Inicio de una colección de cepas puras de

k m b r e : Garcia Garcia Verónica Matrícula: 88228 166

d c e n c i a t u r a : Biología (Iztapalapa, C.

-

B . S . ) Teléfono: 8572957

Trimestre lectivo: 96-P Horas a la semana: 20 horas

&tulo del trabajo:

_I

Inlcio de una colección de cepas puras de hongos fitopatógenos en el cultivo de clavel (Dianthus caryophdius L.).

Nombre del asesor interno: Biol. Sara Lucía Camargo Ricalde, miembro del personal académico

de la UAMI con número de adscripción 18358.

Nombre del asesor externo: Biol. David Bonilla López, miembro del personal del laboratorio de hongos y bacterias de la Secretaría de Agricultura, Ganadería y Desarrollo Rural (SAGAR). Con

número de adscripción 0703 1 I .

Lugar donde se realizó el servicio: Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario de la Dirección General de Sanidad Vegetal de la Secretaría de Agric'ultura, Ganadería y Desarrollo Rural (SAGAR).

Fecha de inicio: 10 de Noviembre de 1995 Fecha de terminación: 10 de Mayo de 1996 Clave: B. 03 I . 95

Nombre del Proyecto: Inicio de una colección de cepas puras de hongos fitopatógenos en el' cultivo de clavel (Dianthus cnrvophvlltrs L.).

4

n

///

.

argo KC

-Asesodhterno

v

Verónia Garcia Garcia alumna

4

G Y P c ; l & '

Inicio de una colección de cepas puras de

hongos

fitopatógenos en el

clavel pianthus caryophgllus

. i

cultivo de

AGRADEZCO PROFUNDAMENTE

A

MIS

ASESORES

LA

AYUDA

QUE

M E

BRINDARON

PARA

FINALIZAR

ESTE TRABAJO.

BIOL.

S A R A

LUCIA

CAMARGO

RICALDE

. .

INDICE

I

.

RES.N

...

1

I1

.

.ODUCCION

...

2

HI

.

OaTETIVOS GENERALES Y ESPECIFICOS

...

5

IV

.

METODOLOGIA

.ILIZADA

...

6

v

.

ACTIVIDADES

REALIZADAS

...

13

VI

.

OBJETIVOS Y METAS ALCAN.OS

...

14

VII

.

REsuL+Dos

...

15

VIII

.

DISCUgION

...

36

IX

..

.

CONCLUSION

...

39

X.’~€~COMENDACIONES

...

41

I.

RESUMEN

El cultivo del clavel (Dianthus cqoDhyllus L.), es muy importante económica y

socialmente en la República Mexicana; sin embargo, en los últimos años ha sido severamente atacado por numerosas enfermedades, entre las cuales las causadas por

hongos sobresalen por el dafío que ocasionan a la planta y, por lo tanto, a la

produccibn.

En San Luis Tlaxialtemalco y demh pueblos productores de clavel en

Xochimilco, D.F., la

causa

frecuente de

las

p6rdiclas registradas en este cultivo se deben hdamentalmente a agentes de origen fimgoso.

Considerando la importancia de estas enfermedades se decidió llevar a cabo un estudio que incluyera el aislamiento, purificación e identificación de los principales agentes causales y de esta manera contar con cepas puras y preparaciones fijas de los

principales hongos considerados de importancia económica en el cultivo del clavel.

Para la identqficaci6n se hicieron colectas de plantas, aislamientos y observaciones tanto macroscbpicas como microscópicas de

l a s

hctifícaciones producidas por

los

organismos aislados. Para

el

aislamiento de los pat6genos se emplearon

tres

diferentes

medios

de cultivo: Papa-Dextrosa-Agar, Agua-Agar y Jugo de Verduras VS-Agar.

En

el

primer medio

se

registró el mejor desarrollo y

rqroducci6n de

una

mayor

variedad de

hongos.

8”

Se registraron seis organismos, cuatro considerados de importancia econbmica

en el cultivo de clavel: Fusarium oxvs~orum, Botrvtis cinerea, Alternaría sp. y Rhizoctonia

solani,

y dos que no son descritos de importancia económica, pero que si

han

sido

aislados de este cultivo: C1adosDoriu.m sp. y StemPhvfium sp., cabe

mencionar que no se observ6

ningún

daÍ50 causado por estos dos patbgenos en las

plahtas donde heron aislados.

Con base en el número de plantas enfermas colectadas, aislamientos obtenidos y

análisis estadístico se determinó que

F

W

es

el

patbgeno de mayor

1

incidencia en esta localidad seguido de Alternaria sp., Rhizoctonia solani, Botr_vtis

cinerea, CladosDorium sp. y StemDhvllium sp.

11.

INTRODUCCION

El clavel, Dianthus caryophyllus L., es una planta ornamental de origen mediterráneo que por su fácil propagación vegetativa constituye una especie de particular importancia dentro de la floricultura ornamental. La producción de clavel en nustro país se realiza en un 93% a la intemperie, y 7% se efectila bajo condiciones de invernadero. La superficie promedio para la producción de clavel es de 650 hectáreas a la intemperie y 30-50 hectáreas bajo cubierta para una producción total de 1, 487, 188 gruesas de flor cortada anualmente, teniendo como principal productor al Estado de México con una superficie cultivada de 450 hectáreas y con una producción promedio de 956,050 gruesas de flor c.crtada al año lo que equivale a 95, 605, O00 flores (IMCE, 1981 en: Navarro, 1985).

Como se mencionó, el principal productor nacional es el Estado de México, particularmente en los municipios de Coatepec de Harinas, Villa Guerrero y Tenancingo; en estas regiones la superficie que se dedica al cultivo de clavel ocupa una gran cantidad de mano de obra, estimándose que el 90% de la población (aproximadamente más de 800 familias ) depende económicamente de este cultivo (Ortega, 1976). Se cultiva también en Puebla, Michoacán y otros estados del país. En Monterrey, N. L., es la especie de mayor u a t a , seguida del crisantemo y la rosa (López, 1987).

Aproximadamente el 90% de la producción del Estado de México, surte a los principales mercados del país: Distrito Federal (Central de Abastos), Guadalajara, Monterrey y Acapulco, y se exporta al extranjero del 60 al 70% de la producción en invernadero (IMCE, 198 1 en: Navarro, 1985). A partir de 1976 se comenzó a exportar a E. U. A. (Nuñez, 1978).

En este lugar se dedican alrededor de 89 hectáreas a producir plantas ornamentales destinadas a ser vendidas en maceta, en cepellón o chapín (pequefio cubo de tierra), en mercados locales principalmente (Lamas, 1978).

