadores,
A la profesora Balkys Quevedo por su apoyo invaluable y paciencia,
A la profesora Marcela Franco-Correa por guiarnos en el transcurso de este
proceso,
A las profesoras Ivonne Gutierrez y Adriana Matiz por su colaboración en el
desarrollo de este trabajo,
Al grupo de estudiantes del laboratorio de Biotecnología aplicada por su
RESUMEN
En este proyecto se propuso determinar las concentraciones de inductores enzimáticos como el cobre y manganeso que conlleven a que Pleurotus ostreatus aumente la producción de azúcares reductores a partir de la degradación del residuo sólido vegetal de crisantemo y además evaluar el efecto que causa en el compostaje la aplicación de este residuo parcialmente degradado por
Pleurotus ostreatus en el comportamiento de la población microbiana y en el pH de los microcosmos.
Pleurotus ostreatus es un hongo de la podredumbre blanca con capacidad de producir enzimas lignocelulolíticas como lacasa, manganeso peroxidasa y celulasas entre otras. Estos catalizadores biológicos pueden generar a partir de la lignocelulosa compuestos como humus, gases y azúcares reductores. Las enzimas lacasa y manganeso peroxidasa tienen como cofactores enzimáticos los iones Cu 2+ y Mn2+ respectivamente. Uno de los objetivos de este proyecto fue evaluar distintas concentraciones de CuSO4 y MnSO4 que favorecieran la degradación de residuos provenientes de crisantemo tratado con Pleurotus ostreatus. Los ensayos se realizaron con residuo de crisantemo al 5% (p/v) pH 6,0 ± 0,5 en Erlenmeyer de 100 mL. La degradación se relacionó con la concentración de azúcares reductores en g·L-1, producidos luego de 24 h de incubación a 30°C y 200 rpm. Los resultados del análisis estadístico no indicaron diferencia significativa entre los tratamientos, pero indican que los ensayos pueden ser reproducibles si se mantienen las mismas concentraciones de sales, rpm, y aireación.
La relación C/N inicial y final entre los microcosmos con residuo degradado y sin él fue prácticamente la misma, indicando que el proceso de compostaje en microcosmos del residuo de flores no se altera por la adición del residuo de crisantemo degradado, sin embargo el montaje del ensayo en microcosmos no simula el proceso real de compostaje de estos residuos vegetales.
TABLA DE CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS ... 9
LISTA DE TABLAS ... 9
LISTA DE ANEXOS ... 9
1. INTRODUCCIÓN ... 10
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 11
3. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA ... 12
3.1. Enzimas lignocelulolíticas ... 12
3.2. Microorganismos degradadores de lignocelulosa ... 12
3.2.1. Pleurotus ostreatus ... 13
3.3. Inductores enzimáticos ... 13
3.4. Compostaje ... 14
3.4.1. Microorganismos ... 15
3.4.1.1. Bacterias ... 16
3.4.1.2. Hongos ... 16
3.5. Componentes de la materia orgánica en el compost ... 16
3.5.1. Lignocelulosa ... 16
3.5.2. Celulosa ... 17
3.5.3. Hemicelulosa ... 17
3.5.4. Lignina ... 17
4. OBJETIVOS ... 17
4.1. Objetivo General ... 17
4.2. Objetivos Específicos ... 18
5. MATERIALES Y MÉTODOS ... 18
5.1. Determinación de las mejores concentraciones de CuSO4 (mM) y MnSO4 (mM) para la degradación del residuo de crisantemo con tamaño de partícula < 1 mm. ... 18
5.1.1. Análisis estadístico ... 18
5.1.2. Cultivo en el residuo vegetal ... 19
5.2. Montaje del proceso de compostaje en microcosmos ... 19
5.2.2. Comportamiento de la microbiota a lo largo del proceso de compostaje en microcosmos .... 20
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 21
6.1. Evaluación de la degradación del residuo con el uso de inductores ... 21
6.2. Comportamiento de la población microbiana durante el proceso de compostaje en microcosmos ... 26
6.3. Relación Carbono orgánico/ Nitrógeno total ... 31
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ... 32
8. BIBLIOGRAFÍA... 33
LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. Ciclo global del carbono……….……….12
FIGURA 2. Concentración de azúcares reductores obtenidos luego de la degradación del residuo de Crisantemo por parte de P. ostreatus………...19
FIGURA 3. Promedio de la concentración de azúcares reductores obtenidos con concentraciones de cobre y manganeso en los ensayos en Erlenmeyer y en biorreactor………..20
FIGURA 4. Cromatograma del extracto crudo del ensayo realizado en biorreactor ...………... 21
FIGURA 5. Comportamiento de la población microbiana de mesófilos………23
FIGURA 6. Comportamiento de la población microbiana de termófilos………24
FIGURA 7. Comportamiento de la población microbiana de celulolíticos……….24
FIGURA 8. Comportamiento de la población de hongos y levaduras………...25
FIGURA 9. Comportamiento de la población de actinomicetos………..26
FIGURA 10. Comportamiento de pH………26
LISTA DE TABLAS TABLA 1. Análisis de varianza para azúcares reductores………...19
TABLA 2. Porcentaje de rendimiento de hidrólisis de holocelulosa en cada tratamiento………….. 22
ANEXO 1. Concentración de azúcares reductores obtenidos en los controles abióticos ANEXO 2. Cromatograma muestra 0 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4
ANEXO 3. Cromatograma muestra 5 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4 montaje en Erlenmeyer ANEXO 4. Cromatograma muestra control abiótico
ANEXO 5. Cromatograma muestra 5 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4 montaje en biorreactor
1. INTRODUCCIÓN
Colombia a nivel mundial es el segundo país que tiene la mayor exportación de flores luego de Holanda, 14% y 56%, respectivamente (Asocolflores, 2007). La magnitud de esta agroindustria ha provocado el desecho de una cantidad importante de residuos vegetales al ambiente, la técnica que se ha empleado en casi todos los cultivos para remediar este problema ha sido el compostaje. El compostaje de desechos orgánicos es un proceso bio-oxidativo que involucra la mineralización y la parcial humificación de la materia orgánica que luego será mineralizada y metabolizada por microorganismos produciendo CO2, NH3, H2O, ácidos orgánicos y energía expresada en calor (Bernal et al., 2008).