Este centro hortícola sufre la incidencia de variados problemas de origen fitopatológico debidos principalmente a la existencia de canales y chinampas que favorecen la incidencia de los patógenos y en especial de los hongos, representando un grave problema para los floricultores del lugar dado que son, en general, de escasos recursos económicos y sobre todo al desconocimiento por la mayoría de ellos (los horticultores locales), de las técnicas de prevención y control de enfermedades (Lamas, 1978).

Las enfermedades fungales que sobresalen por el daíio que ocasionan en este centro hortícola son:

1) Fusariosis provocado por el hongo Fusarium oxysponm, f. sp. dianthi (Prill. & Del.) Snyder & Hansen, que produce el secamiento de la planta.

2) Altemariosis provocado por el hongo Alternaria dianthi Steu & Hall , cuyos síntomas son manchas en tallos y hojas.

3) Roya o chahuixtle provocado por el hongo Uromyces cawophyllinus (Schrank) Wint., que rompe la epidennis de tallos y

hojas por la acumulación de esporas.

4) Heterosporiosis provocado por el hongo Hetero-Torium echinulatum (Berk) Cke., las hojas y tallos afectados se rompen fácilmente en los puntos de infección.

5) Mancha foliar provocado por el hongo Septoria dianthi Desln.

6) Tizón provocado por el hongo Botritvs cinerea Pers. ex Fr.,que provoca manchas en los pétalos de las flores perdiendo de esta manera todo su valor comercial.

7) Pudrición del tallo por Rhizoctonia solani Kuehn., es otro hongo que puede podrir el tallo del clavel.

E

111.

OBJETIVO

GENERAL

Iniciar una colección de cepas puras de hongos fitopatógenos que afecten al cdtivo de clavel (Dianthus carvoDhvhs L.).

111.1

OBJETIVOS

ESPECIFICOS

tniciar la colecci6n de cepas puras de hongos fitopatógenos que afecten al

cultivo de clavel.

Muestrear e identificar signos y síntomas de daflo provocados

por

hongos fitopatógenos

en

las S partes vegetativas de la planta bajo'

condiciones de el pueblo de San Luis Tlaxialtemalco de la

Delegación

Xochimilco,

D.

F.

Aislar los patógenos en los medios de cultivo específicos para el buen-

desarrollo y reproducción de &os.

.I

Describir e identificar

los

principales hongos fitopatógenos.

IV.

METODOLOGIA

UTILIZADA

El trabajo consistió de las siguientes etapas:

IV.l Muestreo y colecta del material enfermo

Se hicieron visitas a los invernaderos de San Luis Tlaxialtemalco de la

Delegación Xochimilco, D. F., con la finalidad de ubicar floricultores que se encontraran trabajando con clavel. Una vez establecidos los sitios, se llevó a cabo el muestreo y colecta del material enfermo.

8

Muestreo

Se realizaron tres muestreos a intervalos de un mes de noviembre a enero

en los invernaderos de San Luis Tlaxialtemalco de la Delegación Xochimilco,

D. F.

El muestreo se realizó de una manera

dirigida

colectándose el mayor número de muestras (planta completa) con síntomas aparentemente causados

por hongos. :

Los

síntomas buscados heron marchitamiento, pudricibn en tallo, manchas en hojas, chliz y

was.

De los t q s _{invernaderos muestreados se obtuvieron}

un

total de 45

plantas completas.

La colecta del material se llevó a cabo con el equipo necesario que

incluyó: navaja de campo, tijeras de podar, lupa de campo, marcadores, bolsas ‘.,de plhtico de capacidad variable, papel periódico y etiquetas.

t

El material colectado se transportó al laboratorio de hongos y bacterias

del Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario (CNRDF) de la Dirección General de Sanidad Vegetal de la Secretaria de Agricultura

Ganadería y Desarrollo

Rural

(SAGAR) para ser analizado.

IV.2 Método de análisis y diagnóstico de muestras

IV.2.1 Elaboración de medios de cultivo

Para llevar a cabo el aislamiento de los patógenos se elaboraron medios de cultivo: papa-dextrosa-agar OJDA), agua-agar

(AA)

y jugo de verduras-agar

(JVS). En las muestras colectadas del invernadero No. 1 se decidió utilizar el

medio de cultivo papa-dextrosa-agar dado que reúne las característica requeridas para el desarrollo y crecimiento de una gran _{variedad de hongos,}

para las muestras de la segunda colecta ademh de PDA se empleo AA y JV8

(SAGAR, corn. per.), dado que se necesitaban medios más específicos para ver

si de esta manera se podían obtener las colonias de los hongos buscados. Para

las plantas obtenidas en el último muestre0 además del medio de cultivo PDA

se utilizó el medio de cultivo

AA

(Lbpez, 1984) (Anexo).

IV.2.2 Observación de signos y síntomas

Se describió detalladamente la sintomatología que presentaba cada uno de los órganos de la planta (raíz, tallo, _hoja y flor). Esta í h e h e muy importante debido a que la sintomatología que caracteriza a cada enfermedad-

proporcionó una base importante para su diagnbstico mediante la comparación de las observaciones, la literatura y los resultados.

Con

ayuda del microscopio estereoscbpico se examinó detenidathente la

superfície Wada a

fin

de observar posibles signos de los patógenos presentes

y en cuyo caso se procedió a realizar cortes y el montaje directo del mismo.

IV.2.3 Preparación y desinfección del material biológico '.

i

De las 45 plantas colectadas en los diferentes muestreos se realizaron

preparaciones de cada uno de los diferentes órganos de la planta para obtener cuatro muestras por cada planta.

Con una navaja se cortaron pequeños cuadritos de material de

aproximadamente 1 cm2 de la ZOM de transición entre tejido sano y edermo de los diferentes órganos de la planta (raíz, tallo, hoja, flor) y se colocaron dentro de un vaso de precipitados de 100 ml con una solución de hpoclorito de sodio- (NaClO) al 1% (Espinoza, 1973).

En

el caso del material obtenido de la raíz se lavó anteriormente con

agua corriente para eliminar la materia orgánica y evitar que el hipoclorito de

sodio se inactive. Se dejaron reposar los tejidos en el hipoclorito de sodio

durante un minuto, posteriormente se enjuagaron tres veces con agua

esterilizada.

Al

término de este procehento se transfineron a cámaras húmedas (caja Petri con papel filtro esterilizado) y se agitaron para retirar los residuos de humedad.