En la floricultura se llevan a cabo procesos de compostaje con el fin de darle un uso a los residuos vegetales generados por estas industrias; dada la complejidad de las estructuras de las moléculas que componen estos residuos, el proceso de compostaje es lento, por esto, se han buscado nuevas alternativas para producir abonos orgánicos de buena calidad en menor tiempo y a un bajo costo, una de ellas es la producción de inóculos bacterianos con actividades enzimáticas aceleradoras de la degradación del compostaje (Eslava y García, 2001).
El compost degradado mejora las condiciones fisicoquímicas del suelo y también aporta poblaciones microbianas que por medio de sus sistemas enzimáticos, degradan materia orgánica y la mineralizan de manera que se generan productos inorgánicos solubles, los cuales son aprovechados también por las plantas, mejorando la calidad de los cultivos.
En este proyecto se propuso determinar las concentraciones de inductores enzimáticos como el cobre y manganeso que conlleven a que Pleurotus ostreatus aumente la producción de azúcares reductores a partir de la degradación del residuo sólido vegetal de crisantemo y además evaluar el efecto que causa en el compostaje la aplicación de este residuo parcialmente degradado por
2. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La industria agrícola de flores, en Colombia, genera alrededor de 1,5 m3/ha-día o entre 0,8 y 1 m3/ha-semana de desechos vegetales (rosa, clavel o pompón), dependiendo del tipo de flor y el ciclo productivo. Los desechos se generan principalmente en las etapas de corte y labores culturales, poscosecha y arranque de plantas (Asocolflores, 2007).
Estos residuos están compuestos en su mayoría, por moléculas de celulosa, hemicelulosa y lignina que por su estructura química compleja son de lenta degradación; los hongos de podredumbre blanca, entre los que se encuentra Pleurotus ostreatus, poseen la maquinaria enzimática necesaria para degradar estas moléculas (Have y Teunnissen, 2001).
Por lo anterior y en busca de darle un mejor uso a los residuos de floricultura, se está realizando el proyecto “Degradación de residuos de floricultura para la obtención de azúcares con hongos lignocelulolíticos” donde se obtiene un extracto líquido que contiene azúcares, que se proponen usar como fuente de carbono para la producción de compuestos orgánicos como etanol, ácido, cítrico, succínico, entre otros. Adicionalmente al final del proceso de degradación, se obtiene un residuo sólido parcialmente degradado, el cual no ha sido estudiado y es importante destinarle un uso final.
En el proceso de degradación de residuos de flores se han estudiado diferentes concentraciones de inductores como los iones Cu2+ y Mn2+, debido a que pueden mejorar este proceso de degradación (Quevedo, 2008). Por lo tanto, en este trabajo se estudiaron algunas concentraciones de los inductores para obtener el residuo de crisantemo degradado por el hongo Pleurotus ostreatus. Este residuo degradado previamente, puede aumentar la disponibilidad de nutrientes para la microbiota, ya que P. ostreatus ha participado en la degradación de la lignina y la celulosa. Para la empresa productora de flores, Cultivos del Norte S.A; el proceso de compostaje implementado desde 1999, se ha convertido en una alternativa efectiva en el manejo de sus residuos sólidos vegetales. Así mismo, como ventaja competitiva en el sector floricultor, las empresas floricultoras aprovechan sus residuos a través de procesos de compostaje y/o lombricultura, reincorporándolos en el proceso productivo, como fuente de nutrientes y acondicionador de suelos recuperando la riqueza mineral y nutritiva que existe en ellos y consiguiendo adicionalmente el beneficio de mejorar su estructura, reduciendo los problemas de patógenos y costos en fertilizantes químicos (Granados et al., 2007).
Por esta razón, se busca comprobar si el residuo degradado de crisantemo por Pleurotus ostreatus
3. MARCO TEÓRICO Y REVISIÓN DE LITERATURA
3.1. Enzimas lignocelulolíticas
Para la hidrólisis completa de celulosa a glucosa, los sistemas de celulasas deben contener las siguientes enzimas: endoglucanasa (1,2-β-glucano glucanohidrolasa, EC 3.2.1.4), exoglucanasa (1,4-β-glucano celobiohidrolasa, EC 3.2.1.91) y β-glucosidasa (β-D-glucósido glucohidrolasa o celobiasa, EC 3.2.1.21). Solo el sinergismo de estas enzimas hace posible la hidrólisis de celulosa a glucosa (Wood y McRae, 1978; Wood y McRae, 1979; Wood, 1989). La lignina tiene enlaces covalentes (aril-eter, aril-aril y carbono-carbono) y por su hetereogeneidad, no puede ser degradada por mecanismos típicos de hidrolisis. Por lo tanto, cualquier enzima o grupo de enzimas capaces de atacar inicialmente lignina, deben ser extracelulares, no hidrolíticas y bastante inespecíficas (Dávila y Vázquez-Duhalt, 2001).