De las 45 plantas completas colectadas se obtuvieron cuatro muestras-

por cada planta de flor, tallo, hoja y

raíz.

IV.2.4 Siembra del material biológico

La desinfección y siembra de los tejidos se

hizo

bajo condiciones

estkriles (cerca de un mechero de gas y dentro de una campana de

transferencia).

Para la siembra se hicieron transferencias del material contenido en

cámara húmeda a cajas Petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar, agua- agar y

Jugo

V8-agar de tres a cuatro secciones de tejido, separadas una de la otra y utilizando pinzas de punta fina, las cuales se esterilizaron previamente (se sumergían en alcohol al 80% y se flameaban), este procedimiento se repitió

para cada

uno

de

los

diferentes órganos (raíz, tallo, hoja y flor) (Lbpez, 1984).

Posteriormente se selló cada

una

de

las

cajas con hule parafilm para evitar y a -

posible contaminación y se marcaron las cajas para su identificación postenor colocando fecha de siembra, tipo de tejido, y un número clave para llevar

m

control, estos

mismos

datos se marcaron en la cámara húmeda que contenía el

resto del material (L6pez, 1984).

IV.2.5 Condiciones de incubacihn

El material sembrado en los diferentes medios de cultivo

se

introdujo en

una incubadora a

una

temperatura óptima favorable (28"C), bajo estas

condiciones la mayoría de los hongos fitopatógenos esporularon en 4 -5 días, lo

que permitid hacer preparaciones para observar las estructuras reproductivas.

A las cámaras húmedas que contenían el material restante de cada uno de

los diferentes tejidos de la planta, se le agregó un mdilitro de agua estéril para mantenerla húmeda y propiciar el desarrollo de los posibles patógenos,

posterionnente se colocaron las cajas en un recipiente y se mantuvieron a

temperatura ambiente (18-20

OC).

IV.2.6 Observación en el microscopio estereoscópico

Se observaron las colonias que se desarrollaron en cada una de las cajas

y se describieron las características

más

sobresalientes: color, forma de- crecimiento, presencia de estructuras reproductivas, así mismo se seleccionó el

área para efectuar posteriomente las preparaciones y proceder a su

identificación.

IV.2.7 Montaje

de muestras semipermanentes

Se colocd una gota de azul de lactofenol en

un

portaobjetos y se cortó

una tira de

cinta

adhesiva de tamaÍio

tal

que rebasara ligeramente la loqgitud

del portaobjetos, se tomó la tira de la cinta adhesiva por los extremos y s e pasó

ligeramente por la superficie de la colonia en desarrollo' ' previarhente

seleccionada (

en

caso de ser un montaje directo se pasó ligeramente sobre la

superficie de la parte lesionada de la planta)

a

fin

de que se adhirieran las

estructuras que se pretendían montar.

\

Posteriormente, se colocó la tira de cinta a lo largo del portaobjetos, de tal manera que las estructuras adheridas, quedaran colocadas donde se

encontraba la gota

de

lactofenol y se procedió a observar al microscopio

compuesto para llevar a

cabo

su identificación (López, 1984).

IV.2.8 Identificación de los patógenos

Para la identificación de los géneros y especies de hongos se utilizaron claves, monografias elaboradas, síntomas particulares observados en las

plantas, crecimiento y forma de los hongos en el laboratorio y comparación con

descripciones hechas por

varios

autores, entre ellos deben sefialarse a Barnett

y Hunter (1972), Ellis (1971), Ulloa y

Hanlin

(1978), Espinoza (1973) y

G o d e z (1

987).

IV.2.9 Montaje de muestras permanentes

Una vez concluida la identificación, se realizaron montajes permanentes, para llevar a cabo este procedimiento se pasó una aguja de disección

superficialmente sobre la cepa en desarrollo para que se adhirieran a ella las

estructuras del hongo y se colocaron en

un

portaobjetos, el cual contenía una

gota de azul de lactofenol, posteriormente se colocó un cubreobjetos y se

procedió a observar al microscopio compuesto para verificar si las estructuras- del hongo se veían claramente, de lo contrario se repetia nuevamente el

procedimiento hasta que se observaran claramente las estructuras de los

hongos.

Finalmente, se selló la preparación utilizando esmalte. de d a s transparente a íin de conservar la preparación en buen estado @ópez, 1984).

W.2.10 Transferencia

de

los patbgenos.

?

Se introdujo un microscopio estereoscópico dentro de la cámara de

transferencia y se observaron las cajas con las cepas en desarrollo seleccionando las estructuras reproductivas del patógeno identifícado,

posteriormente con una aguja de punta h a previamente flameada se pasó superficialmente sobre la colonia donde se encontraban estas estructuras a

fin

de que se adhirieran y se transfirieron a otra caja Petri con medio de cultivo-

Debido a que las colonias que se obtenían se contaminaban con bacterias fue necesario elaborar nuevamente medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar y agregarle estreptomicina, de esta manera fue más fácil obtener alscepas puras de Alternaria sp.,

Fusarium

ox~s~orum, Botritvs cinerea y Rhizoctonia solani (CNRDF, com. pers.).

IV.2.11 Mantenimiento de la colecci6n

Una vez que las cepas de hongos se identificaron y purificaron, se

transfirieron a tubos de ensayo con medio de cultivo PDA y se les agregó aceite mineral esterilizado y se sellaron bien los tubos de ensayo a

fin

de tener cepas puras permanentes, las cuales se mantienen en obscuridad a 2OoC, dado que bajo estas condiciones los aislamientos pueden sobrevivir por

un

largo período de tiempo ( aproximadamente 6 meses) en forma satisfactoria P p e z , 1984).

Las cepas puras permanecerán en el laboratorio de Hongos y Bacterias’ del Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario de la SAGAR

bajo el cuidado. del personal que labora

en

este laboratorio.

IV.3 Anhlisis

estadistico

Se aplico

un

anidisis

de

varianza

(Daniel, 1982) para:

1) Determinar si existia diferencia signtficativa entre el número de colonias desarrolladas por los patógenos identificados en los diferentes órganos de la

.planta (tallo, flor, hoja y raíz).

2)

Determinar si existia diferencia sigruficativa en cuanto a l mejor desarrollo y reproducción de los patógenos

en

los

tres medios de cultivo empleados (PDA,.

AA

y JV8). Para llevar a cabo este análisis se utilizaron úricamente los datos obtenidos del muestreo No. 2 y 3, dado que en el primer muestreo sólo se empleo

un

medio de cultivo.