La degradación de la lignina da lugar a productos provenientes de la ruptura oxidativa de anillos aromáticos, ocasionada por la acción de enzimas como la lignino-peroxidasa (LiP); una oxigenasa dependiente de peróxido de hidrógeno (H2O2) que contiene un grupo prostético hemo. Su peso molecular se ha calculado en 41 y 42 kDa. La Mn peroxidasas son glicoproteínas que contienen un grupo prostético hemo (hierro-protoporfirina IX), al igual que la LiP. Su tamaño oscila entre 40 y 47
kDa, y su punto isoeléctrico se encuentra entre 3,0 y 4,0 (Lucas et al., 2001). La degradación de
lignina requiere ataques sobre ambos componentes de lignina fenólicos y no fenólicos, la MnP
extracelular oxida componentes de lignina fenólicos, pero ella no puede oxidar los sustratos de
lignina no fenólicos como el veratril alcohol (Glazer y Nikaido, 1998). La lacasa es una enzima fenol oxidasa que reduce el oxígeno molecular a agua, y a través de la utilización de ciertos compuestos redox puede ser capaz de ampliar su espectro de sustratos, logrando así la oxidación de porciones fenólicas de la lignina. Esta enzima es una glicoproteína extracelular que contiene átomos de cobre y se encuentra ampliamente distribuida en las plantas superiores, diversas clases de hongos y algunas bacterias.
3.2. Microorganismos degradadores de lignocelulosa
Entre los hongos de la podredumbre blanca se encuentran Trametes versicolor, Heterobasidion annosum, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus, Lentinula edodes, Phlebia radiata,
Pleurotus eryngii, Pleurotus betulinus, Pleurotus sajor-caju, Trametes hirsuta, Trametes gibosa
entre otros. Estos hongos utilizan como fuente de energía celulosa y/o hemicelulosa, dependiendo de la afinidad por el sustrato, lo que se visualiza por un crecimiento blanco (micelio vegetativo) durante la descomposición, de donde derivan su nombre. Tienen varios patrones de colonización de la madera, pero cuando están presentes en el lúmen de la célula ocasionan una degradación progresiva de las capas de la pared. Los hongos degradan la lignina para llegar hasta las fibras de celulosa y hemicelulosa, fuentes de carbono fácilmente asimilables para este grupo de organismos (Deacon, 1988).
3.2.1. Pleurotus ostreatus
Uno de los hongos de la podredumbre blanca es P. ostreatus que se destaca por tener las enzimas necesarias para transformar la lignina a dióxido de carbono y agua. Este hongo produce un amplio rango de enzimas extracelulares lignocelulolíticas, también denominadas enzimas fibrolíticas, incluyendo xilanasas, celulasas y lacasas, esta última, una enzima multicobre (Martinez et al.,
2009). Así mismo, existen algunos reportes que describen que la producción de enzimas lignocelulolíticas por P. ostreatus depende en gran parte de la cepa, la composición del sustrato y las condiciones de cultivo (Membrillo et al., 2008).
En los hongos basidiomicetos, las lacasas extracelulares son formadas en el metabolismo secundario y son producidas constitutivamente solo en pequeñas cantidades, por lo tanto es importante potenciar la capacidad productiva de lacasa de los microorganismos para aplicación industrial (Hou et al., 2004). Así mismo, es importante evaluar la actividad de enzimas hidrolíticas y oxidativas cultivadas en presencia de lignocelulosa ya que en las plantas lignificadas los sustratos celulosa, hemicelulosa y lignina estan ligados intra e intermolecularmente (Elisashvili et al., 2008).
3.3. Inductores enzimáticos
les conoce ningún papel biológico. Los metales pesados esenciales y no esenciales son tóxicos para los hongos, cuando están presentes en exceso. Los metales necesarios para el crecimiento fúngico incluyen cobre, hierro, manganeso, molibdeno, zinc y níquel. Los metales no esenciales comúnmente encontrados incluyen cromo, cadmio, plomo, mercurio y plata. Los iones metálicos están involucrados en la descomposición de celulosa y hemicelulosa por hongos de la pudrición café.
En los hongos de la pudrición blanca, el cobre y el manganeso participan directamente en el proceso de la degradación de la lignina, el manganeso participa en la reacción del ciclo de manganeso dependiente de peroxidasas, y el cobre sirve como un cofactor en el centro catalítico de la lacasa (Baldrian, 2003). Los metales también incrementan la solubilización y mineralización de la lignina, dos metales pesados están directamente involucrados en las reacciones catalizadas por las enzimas ligninolíticas. El manganeso está directamente involucrado en el ciclo catalítico del Mn-dependiente de peroxidasa y ha sido reportado que el Mn también juega un papel regulatorio en la expresión de LiP, MnP, y lacasa. Además la presencia de cobre en el centro catalítico de la enzima ha sido conocida por largo tiempo, pero del papel importante de la regulación del cobre en la producción de lacasa se conoce muy poco (Baldrian, 2003).
El sistema enzimático de degradación de la lignocelulosa es de vital importancia para la colonización del sustrato y la adquisición de carbono por hongos de podredumbre de la madera y hongos saprofíticos del suelo. Las enzimas de degradación de la lignina y las endohidrolasas de polisacáridos capacitan a los hongos para penetrar las paredes celulares de la madera del material vegetal, colonizarlo y usar los nutrientes disponibles presentes internamente. Los polisacáridos accequibles de la planta son entonces transformados por exocelulasas y hemicelulasas en mono y disacáridos directamente transportables a la célula fúngica y usados como fuentes de carbono y energía (Baldrian y Valásková; 2006).
3.4. Compostaje
Es un proceso de descomposición de la materia orgánica bajo condiciones aeróbicas y biológicas. La estabilización y destrucción de los patógenos de los desechos orgánicos ocurre durante el compostaje. Este proceso ha sido aceptado para el tratamiento de muchos tipos de desechos orgánicos industriales y agrícolas debido a las propiedades mencionadas (Ahn et al., 2009).
compostaje los microorganismos transforman la materia orgánica en CO2, biomasa, termoenergía (calor) y humus como producto final (Figura 1). Las fuentes de carbono fácilmente degradables y solubles, tales como monosacáridos, almidón y lípidos, son utilizadas por microorganismos en el estado temprano de compostaje. El pH disminuye por los ácidos orgánicos formados a partir de estos componentes durante la degradación. En la próxima fase los microorganismos degradan proteínas, dando lugar a la liberación de amonio y por consiguiente el incremento del pH. El proceso microbiológico de compostaje surge gracias a las actividades combinadas de una sucesión de poblaciones microbianas mezcladas. Durante la sucesión microbiana, cada tipo de microorganismo está adaptado a una condición específica de corta duración y es únicamente activo en descomponer un tipo, o grupo, de materia orgánica presente (Ball y Jackson, 1995).
Figura 1. Ciclo global del carbono (Tuomela et al., 2000)
3.4.1. Microorganismos
lo que produce un descenso en la temperatura y con esto la reaparición de bacterias mesófilas y actinomicetos.
3.4.1.1. Bacterias
Estos microorganismos unicelulares poseen un tamaño entre 0,5 y 3,0 μm lo que les confiere una relación superfice/volumen alta que permite la transferencia rápida de sustratos solubles a la célula. En el compostaje se han encontrado un amplio rango de bacterias, incluyendo especies de
Pseudomonas, Klebsiella, y Bacillus. Los actinomicetos son bacterias que forman filamentos multicelulares, similares a los hongos. Ellos pueden aparecer durante las fases termofílica, enfriamiento y maduración del compostaje, y son ocasionalmente tan numerosos que son visibles en la superficie del compost. Los actinomicetos son capaces de degradar celulosa y solubilizar lignina así como pueden tolerar temperaturas y valores de pH más altos que los hongos (Tuomela
et al., 2000).
3.4.1.2. Hongos
La mayoría de hongos presentes en el compost son hongos mesófilos los cuáles crecen entre 5°C y 37°C, con una temperatura óptima de 25°C y 30°C. Los hongos prefieren los ambientes ácidos, aunque el rango de tolerancia de pH es amplio con excepción de los Basidiomycota los cuáles no crecen en un pH mayor a 7,5 (Tuomela et al., 2000). Son los organismos predominantemente responsables de la degradación de la lignocelulosa y de este grupo, los degradadores más rápidos son los Basidiomycota (Sánchez, 2009).
3.5. Componentes de la materia orgánica en el compost
3.5.1. Lignocelulosa
La lignocelulosa está conformada por fracciones de lignina, celulosa y hemicelulosa y aunque pueden estar en diferentes concentraciones de acuerdo al material de la planta (Fernández et al.,
3.5.2. Celulosa
La celulosa es un polímero lineal que está compuesto de subunidades de D-glucosa unidas por enlaces β-1,4 glicosídicos y forma cadenas largas (o fibrillas elementales) unidas por puentes de hidrógeno y fuerzas de van de Waals (Sánchez, 2009). La celulosa es el mayor componente del material vegetal y la forma más abundante de material renovable en la biosfera, pero sus propiedades macromoleculares y características estructurales hacen los estudios de la biodegradación difíciles (Heon y Hong, 2001).
3.5.3. Hemicelulosa
La hemicelulosa es un polisacárido con un peso molecular más bajo que la celulosa. Está formada de xilosa, manosa, galactosa, glucosa, L-arabinosa y ácidos 4,0-metilglucurónico, D-galacturónico y D-glucurónico. Los azúcares están unidos por enlaces β-1,4 y algunas veces β-1, 3-glicosídicos. La hemicelulosa es la fracción más biodegradable de la lignocelulosa porque no adopta una estructura cristalina como la celulosa y su complejidad estructural no es tan alta como la lignina, además se biodegrada a azúcares monoméricos y ácido acético (Sánchez, 2009)
3.5.4. Lignina
La lignina proviene de tres alcoholes precursores: el alcohol p-hidroxicinamílico (cumarílico), el alcohol 4-hidroxi-3-metoxicinamílico (coniferílico) y el alcohol 3,5.dimetoxi-4-hidroxicinamílico (sinapílico). La copolimerización de radicales libres de estos alcoholes, iniciadas por peroxidasas vegetales, da lugar a este polímero (Dávila y Vázquez-Duhalt, 2001). Además está formada por una red de polímeros altamente resistentes a la degradación anaeróbica, por consiguiente, cuando la celulosa se encuentra incrustada en lignina, las enzimas celulolíticas tienen un difícil acceso a la celulosa, retardando o previniendo la hidrólisis, que convertirá a este polímero en azúcares (Fernández, et al 2009). Algunos basidiomicetes son los más eficientes degradadores en la naturaleza (Martínez et al., 2009).
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo General
4.2. Objetivos Específicos
Evaluar el resultado de la adición de inductores como CuSO4 y MnSO4 en el proceso de degradación del residuo de crisantemo por Pleurotus ostreatus.
Determinar el efecto en el comportamiento de la concentración de las poblaciones mesófilas, termofílicas y celulolíticas en el proceso de compostaje.
Evidenciar la calidad del compost de los dos procesos propuestos por medio de la relación carbono orgánico y nitrógeno total.