Tabla de ANDEVA para el diseño completamente aleatorio.

Fuente de

variación “entre” tratamientos “dentro” tratamientos error residual O Total Donde:

Grados de

I

Suma de cuadrados

1

N

...

~amafio total de las muestras.

n

...

tamaño de cada una de las muestra.

K

...

número de poblaciones distintas.

qj

...

i-ésima observación recibiendo el j-ésimo tratamiento,

1 i = l , 2

,...,

n j : j = l , 2

,...,

K. I

X,j

...

suma del j-ésimo tratamiento (j-ésima columna)

I= 1

X..

...

media del j-ésimo tratamiento nj > .

\.

X.

...

suma de todas las observaciones

%

&

&=

Todas las medias de las poblaciones

son

iguales

H A =

Las medias de las poblaciones

son

diferentes

Fte6rica

Fte6rica =

F1- a , N-I,

N-K

Si Fmk

<

FM-

se acepta

Hoy

se rechaza

H A

V. ACTIVIDADES REALIZADAS

El presente trabajo tuvo una duración de 6 meses, del 10 de noviembre

de 1995 al 10 de mayo de 1996 (1 30 días hábiles), durante los cuales se- reakaron las siguientes actividades:

1 .-Elaboración del proyecto inicial.

2.-Reconocimiento del material de laboratorio y metodología de trabajo.

3. -Desarrollo del proyecto:

ACTIVIDADES DE

CAMPO

3.1 Visitas a los invernaderos de San Luis Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F.

3.2 Localización y ubicación de los productores dedicados al cultivo de clavel.

3.3 Entrevistas con los productores de clavel. 3.4 Muestre0 y colecta del material enfermo.

ACTIVIDADES DE LABORATORIO . .

3.5 Esterilización del material de laboratorio y elaboración de’ medios de-

cultivo.

3.6 Observación de signos y sintom& presentes en el material colectado.

3.7 Preparación y desinfección del material enfermo.

3.8 Siembra del material biológico.

3.9 Revisión de cajas con medio de cultivo y cámara húmeda.

3.10 Montaje de muestras semipermanentes.

3.1 1 Caracterización e identificación de los principales

hongos

encontrados.

3.12 Montaje de muestras permanentes.

,3.13 Transferencia de los patógenos buscados.

3.14 Obtención y mantenimiento de cepas puras.

ACTIVIDADES DE GABINETE

3.15 Análisis estadístico.

3.16 Revisión bibliográfica.

3.17 Recopilacih de información.

3.18 Elaboración del proyecto final.

VI.OBJETIVOS Y METAS ALCANZADOS

Se lograron aislar, purificar e identificar cuatro hongos considerados de importancia económica en el cultivo del clavel (Dianthus caryophyllus L.): Fusarium oxysponm, Alternaria sp., Rhizoctonia solani y Botrytis cinerea.

Se determinó que la sintomatología presente en las plantas proporciona una base importante para su diagnóstico, dado que en muchas ocasiones cada enfermedad se manifiesta por una serie de síntomas diferentes a los desarrollados por otra.

Se conocieron los principales problemas a los que se enfrentan los productores de clavel en San Luis Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F. Estos problemas son los de origen filngoso.

Con base en el nimero de hongos y su incidencia, recomendar algunas medidas preventivas de control que deberán seguirse para mejorar la sanidad y calidad del cultivo de clavel.

Mediante la obtención de cepas puras y preparaciones fijas, facilitar la identificación de los principales hongos fitopatógenos en el cultivo del clavel

VII. RESULTADOS

VII. 1 Identificación de los principales hongos fitopatógenos de importancia económica en el cultivo de clavel,

En total se revisaron 180 muestras, 1 12 en medio de cultivo PDA, 48 en medio de cultivo

A A

y 20 en medio de cultivo JV8.

De las muestras colectadas en el primer y segundo muestre0 en los invernaderos de San Luis Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F., se obtuvieron colonias de Alternaria sp. y Fusarium oxyspomm (Tablas No. 1 y No. 2). En el idtimo muestreo se obtuvieron colonias de Alternaria sp., Fusarium oxysponlm, Rhizoctonia solani y Botrytis cinerea (Tabla No. 3) considerados de importancia económica en el cultivo del clavel.

Es importante seíialar que en las plantas del segundo y tercer muestreo, además del aislamiento de los hongos arriba descritos, se obtuvieron colonias de Stemphyllium sp y Cladosporium sp. que también pueden atacar al clavel pero no han sido reportados como agentes causales de graves daíios al mismo.

Las colonias de Alternaria sp. en medio de cultivo PDA fonnaron un micelio de color obscuro en el centro y blanco en sus alrededores de rápido y amplio desarrollo (fig 1). En medio de cultivo AA y JV8 el aspecto de la colonia era similar. En observaciones al microscopio óptico se registró la presencia de conidios grandes en f o r m de pera los cuales presentaban septos tanto transversales como longitudinales (fig.2),

Los aislamientos de Fusarium oxysponm en medio de cultivo PDA presentaron un crecimiento lento y una coloración al principio blanca con sectores violeta, posteriormente se torna completamente de color violeta con pequeíios puntos blancos (fig. 3). En medio de cultivo AA y JV8 el crecimiento y color de la colonia file similar, solamente que el color violeta era menos intenso. Al microscopio óptico se pudo observar la presencia de macroconidios delgados, microconidios más o menos ovales y

clamidosporas (fig. 4 y 5).

El micelio de las colonias de Botritys cinerea en medio de cultivo PDA presentaron un amplio crecimiento y aspecto algodonoso. A partir del sexto día de ser transferido en este medio empezó a formar esclerocios de forma irregular y de color café obscuro (fig. 6). En observaciones al microscopio óptico se logró apreciar que las fructificaciones de este patógeno estaban formadas por varios conidióforos largos y

ramificados que presentan células apicales redondas las cuales portan racimos de conidios ovoides, unicelulares (fig. 7).

Las colonias de Rhizoctonia solani en medio de cultivo PDA presentaron un micelio de color café claro, de amplio desarrollo (fig. S).

A

partir del octavo día de ser aislado hubo formación de esclerocios obscuros. En observaciones al microscopio óptico se logró apreciar que el micelio estaba formado por hifas ramificadas en ángulo recto (fig. 9).

Las colonias de Cladosporium sp. en medio de cultivo PDA formaron un micelio de color verde obscuro, este color fue característico para diferenciarlo de las demás colonias formadas por los otros patógenos. El crecimiento miceliar era relativamente lento. Al microscopio óptico se observaron conidióforos en fonna de tallo obscuros y

ramificados cerca de su ápice, los conidios también eran obscuros y de forma variable en cuanto a su tamaíio y forma.

Las colonias de Stemphyllium sp. en medio de cultivo PDA formaron un micelio café claro y de amplio desarrollo, similar al desarrollado por Alternaria sp. En observaciones al microscopio óptico se detectó la presencia de conidióforos obscuros con conidios en la parte terminal los cuales presentaban septos tanto transversales como longitudinales, variables en forma y se observaron como una especie de verrugas en la pared de estos conidios (fig. 1 O).

VII.2 Descripción sintomatológica - de los principales hongos fitopatógenos.

Alternaria sp.

Característicamente este hongo causa manchas en las hojas. Estas manchas al principio son pequeñas y de color pilrpura, rápidamente crecen adoptando una fonna circular; el centro resalta por su color café grisáceo, necrótico, hundido y ornamentado con anillos concéntricos. Es frecuente observar grandes áreas necróticas en las hojas debido a la coalescencia (unión) de varias manchas.

El tejido foliar que media entre las lesiones (manchas) cambia de color, pasando del verde al amarillo y finalmente café, lo cual indica su muerte. En los tallos (principalmente en los entrenudos) las lesiones al principio son superficiales, pero después penetran profundamente, causando una especie de ahorcamiento por muerte y deshidratación de los tejidos infectados. En las áreas muertas el hongo hlctifica abundantemente, formando una costra negra de conidióforos y conidios que cubre la superficie epidémica.

Fusarium oxysponun

Como este hongo daña y bloquea los haces vasculares de la raíz del clavel ocasiona su marchitez y muerte. La primera indicación de su ataque es el marchitamiento de los brotes más jóvenes y es común observar como el tallo se distorciona o encorva hacia el lado afectado, Finalmente, el color verde del follaje cambia a amarillo paja, indicando su muerte. Las raíces permanecen intactas.

Botrytis cinerea

Los síntomas provocados por este hongo se manifiestan en los pétalos a manera de manchas cafés, conforme avanza la enfermedad el color de las manchas cambia a café grisáceo debido a las hlctificaciones del hongo, las cuales a su vez mantienen a los pétalos unidos y les dan una apariencia polvosa.

Rhizoctonia solani

Los síntomas provocados por este hongo en las muestras colectadas fileron poco visibles, sin embargo se observó una pudrición en la base del tallo ocasionando la marchitez y muerte de la planta por la falta de agua y nutrimentos.

No se observaron síntomas causado por Cladosporium sp. y Stemplhyllium sp. en las plantas donde fileron aislados estos hongos. Sin embargo, cabe sefialar qlle Cladosporim sp. es un patógeno que puede causar graves daños a otros cultivos como el tomate (moho de la hoja), melón y pepino (rofia o viruela), chícharo (moho de la hoja) y el nogal. Ea algunas hojas del nogal produce puntos café claro o café oliva sobre las venas del envés de las hojas (Orellana, 1982).

VIL3 Determinación de los patógenos de mayor incidencia en el Pueblo de San Luis Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F.

De los tres muestreos realizados se obtuvieron un total de 45 plantas completas dentro de las cuales se detectó la presencia de Alternaria sp., Fusarium oxysponun, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Cladosporiuln sp. y Stemphyllium sp., en la cantidad de plantas y distribuciqh que se indica en las Tablas 1,2 y 3. Mediante un análisis de varianza (Tabla No. 4) se evidenció que Fusarium oxvsporuln es el patógeno de mayor incidencia (5 1.38%) en esta localidad como se puede apreciar en la grafica No. l. y además el que más muerte causa a las plantas, no se encontró diferencia significativa en cuanto a su aislamiento en los diferentes órganos de la planta, dado que se observó el mismo número de colonias en tallo, flor, hoja y raíz.

Alternaria sp. es el patógeno que sigue en importancia en esta localidad en cuanto a su incidencia (41.59%) y a los daños provocados en la planta de clavel y

apesar de que este hongo generalmente se aisla de las hojas, en este caso no hubo diferencia significatica en cuanto al nilmero de colonias observadas en los diferentes órganos de la planta, se observó el mismo niunero de colonias desarrolladas en la hoja, tallo, flor y raíz.

Rhizoctonia solani presentó un porcentaje de incidencia mucho menor (3.67%)

comparado con los otros dos patógenos señalados anteriormente y ilnicamente se le eacontrh en tallo y raíz.

Botrytis cinerea file aislada solamente de la flor y su nivel de incidencia como se puede apreciar en la grafica No. 1 es de 1.83% la mitad de la presentada por Rhizoctonia solani.

La incidencia de Cladosporium sp. y Stemphyllium sp. en esta localidad file todavía mucho menor en comparación con los cuatro hongos antes descritos, 1.22% para el primero y 0.30% para el segundo. Cladosporium sp. se aisló de la flor y

Stemplwllim sp. de una sola muestra de hoja.

V11.4 Determinación del lneior medio de cultivo.

De acuerdo con el análisis de varianza (Tabla No. 5) se determinó que existe diferencia significativa en cuanto al nilmero de colonias desarrolladas por los diferentes patógenos identificados en los medios de cultivo PDA, M y JV8. En medio de cultivo PDA se observó el desarrollo y reproducción de Alternaría sp., Fusarium oxysponm, Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea, Cladosporium sp. y Stemphyllium sp., además de otras variedades de hongos que no so11 de interés. En los medios de cultivo AA y JV8 solamente se observó el desarrollo y reproducción de Alternaria sp. y Fusarium oxysporum.

TABLA

No.

1

MUESTRE0 No.

1

INVERNADERO No. 1

Planta Medio de Alternaria sp Fusarium Heterosporium Septoria Botrvtis Rhizoctonia [Jronlyces

cultivo oxysporun~ echinulatum m cinerea carvophyhus

1 PDA

₄

O

O

O

O

O

O

4

O

O

O

O

O

4

O

O

O

O

O

O

4

2 PDA

3 PDA

PDA (Medio de cultivo papa-dextrosa-agar)

0.- Ausencia del patógeno

1.- Presencia del patógeno en un solo órgano de la planta (raíz). 2.- Presencia del patógeno en dos órganos de la planta (tallo y raíz). 4.- Presencia del patógeno en tallo, hoja, flor y raíz

Otros: Trichoderma sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Rhizopus sp.