5. MATERIALES Y MÉTODOS
El presente trabajo se realizó en el laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana. El proyecto se enfocó en dos amplias temáticas, la primera fue estudiar el efecto de las concentraciones de CuSO4 y MnSO4 en la degradación del residuo sólido de crisantemo degradado por Pleurotus ostreatus en las cuales este produce la mayor cantidad de azúcares reductores; la otra temática fue encontrar el efecto que causaba este residuo en un proceso de compostaje en microcosmos.
5.1 Determinación de las mejores concentraciones de CuSO4 (mM) y MnSO4 (mM) para la degradación del residuo de crisantemo con tamaño de partícula < 1 mm.
El microorganismo que se utilizó fue Pleurotus ostreatus que pertenece al cepario del Laboratorio de Biotecnología Aplicada de la Pontificia Universidad Javeriana (PUJ) registrada bajo el número de referencia HPB/P3. Este hongo se reactivó por siembra en agar extracto de salvado a 30ºC por 8 días. La conservación se realizó a 4ºC en tubos eppendorf inoculados con discos de agar colonizados con biomasa fúngica en 1 mL de agua destilada estéril (Humber, 1997).
5.1.1. Análisis estadístico
5.1.2. Cultivo en el residuo vegetal
La producción de biomasa fúngica se llevó a cabo inoculando un disco de agar con Pleurotus ostreatus en una caja de agar salvado, incubando 7 días a 30°C. El proceso de degradación del residuo vegetal se realizó inoculando 30 discos de agar de 0.5 mm de diámetro con biomasa en Erlenmeyer de 100 mL que contenían 1 g de residuo en 20 ml de solución tampón de fosfato (5% (p/v)) a pH 6,0 ± 0,1 con los inductores a evaluar en la diferentes concentraciones según el diseño de superficie de respuesta realizado y se cultivó en condiciones de agitación a 200 rpm y 30oC durante 24 h. Los experimentos se realizaron por triplicado (Quevedo, 2008). Cada uno de los tratamientos que pertenecen al primer bloque tuvieron su respectivo control abiótico (sin P. ostreatus), estos contenían 1 g de residuo en 20 ml de solución tampón de fosfato pH 6,0 ± 0,5 y la determinada concentración de cobre y manganeso.
Al finalizar el cultivo, el residuo degradado se centrifugó a 8000 x g durante 20 minutos para separar el extracto crudo del residuo sólido. Al extracto líquido se le midió la concentración de azúcares reductores por medio de la técnica DNS (Miller, 1959) como una medida indirecta de la degradación del residuo sólido que se utilizó en el estudio del compostaje (Quevedo, 2008). Se realizó un último montaje en reactor de tanque agitado de 1,5 L con las mejores concentraciones de inductores de CuSO4 y MnSO4 encontradas.El montaje del reactor se realizó utilizando dos turbinas Rushton con una agitación de 230 rpm, con un VET del 29% y se inyectaron 2,4 vvm durante 24 h a 30°C.
Con el objetivo de observar el perfil de azúcares obtenidos, se realizó un análisis cromatográfico a las tratamientos con concentraciones de CuSO4 y MnSO4 de (0 mM y 0 mM en Erlenmeyer, 5 mM y 0 mM en Erlenmeyer y en biorreactor y a un control abiótico con concentraciones de 0 mM y 0 mM, en HPLC Shimadzu Prominence LC- 20AT con una columna Biorad Aminex HPX- 87P de 30 mm x 7,8 mm, con un detector de índice de refracción Shimadzu RID- 10A y una tasa de flujo de 0,4 ml/min a 84°C, como patrones se utilizaron: glucosa, xilosa, celobiosa, arabinosa, galactosa y manosa.
5.2. Montaje del proceso de compostaje en microcosmos
En 5 frascos de vidrio con capacidad para 5 L se vertieron 800 g de residuos vegetales de rosa y crisantemo con 160 ml de Microagro, un bioinoculante aplicado en el compostaje realizado en Cultivos del Norte S.A que contiene 4 especies de microorganismos: Burkholderia cepacia, Aeromonas hidrophyla (bacterias fosfato solubilizadoras), Cryptococcus laurentii (levadura) y
en Cultivos del Norte S.A a nivel de microcosmos. En otros 5 frascos de vidrio de 5 L se adicionaron 160 ml de Microagro, 560 g de residuos vegetales de rosa y crisantemo y 240 g de residuo vegetal degradado por Pleurotus ostreatus, cantidad correspondiente al 30% de la mezcla total (800 g) estos 5 montajes se denominaron microcosmos con Tratamiento.
Los 10 montajes de microcosmos se sometieron a temperaturas que simularan un proceso de compostaje completo con una duración de 84 días, por lo que se inició el ensayo a temperatura ambiente (20 ± 3°C) durante diez días, posteriormente los montajes fueron almacenados en una incubadora a una temperatura de 25 ± 2°C durante los siguientes diez días; a continuación se incrementó la temperatura de almacenamiento a 30 ± 2°C por otros diez días más, para luego subir la temperatura hasta 50 ± 2°C durante tres semanas, a este periodo de días se le denominó fase termofílica. Así mismo, el paso siguiente fue disminuir la temperatura gradualmente, almacenando los montajes de microcosmos a 30 ± 2°C durante diez días, luego a 25 ± 2°C durante el mismo tiempo y finalmente se incubaron a temperatura ambiente por diez días más. Durante el proceso se realizaron dos volteos semanales manualmente para mantener la aireación en los microcosmos a excepción del periodo termofílico donde los volteos se incrementaron a tres veces por semana.
5.2.1. Medición de pH
Para realizar la determinación de pH en cada uno de los 10 montajes de microcosmos se usó el método de pasta de saturación, que consiste en tomar 10 g de muestra y a continuación se le agregaron 90 ml de agua destilada, se mezcló esta suspensión y luego de 20 a 30 min se tomó el valor de pH sobre el extracto líquido superficial con un potenciómetro que se calibró con soluciones amortiguadoras de pH 7,0 y 4,0 (ICONTEC, 2004). El muestreo se realizó una vez por semana durante 12 semanas.
5.2.2. Comportamiento de la microbiota a lo largo del proceso de compostaje en microcosmos
del montaje del microcosmos, al inicio de la fase termofílica, al final de la fase termofílica y al final del proceso de compostaje en microcosmos, en los días 0, 30, 51 y 84. Los datos obtenidos se analizaron mediante ANOVA de un factor, donde la significancia se tomó como parámetro para determinar la existencia de diferencias significativas entre los tratamientos.
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Evaluación de la degradación del residuo con el uso de inductores
[image:21.612.117.543.380.516.2]La evaluación de la degradación del residuo de crisantemo se llevó a cabo evaluando los resultados de la concentración de azúcares reductores obtenidos después de los tratamientos respectivos, la obtención de azúcares reductores para todos los tratamientos así como el análisis estadístico ANOVA se muestran a continuación
Figura 2. Concentración de azúcares reductores obtenidos luego de la degradación del residuo de crisantemo por parte de P. ostreatus
Según los resultados ninguno de los efectos tienen los valores p< 0,05, indicando que no hay diferencia significativa entre los efectos con un nivel de confianza del 95%.Este valor p explica que ninguno de los tratamientos con las concentraciones de Cu2+ y Mn2+ establecidas por el diseño de respuesta en superficie, tiene efectos significativamente diferentes en la concentración azúcares reductores después del tratamiento con Pleurotus ostreatus. Es decir, según estos resultados la producción de azúcares reductores no aumenta significativamente por la adición o no de metales como el Cu2+ y Mn2+. El estadístico R cuadrado (23,35%) señala que los datos obtenidos no se ajustan al modelo propuesto, por lo cual tendrían que ampliarse las variables de estudio para incrementar el valor de este coeficiente de determinación.
Con el objetivo de confirmar que la producción de enzimas lignocelulolíticas de Pleurotus ostreatus
se realizaron controles abióticos de cada uno de los tratamientos (Anexo 1) donde el promedio de la concentración de azúcares reductores fue inferior (1,4 g·L-1), la presencia de azúcares en la muestra son producto del pretratamiento de corte y molienda del residuo de crisantemo, que alteraron la integridad de los tejidos vegetales permitiendo la desintegración de los polisacáridos presentes.
Aunque no se obtuvo diferencia significativa en la concentración de azúcares reductores de ninguno de los tratamientos, se realizó el montaje del tratamiento en biorreactor de tanque agitado con mayor concentración de azúcares reductores postratamiento, correspondiente al ensayo con concentraciones de 5 mM de CuSO4 y 0 mM MnSO4 (Figura 3).
Concentraciones de CuSO4 y MnSO4 (mM) T3 (Erlenmeyer) T6 (Erlenmeyer) T6 (Bioreactor)
P rom edi o de azúcar es reduct o re s ( g /L ) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
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[image:23.612.153.448.91.345.2]
Figura 3. Promedio de la concentración de azúcares reductores obtenidos con concentraciones de cobre y manganeso (0 mM CuSO4 y 0 mM MnSO4, 5 mM CuSO4 y 0 mM MnSO4 en Erlenmeyer y en biorreactor)
La figura 3 indica que la concentración de azúcares reductores para este tratamiento fue ligeramente mayor que la del montaje del mismo tratamiento en Erlenmeyer (15,79 g·L-1 y 14,84 g·L-1, respectivamente), con las mismas condiciones de cultivo; lo que concuerda con el análisis estadístico realizado para todos los montajes en Erlenmeyer, revelando que la agitación a 230 rpm y la inyección de oxígeno no aumentaron significativamente la producción de azúcares reductores a partir del residuo sólido por parte de Pleurotus ostreatus, contrario a lo que se esperaba, puesto que en el biorreactor había mayor inyección de oxígeno, y como se sabe, el oxígeno incrementa la tasa de la biodegradación de la lignina a través de la producción de peróxido de hidrógeno como oxidante extracelular y la subsecuente inducción de la actividad ligninolítica (Sanchez, 2009). Así mismo, Baldrian y colaboradores (2005) afirman la importancia de la disponiblidad de metales traza en el sustrato en la regulación de la actividad enzimática extracelular de P. ostreatus; con estos resultados es posible suponer la presencia de estos metales en el residuo de crisantemo, que al encontrarse disponibles en este sustrato, la adición o no de estos inductores en el ensayo no estimularon la actividad enzimática en este hongo, así como también es factible que se requieran concentraciones mayores de estos metales, para provocar dicha actividad.
estancamiento de residuo en las zonas alejadas de la turbina Rushton, razón por la cual fue necesario aumentar la agitación a 230 rpm, velocidad que pudo afectar de alguna manera el micelio del hongo por las fuerzas de corte (Xu et al., 2006) que probablemente no se reflejó en la concentración de azúcares reductores obtenidos, ya que no hubo diferencias significativas entre los resultados porque el aumento de la transferencia de oxígeno y disponibilidad del sustrato en la mezcla contrarrestaron este efecto de la turbina en el micelio. Con el objetivo de disminuir la relación tanque-diámetro del rodete, sería favorable la modificación del diseño de la turbina aumentando su diámetro por un rodete que recorra todo el volumen entero del recipiente como una turbina helicoidal, la cual mejoraría la mezcla en suspensiones viscosas, así como podría reducir el daño del micelio por efecto de cizalla.