1

otros

4 1

4

O

"----I

O I

o

14

I

I

TABLA

No. 2

MUESTRE0 No. 2

INVERNADERO

No. 2

PDA

4

O

4

4

4

4

4

4

4

4

4

O

O

4

44

AA PDA PDA PDA A A

J V 8

J V 8

J V 8

PDA

J V 8

J V 8

AA AA Tots! Fusarium oxysporm1

O

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

4

56

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

StenlphyUiunt sp. otros

O

O

O

1

O

5

1

O

O

O

O

1

O

1

O

O

O

1

O

O

O

O

O

O

O

1

O

1

O

O

O

O

PDA (Medio de cultivo papa-dextrosa-agar) AA (Medio de cultivo agua-agar)

JV8 (Medio de cultivo jugo VS-agar) 0.- Ausencia del patógeno

1.- Presencia del patógeno en un órgano de la planta (hoja)

4.- Presencia del patógeno en los cuatro órganos de la planta

TABLA

No.

3

MUESTRE0 No.

3

INVERNA

Planta Mcdio dc

cultivo

1 PDA

2 AA

3 PDA

J AA

S PDA

6 AA

7 PDA

8 A A

9 PDA

-

PDA

k

Total

)ERO No.

3

O

O

O

O

0

O

O

O

1

4

4

O

O

O

O

O

O

O

4

4

O

O

O

O

O

O

1

44

52

O

O

6

12

O

4

7

PDA. (Medio de cultivo papa-dextrosa-agar) AA (Medio de cultivo agua-agar)

0.-Ausencia del patógeno

1.- Presencia del patógeno en un órgano de la planta (flor)

2.- Presencia del patógeno en dos órganos de la planta (tallo y raíz)

4.- Presencia del patógeno en tallo, flor, hoja y raiz. Otros: Phyllosticta sp., Trichoderma sp.

Resultados totales observados en los tres muestreos

muestra: nj 4 4 4 4 4 4 N=24

S-: X.j 136 168 12 6 1 4 X..=327

~ e d i a ~ :

X.,

34 42 3 1 .S 0.25 1 x..=13.6

Desviacidn

e s t a n d a r : S o O 2.4 2.6 0.43 1.7

TABLA No. 4

Tabla de

ANDEVA

(Daniel, 1982) para determinar si la presencia o ausencia de un

patógeno es sigmficativa con respecto a los demás patógenos aislados en las plantas

colectados

en

los

tres

muestreos realizados en los invernaderos de San

Luis

alco, xochimilco.

g.1 S.C. CM. F U I C .

(136)2 /4 + (168)2 /4 + (12)2 /4

+

(6)2 /4

+

7273.875 (1)2 /4 + (4)2 /4

-

(327)2 /24 = 11729.25

-

5 4455.375 = 7273.875 = 1454.7

6-1= 5

(34)2

+

(34)2

+

(34)2

+...,

(1>"

+

(4p

-

" 75.75 1454.7

11729.2% 11805-1 1729.25= 75.75 18 4.208

24-6= 18 = 4.208

= 345.6

24- 1= 23

11805-4455.375= 7349.625 I"""_

F0.95,5, 18

Resultados totales del niunero de colonias observadas en los tres medios de cultivo utilizados (Únicamente de los dos últimos muestreos)

Tamafio de

muestra: nj 3 3 3 3 3 3 N=18

S

-: X.j 92 108 12 6 1 4 X..=223

Medias: f¿.j 30.6 36 4 2 0.33 1.3 X..=12.3

TABLA

No.

5

Tabla de

ANDEVA

(Daniel,

1982)

para determinar si existe diferencia sirmlficativa

entre el número de colonias desarrolladas por los hongos identificados en los ties medios de cultivo empleados (PDA, AA y

JV8).

Incluyendo únicamente los datos

Tratamiento

=hongos

6-1=

5

t .

E&- *

L 18-6=

12

Total _{18-1= 17}

I

I

No.

2

y 3.

I

S.C.

= 802.45

= 4012.27

4012.27 (92)2 /3

+

( 10q2 /3

+

( 12)2 /4

+

(6)2 /3

+

C.M.

( 1)2 /3

+

(4)2 34

-

(223)2 /18 = 6775-2762.72 5

I

(44y

+

(28p

+

(20p

+....

(1)2

+

(4)2

- I

-

846 12

= 70.5

7621-2762.72= 4858.2

""""_

I I

Fd ,Fte6rica Si existe diferencia sigdicativa entre el número de colonias I desarrolladas por los hongos en los diferentes medios de cultivo.

802.45 70.5

= 11.38

F o . 9 , s. 12

= 3.11

U

n 0. 2

(D

3

O

ín

"

u,

P,

n

O

fig.

1 Colonia de Alternaria sp. en medio de cultivo

PDA

de amplio y rápido

cr&imiento, aislada de la hoja del clavel.

I

I

I

I

I

I

Fig. 3 Colonia de Fusarium oxysporum en medio de cultivo PDA de crecimiento lento y coloración violeta, aislada del tallo del clavel.

Fig. 4 Estructuras reproductoras de Fusarium oxvsporum obtenidas de la raíz del clavel. En la figura se pueden observar: a) microconidios y b) clamidosporas.

Fig. 5 Estructuras reproductoras de Fusarium oxysponlm obtenidas de la raíz del clavel. En la figura se pueden observar: a) macroconidios y b) microconidios.

2 2 5 8 1 0

Fig. 6 Colonia de B o w i s cinerea en medio de cultivo PDA aislada de la flor del clavel. En la figura se puede observar el amplio crecimiento de: a) rnicelio de aspecto algodonoso y b) esclerocios de color café obscuro.

Fig. 7 Estructuras reproductoras de Botrvtis cinerea obtenidas de la flor del clavel.

En la figura se pueden observar: a) conidióforos largos y ramificados y b) conidios ovoides, unicelulares.

Fig. 9 Crecimiento miceliar de Rhizoctonia solani aislado del tallo del clavel, mostrando: a) micelio septado y b) ramificación en ángulo recto.

Fig. 1 O Estructuras reproductoras de Stemphvllium sp. obtenidas de la hoja del clavel. En la figura se pueden observar: a) conidióforos alargados y

b) conidios terminales, obscuros y de tamaño variable.

VIII. DISCUSION

En el primer muestreo se obtuvieron colonias de sólo dos patógenos considerados de importancia económica en el cultivo de clavel: Fusarium

o x ~ s ~ o r u m y Alternaria sp., además de otros patógenos que no eran de interés como Trichoderma sp., Penicillium sp., Aspergillus - sp. y Rhlzopus sp., los

cuales se desarrollaban abundantemente en el medio de cultivo

PDA.