Así mismo se caracterizó el residuo en su contenido de celulosa, hemicelulosa, lignina y humedad; análisis realizados por el laboratorio de nutrición animal de la Universidad Nacional de Colombia que encontró que el residuo sólido de crisantemo de partícula menor a 1mm contiene: 54,3% de celulosa, 10,6% hemicelulosa, 11,4% lignina y 9,4% de humedad.
[image:24.612.77.535.551.633.2]El promedio de la obtención de azúcares reductores de los tratamientos realizados en Erlenmeyer con concentraciones de 5 mM y 0 mM de CuSO4 y 0 mM y 0 mM de MnSO4 y en el biorreactor con concentraciones de 5 mM de CuSO4 y 0 mM de MnSO4, se relacionó con el porcentaje de rendimiento de la hidrólisis o como lo denominan Taniguchi y colaboradores (2005) el rendimiento neto de azúcares fermentables en relación al peso original de los componentes del residuo considerando la pérdida de peso durante el tratamiento con Pleurotus ostreatus, el cual como hongo de la podredumbre blanca posee dos tipos de sistema celular enzimático: el sistema hidrolítico, el cual produce hidrolasas que son responsables por la degradación de polisacáridos; y un sistema ligninolítico extracelular y oxidativo único; que degrada lignina y anillos fenil abiertos (Sánchez, 2009). Los datos de porcentaje de rendimiento de hidrólisis de Holocelulosa (celulosa+hemicelulosa) obtenidos se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. Porcentaje de rendimiento de hidrólisis de holocelulosa en cada tratamiento
CuSO4 (mM) MnSO4 (mM) Tratamiento Azúcares
reductores g/L
% Rendimiento de hidrólisis de Holocelulosa
0 0 Erlenmeyer 13,56 41,5
5 0 Erlenmeyer 14,84 45,1
5 0 Biorreactor 15,79 48,2
estimador de la degradación de la celulosa y la hemicelulosa en el residuo es mejor a estas concentraciones o cercana a ellas, este resultado concuerda con trabajos previos realizados por Taniguchi y colaboradores (2005) en los que P. ostreatus degradó el 30% de la lignina Klason y el 32% de la celulosa en residuos de cascarilla de arroz. De cuatro hongos evaluados; P. ostreatus
degradó con mayor velocidad la lignina (en 60 días en cultivo sólido) que el componente holocelulósico (carbohidratos). Como conclusión de este trabajo se sugirió reducir la lignina Klason al menos hasta el 15% del peso total del sustrato para aumentar el grado de solubilidad enzimática de las fracciones holocelulosa y celulosa. Por lo tanto, estas concentraciones de CuSO4 y de MnSO4 utilizadas en condiciones diferentes del proceso de degradación como pH y concentración del residuo, podrían permitir la obtención de una mayor concentración de azúcares reductores que sean diferentes estadísticamente.
[image:25.612.112.506.443.630.2]Finalmente, las cromatografías realizadas por HPLC de las muestras representativas (Anexo 2, 3, 4 y 5) evidencian la presencia de azúcares reductores como glucosa, celobiosa y manosa; lo que confirma la degradación de las fracciones de celulosa en glucosa y celobiosa y de las fracciones de hemicelulosa en manosa (Sanchez, 2009) del residuo de crisantemo por parte de P. ostreatus. En la figura 4 se muestra el perfil de azúcares obtenido por cromatografía HPLC para la muestra del extracto crudo después del proceso de degradación del residuo en biorreactor:
6.2. Comportamiento de la población microbiana durante el proceso de compostaje en microcosmos
Durante el proceso de compostaje los microorganismos presentes con capacidad degradadora de la materia orgánica se comportan de acuerdo a las condiciones ambientales que se presenten en la matriz, en este caso se trabajó con residuos de un cultivo de crisantemo y rosa, donde se evaluó el comportamiento de la población de microorganismos mesofíllicos, termofílicos, celulolíticos, actinomicetos, hongos y levaduras durante un proceso de compostaje, en esta investigación se esperaba que existiera alguna diferencia significativa entre la concentración microbiana de los microcosmos que tuvieran el residuo de crisantemo degradado por Pleurotus ostreatus y los que no tenían este residuo. Sin embargo, el análisis estadístico determinó que no existen diferencias significativas entre las poblaciones presentes en los dos diferentes tipos de microcosmos (Figuras 5, 6, 7, 8 y 9), a pesar de esto, se observó que en los microcosmos con residuo de crisantemo degradado existe una competencia entre los diferentes grupos de microorganismos por sustrato que se evidencia por la disminución de la población mesofílica y termofílica (Figura 5 y 6), este resultado está relacionado con la presencia de actinomicetos en el compost; Santos y colaboradores en el 2008, encontraron que la mayoría de microorganismos antagonistas presentes en un compost de horticultura pertenecían a estas bacterias filamentosas que son especialmente reconocidas por su capacidad de secretar sustancias antimicrobianas, dentro de las cuales se encuentran simaomicina, gentamicina, fumamicina, lipiarmicina, entre otras (El-Tarabily y Sivasithamparaman, 2006).
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mayor consumo de materia vegetal, ya que los microorganismos degradadores presentes en los microcosmos tendrán un área de superficie más grande sobre la cual actuar (EPA, 1996). A partir del brusco descenso que tuvo la población celulolítica al final de la fase termofílica en el día 51 se puede inferir que la población celulolítica afectada por el aumento de temperatura pertenece a hongos y levaduras ya que estos microorganismos se ven limitados por temperaturas superiores a 35°C (Pek y Obek, 2002). La población sobreviviente a estas condiciones pueden pertenecer a microorganismos termofílicos dentro de los cuales pueden estar los actinomicetos que pueden desarrollarse a temperaturas superiores de 50°C (El-Tovabily y Sivasithamparam, 2006).