Debido a que se desarrollaban gran cantidad de organismos que no eran buscados, para el segundo muestreo se decidió emplear otros medlos más específicos que

pudieran permitir el desarrollo y reproducción de los demás hongos

fitopatógenos de importancia; sin embargo, Fusarium oxysporum y Alternaria sp. volvieron a ser los únicos hongos aislados de importancia durante este

muestreo y se aisló también de una sola muestra de hoja Stemphyllium sp., el cual ha sido aislado del clavel pero no es considerado de importancia

económica en el mismo. En la planta de donde fue aislado Stemphyllium sp., no se encontró ningún síntoma ni daño.

En el tercer muestreo se observó una mayor variedad de hongos dado que además de Fusarium o x v s ~ ~ n í m y Alternaria sp., se aislaron otros dos patógenos considerados de importancia económica en el cultivo del clavel: Rhizoctonia solani y Botrytis cinerea . El nivel de incidencia de estos dos

hongos es mucho menor en comparación con Fusarium oxysporum y Alternaria sp. Dentro de las plantas obtenidas en este muestreo también se aislaron

colonias de Cladosporium sp. que al igual que Stemphyllium sp. no es considerado de importancia económica. Cabe señalar que en las muestras

donde se desarrollaba Botrytis cinerea también se encontraban colonias de

Cladosporium sp., inhlbiendo el desarrollo en muchas ocasiones este último al

I . .,. . .

, primero.

De acuerdo con el análisis estadístico se determinó que sí existe' diferencia significativa en cuanto al número de observaciones de colonias

desarrolladas por los seis hongos fitopatógenos antes señalados siendo

Fusarium O X V S D O ~ el hongo de mayor incidencia en esta localidad seguido de Alternaria sp. y en mucho menor cantidad Rhizoctonia solani, Botrytis cinerea ,

Cladosporium sp y Stemphvllium sp., este último aislado de una sola muestra.

Este porcentaje de incidencia coincide con la sintomatología observada y por lo descrito por Larson (1988) y Salinger (1 99 l), al decir que Fusarium o x ~ s ~ o n u n está involucrado en el marchtamiento y posterionnente la muerte de las plantas de clavel y que se encuentra en todas las partes donde se cultiva y es el que mayor problema causa a los productores ocasionando grandes- pérldas económicas.

Fusarium oxysporum y Alternaria sp. se aislaron de los diferentes órganos de la planta: tallo, flor, hoja y raíz, no encontrándose Merencia

sigtllficativa en cuanto al número de colonias observadas en estos órganos, ést0 se debe a que la mayoría de las plantas colectadas en los tres invernaderos

presentaban un estado de marchtamiento y áreas necróticas avanzado en donde los patógenos causantes de estos síntomas ya habían invadido todas las partes de la planta.

En el m e l o de cultivo

PDA

se observó una mayor variedad de crecimiento y esporulación de los patógenos ya que los seis hongos

identificados arriba descritos fueron aislados en este medio que es rico en nutrientes y favorece su desarrollo.

Para obtener las cepas puras de

Fusarium

oxYsporum, Alternaria sp., Rhizoctonia solani y Botrvtis cinerea, fue necesario elaborar medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar con estreptomicina para inhibir el crecimiento de las

bacterias ya que constantemente se contaminaban las cepas con estos microorganismos.

Para la identificación de los hongos no se registró ningún problema ya que con el auxilio de claves, monograiias, descripciones hechas por otros autores y la sintomatología observada se logró identificarlos.

Con lo que respecta a los demás hongos considerados de importancia económica en el cultivo de clavel, no se encontraron en los invernaderos- muestreados en San

Luis

Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F.

La sintomatologia observada en las plantas colectadas nos proporcionó una base importante para el diagnóstico de los patogenos dado que en muchas ocasiones el conjunto de síntomas desarrollados por una enfermedad son

específicas y al compararlo con lo descrito por autores que han hecho trabajos relacionado con las enfermedades del clavel, facilita la identificación del

patógeno causante de dicha enfermedad.

La colección de cepas puras y preparaciones fijas de los principales hongos fitopatógenos de importancia económica en el cultivo de clavel se

inició con el fin de que el personal (incluyendo gente de servicio social) del laboratorio de hongos y bacterias de la SAGAR, tenga un apoyo para la identificación de patógenos por comparación y además nos permite seguir investigando las características de las colonias desarrolladas por los

patógenos como son color, forma de crecimiento, textura, olor, etc. y la descripción de las características de las estructuras reproductoras, así como poder llevar acabo proyectos experimentales enfocados principalmente a su control.

IX. CONCLUSION

Se aislaron, purificaron e identificaron seis hongos fitopatógenos: Alternaria sp., Botritys cinerea., Fusarium oxysponnn y Rhizoctonia solani considerados de importancia económica en el cultivo de clavel en San Luis Tlaxialtemalco, Xochimilco, D.F. y en el país; así como Cladosporium sp. y Stemphyllium sp., los cuales han sido aislados del clavel, pero no son considerados de importancia económica, ya que en las plantas donde fileron aislados no se observó daíío alguno provocado por los mismos.

Con base en el número de plantas enfermas colectadas y aislamientos obtenidos, Fusarium oxysponun es el patógeno de mayor incidencia en esta localidad, seguido de Alternaria sp., Rhizoctonia solani, Botritvs cinerea, Cladosporium sp.y Stemphyllium

S P -

Fusarium oxvsporuln puede ser considerado un patógeno de alta importancia económica en el cultivo del clavel dado que al atacar a la planta provoca su marchitamiento y posteriormente su muerte al daííar y bloquear los haces vasculares de la raíz y tallo.

Alternaria sy. es otro patógeno de suma importancia debido a su alta incidencia en esta localidad y a los daííos que provoca en la planta, generalmente causando grandes áreas necróticas en las hojas y de esta manera la planta pierde su valor comercial.

De los tres medios de cultivo empleados para el aislamiento de los patógenos se observó una diferencia significativa en cuanto al desarrollo y reproducción de los mismos, siendo en el medio de cultivo PDA donde se registró el mayor nimero de colonias fonnadas por los seis hongos fitopatógenos identificados.

El medio de cultivo PDA es universalmente utilizado en el aislamiento, desarrollo y reproducción de un gran número de géneros y especies de hongos debido a que es un medio rico en nutritientes que favorece el crecimiento de éstos.