Figura 9. Comportamiento de la población de actinomicetos
6.3. Relación Carbono orgánico/ Nitrógeno total
[image:31.612.81.536.285.462.2]Entre las variables existentes para evaluar la calidad inicial y final del compost se encuentran parámetros físicos, químicos y biológicos que permitan obtener al final del proceso, un producto con aspecto y color aceptables; higienización correcta; impurezas y contaminantes a nivel de trazas; nivel conocido de componentes agronómicamente útiles; y características homogéneas y uniformes, además de poder ser almacenado sin experimentar alteraciones (Moreno y Moral., 2007). Como indicador de madurez y estabilidad del proceso de compostaje en microcosmos se realizaron análisis de carbono y nitrógeno en el material de partida como en el producto final, los resultados se muestran a continuación en la tabla 3.
Tabla 3. Carbono orgánico y Nitrógeno total del material de partida, producto final y control positivo
CO inicial N total inicial C/N CO final N total final C/N
Residuos de flores sin
residuo degradado 24,0 1,9 12,6 24,9 1,6 15,2
Residuos de flores con
residuo degradado 25,7 1,9 13,5 29,2 1,8 16,2
Control positivo 24,0 1,9 12,9 9,5 1,4 6,8
Para un correcto compostaje en el que se aproveche y retenga la mayor parte del C y del N, la relación C/N del material de partida usualmente está cerca de 30 (Zhu, 2007), sin embargo, los análisis realizados para cada una de las muestras iniciales; dieron relaciones C/N de 13,5 para microcosmos con residuo degradado y 12,91 para microcosmos sin residuo degradado, relaciones muy bajas para un compostaje en estado inicial, por lo que se cree que la materia prima, residuos de crisantemo y rosa del cultivo de flores, ya habían iniciado un proceso de degradación antes de que se incorporara a los microcosmos ya que estos valores están más cercanos a los encontrados al final de un proceso de compostaje que están alrededor de 10 (Shilev et al.,2007).
vegetal hasta CO2 (Garzillo et al., 1994). Por otro lado, durante el proceso de compostaje se observó la producción de olores fuertes tanto en los tratamientos con residuo como sin residuo, estos olores usualmente son provocados por la generación de compuestos orgánicos volátiles (COV) y amoniacales. Ambos tipos de compuestos pueden ser productos del metabolismo microbiano y son indicios de actividad microbiana anaerobia, que es indeseable en el compostaje y que es consecuencia de fallos de operación o de preparación del material original.
La relación C/N final para los microcosmos con residuo degradado y sin él, fue mayor que la del material de partida de cada uno, esto indica que en los microcosmos después de 84 días de proceso, la mineralización de la materia orgánica no ha sido llevada a cabo con eficiencia ya que se espera que la respiración metabólica disminuyera la concentración de C inicial a través del tiempo; además se presentaron pérdidas de N por volatilización, como lo indican los malos olores provenientes de la actividad metabólica anaerobia. No obstante, dado que la relación C/N para el residuo de flores con residuo y sin él, es prácticamente la misma, es posible sugerir que la adición de este residuo degradado al residuo de flores no afecta esta relación en el compost.
Respecto al control positivo, se evidencian fallas de operación en los microcosmos, principalmente en la aireación del compost, ya que comparado con la relación C/N (6,4:1) del compost control positivo la cual es una relación cercana a la ideal y el cuál estaba instalado en pilas bajo circunstancias naturales con mayor superficie de contacto, aireación y temperatura que favorecen el calentamiento de la pila y por ende la actividad metabólica, se puede inferir que el montaje del ensayo en microcosmos bajo las condiciones de estudio no permiten simular el proceso de compostaje para este estudio.
7. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
La degradación del residuo de Crisantemo por Pleurotus ostreatus expresada en concentración de azúcares reductores, indica que para las condiciones dadas de pH y concentración de sales de Cu [0-5 mM] y Mn [0-5 mM], no existe una diferencia significativa de producción de azúcares reductores entre tratamientos. Sin embargo se recomienda realizar otro estudio con concentraciones más altas de estos metales.
La concentración de azúcares reductores obtenida en el montaje en Erlenmeyer es similar a la obtenida en el biorreactor lo que permite concluir que al aumentar el volumen efectivo de trabajo aproximadamente 22 veces, no se afecta ni positiva ni negativamente la producción de azúcares reductores. Sin embargo, se recomienda para el montaje en biorreactor modificar la geometría del sistema o el diseño de la turbina y la transferencia de oxígeno con otro sistema.
La adición del residuo de crisantemo degradado por Pleurotus ostreatus no afecta de manera negativa el proceso de compostaje, no hubo diferencias significativas entre los tratamientos que tenían el residuo degradado y los tratamientos que no. En los ensayos con microcosmos se aconseja mantener una oxigenación constante, ya que por los olores generados se presume que la aireación fue incompleta.
La relación C/N entre los microcosmos con residuo degradado y sin este, indica que el residuo sólido degradado se puede mezclar con residuos de flores sin afectar el compost.
Los montajes de microcosmos bajo las condiciones estudiadas no representan el proceso de compostaje de los residuos utilizados en esta investigación.
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ANEXOS
Anexo 1. Concentración de azúcares reductores en controles abióticos
Controles abióticos
T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9
Az úc a res Re du c to re s ( g /L) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Anexo 2. Cromatograma muestra 0 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4
Anexo 3. Cromatograma muestra 5 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4
Anexo 4. Cromatograma control abiótico
Anexo 5. Cromatograma biorreactor 5 mM CuSO4 – 0 mM MnSO4