Se inició la colección de cepas puras y preparaciones fijas al obtener cuatro hongos considerados de importancia económica en el cultivo del clavel: Alternaria sp., Botritys cinerea., Fusarium oxysporum y Rhizoctonia solani. Estas cepas y

preparaciones fijas permanecerán en el laboratorio de hongos y bacteria del Centro Nacional de Referencia de Diagnostico Fitosanitario de la dirección General de Sanidad Vegetal de la SAGAR.

El contar con cepas puras y preparaciones fijas de hongos, facilita la identificacih de los mismos, dado que no solamente se pueden observar características morfológicas de las estnlcturas reproductivas, sino que las características desarrolladas a nivel de la colonia proporcionan bases importantes para su diagnóstico.

X.

RECOMENDACIONES

Con el fin de llevar a cabo un buen programa para la prevención y

control de los hongos que atacan al clavel, es importante:

-

Dado que los floricultores de esta localidad compran los esquejes

provenientes de E.U., es necesario evitar la introducción de este material vegetativo infectado, es decir, adquirirlos cuando hayan sido plenamente certificados para evitar la proliferación de patógenos en esta área.

- Recolectar y destruir las plantas infectadas

-

Mantener el control de la humedad ya que el exceso de ésta favorece el desarrollo de los hongos.

- Control de la temperatura, alrededor de 24 OC o más son, favorables para el desarrollo de algunos hongos como

Fusarium

oxysponun, por lo que es

conveniente mantenerla fuera de este nivel.

-

Los floricultores que cultivan clavel bajo techo y usan suelo esterilizado,

raras veces tienen problemas con Rhizoctonia s o u , sin embargo cuando

ést0 sucede la aplicación de Terraclor 75%, a razón de 0.5 kg/m2, es el

remedio más eficaz y barato con que se cuenta actualmente (Romero, 1992).

-

En el invernadero, por lo general, no se presenta el tizón causado por

sp si se tiene la precaución de sembrar plantas sanas.

.,

-

En cuanto a Rotrytls cinerea ataca severamente sólo cuando la humedad y

@ temperatura son altas, la medida de control más efectiva consiste en

mantener estos factores al nivel más bajo posible. La recolección y quema de las yemas enfermas es otra medida que ayuda al control, así como el uso de

hgicidas, tales como Zineb, Captán, o Botran (Romero, 1992).

-

Para el control de la enfermedad causada por Fusarium oxvsponun es conveniente:

-

Obtener esquejes provenientes de plantas madres cuya sanidad haya sido plenamente comprobada.

-

Evitar la sobrefertilización con nitrógeno, lo cual favorece la invasión de este patógeno.

-

Los sustratos utilizados para enraizamiento deben ser materiales inertes' y porosos tales como la agrolita, tezontle y otros que no favorezcan el

desarrollo saprófito del hongo y deben esterilizarse antes de colocar los esquejes para el enraizado.

-.

Los

esquejes deben protegerse con fúngcidas en el lugar del corte, ésto se logra mehante la inmersión de ellos en soluciones a base de Ferbam o Benomyl (Lamas, 1978).

-

Los horticultores de San Luis Tlaxialtemalco y Xochimilco en general, pueden aumentar la cantidad y calidad de sus plantas ornamentales aplicando técnicas adecuadas para el control de plagas y enfermedades, desgraciadamente la mayoría de ellos (horticultores locales) carecen de esta información y sobre todo no cuentan con asesoría técnica por lo que es recomendable que se incremente el número de cursos de capacitación y asistencia técnica por parte de la SAGAR; a s í como se consolide la vinculación de los horticultores y la

SAGAR con

los

principales centros de investigación nacional (Universidad- Autónoma Metropolitana, Universidad Nacional Autónoma de México,

Instituto Politécnico Nacional, Universidad Autónoma Chapingo, etc.).

Finalmente la colección de cepas puras y preparaciones

fijas

puede ser utilizado por el personal que labora en el laboratorio de hongos y bacteria del Centro Nacional de Referencia de Diagnóstico Fitosanitario de la SAGAR, así como por personal de servicio social ya que presta apoyo desde el punto de

vista taxonómico, modo-fisiológico y de control.

XI.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA

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Las siguientes técnicas de elaboración de los medos de cultivo es en base a lo descrito por López (1 984).

1-. .PAPA- DEXTROSA-AGAR (P.D.A.)

Este medio de cultivo se utiliza en el aislamiento, desarrollo y reproducción de

un

gran número de especies de hongos.

Ingredientes:

Papa ... 200g. Dextrosa..

...

_2og

Agar.

...

_1% Agua destilada..

...

.aforar a 1 O00 ml

Procedimiento:

Partir

200 g de papa sin cáscara, introducirlos en un matraz de un litro de capacidad, enjuagarlos dos ó tres veces, agregar 500 ml de agua destilada. Incorporar

el agar en 500 ml de agua destilada dentro de un matraz de un litro de capacidad. Licuar la papa y el agar a 15 lb/pulg y 120 OC durante diez a quince minutos en olla de presión o autoclave. Concluido este tiempo, se

filtra

la infusión de papa a través de manta de cielo; agregar la dextrosa a la solución de agar y disolver rotando ligeramente. Juntar la solución de agar-dextrosa con la infusión de papa filtrada,

mezclar bien y aforar con agua destilada a 1000 ml.

Nota: Los siguientes pasos tendientes para lograr la esterilización del medio de cultivo a cajas de petri, y llenado de tubos de ensayo se llevan a cabo en forma similar en la preparación de los medios de cultivo de AA y JVS-agar, por lo cual en el

Dividir en dos matraces de un litro de capacidad el medio de cultivo preparado, colocar en la boca de éstos un tapón de algodón; si se requiere el medio en tubos de ensayo, se agrega a éstos colocando también un tapón de algodón; de esta manera matraces y tubos de ensayo

se

esterilizan a 15-20 lbs/pulg de presión y 120

OC

durante 20 minutos. Después de que se enliía el medio de cultivo contenido en los

matraces y antes de que solidifique, se vacía a las cajas de petri, realizando esta operación bajo condiciones estériles. Los tubos de ensayo, inmediatamente después de la esterilización, se colocan en posición inclinada hasta que solidifique el medio.

2.- JUGO V8-AGAR (JV8)

Ingredientes:

Jugo de verduras V-8 centrifbgado

...

200 ml (se obtiene de 300 ml de jugo V-8)

C a c o

...

.4.5 g

Agar.. ... _{15 g}

Agua destilada

...

aforar a 100 ml

Procedimiento:

Disolver el agar en 500 ml de agua destilada, licuando a 15 Ibs/pul? y

120 OC durante diez a quince minutos; airadir la solución de agar al jugo de verduras