Efecto de Trichoderma spp aislados del distrito de Santiago de Cao sobre huevos de Melodoigyne sp en condiciones de laboratorio y de invernadero

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. BI. O. LO. G. IC. AS. ESCUELA PROFESIONAL MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. AS. “Efecto de Trichoderma spp. aislados del distrito de Santiago de Cao sobre huevos de Melodoigyne sp. en condiciones de. CI EN. CI. laboratorio y de invernadero” TESIS. DE. PARA OBTENER EL TÍTULO DE:. AUTOR:. TE. CA. BIÓLOGO - MICROBIÓLOGO. BI. BL. IO. Br. LOPEZ FUENTES, Fiorella Lisset. ASESOR Ms.C. WILSON KRUGG, Juan Hector TRUJILLO – PERÚ 2019. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE. AS. TRUJILLO. IC. Dr. Orlando Moisés Gonzáles Nieves. BI. O. LO. G. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AS. Dr. Rubén César Vera Véliz. CI. VICERRECTOR ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD. DE. CI EN. NACIONAL DE TRUJILLO. CA. Dr. Weyder Portocarrero Cárdenas.. NACIONAL DE TRUJILLO. BI. BL. IO. TE. VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN LA UNIVERSIDAD. Dr. Steban Alejandro Ilich Zerpa. SECRETARIO GENERAL (e) DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. G. IC. Dr. Freddy Rogger Mejía Coico. AS. BI. O. LO. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. CI EN. CI. Dr. William Elmer Zelada Estraver. CA. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. TE. Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez. MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA. BI. BL. IO. DIRECTORA DE LA ESCUELA PROFESIONAL DE. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEL ASESOR. AS. El que suscribe: Ms C. Juan Hector Wilson Krugg, asesor de la presente tesis. IC. titulada: “Efecto de Trichoderma spp. aislados del distrito de Santiago de Cao sobre. O. LO. G. huevos de Melodoigyne sp. en condiciones de laboratorio y de invernadero”.. BI. CERTIFICA:. AS. Que la investigación ha sido ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por. CI. la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, estando en. CI EN. conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado las observaciones y sugerencias alcanzadas.. Por lo tanto, autorizo al Bachiller LOPEZ FUENTES FIORELLA LISSET,. CA. DE. continuar con los procedimientos según sus fines.. BI. BL. IO. TE. Trujillo, Mayo 2019. _______________________________ Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg ASESOR. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. G. IC. SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:. AS. PRESENTACIÓN. LO. En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados. O. y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, pongo a vuestra consideración y elevado. BI. criterio la presente tesis titulada: “Efecto de Trichoderma spp. aislados del distrito de. AS. Santiago de Cao sobre huevos de Melodoigyne sp. en condiciones de laboratorio y de. CI EN. CI. invernadero”, con el objetivo de obtener el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.. Trujillo, Mayo 2019. BI. BL. IO. TE. CA. DE. Espero que este trabajo sea de su aprobación.. ____________________________________. Br. Fiorella Lisset Lopez Fuentes. v Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. LO. __________________________. G. IC. AS. MIEMBROS DEL JURADO. BI. CI EN. CI. AS. PRESIDENTE. O. Dr. Heber Max Robles Castillo. ____________________________. DE. Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg. BI. BL. IO. TE. CA. SECRETARIO. _______________________________. Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez VOCAL. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. AS. Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el. IC. presente Informe de Tesis ha cumplido con los requisitos formales y. BI. O. LO. G. fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.. AS. __________________________ Dr. Heber Max Robles Castillo. DE. CI EN. CI. PRESIDENTE. CA. ____________________________. SECRETARIO. BI. BL. IO. TE. Ms. C. Juan Hector Wilson Krugg. _______________________________. Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez VOCAL. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DEDICATORIA. AS. A Dios, por su infinito amor, por guiarme y. IC. encaminarme en las situaciones más difíciles y. G. permitirme lograr poco a poco. O. LO. mis objetivos.. BI. A mis Padres, Lidia y Marino, por todo su amor,. AS. por su comprensión, sus enseñanzas y consejos,. CI. su apoyo incondicional brindado desde mis primeros pasos.. CI EN. Sin ustedes esto no sería posible.. DE. A mi Hermano, Javier, por su apoyo, por su. tenemos, sé que puedo contar contigo.. BI. BL. IO. TE. CA. cariño y que a pesar de las diferencias que. A mi Abuelito, Juan, y mis Tíos, Bertha y Carlos, por ser mis segundos padres, por sus consejos, por su preocupación, por las enseñanzas y apoyo brindado hasta ahora.. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AS. AGRADECIMIENTO. IC. Mi más profundo y sincero agradecimiento a mi asesor, Juan Hector Wilson. G. Krugg, profesor de la cátedra de Micología y Fitopatología. Gracias por. LO. brindarme todos sus conocimientos, enseñanzas, consejos, su confianza y. O. amistad brindada durante la carrera universitaria y el tiempo que duró este. CI EN. CI. AS. BI. trabajo de investigación.. A los señores, Domingo Arroyo y Julio Asencio, propietarios de los terrenos de cultivos donde se realizó la recolección de las muestras de suelo, gracias por su. BI. BL. IO. TE. CA. DE. contribución en este trabajo de investigación.. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. AS. Con la finalidad de reducir el uso de plaguicidas químicos que producen alta toxicidad. IC. y dañan el suelo, es necesario buscar alternativas ecológicas, utilizando controladores. G. biológicos como hongos, para tratar enfermedades y plagas que afectan a las plantas,. LO. especialmente, a la parte subterránea sin dejar residuos contaminantes. Por este motivo,. O. el objetivo de este trabajo de investigación es conocer el efecto de los cultivos nativos de. BI. Trichoderma spp., aislados del distrito de Santiago de Cao sobre huevos de Meloidogyne. AS. sp. en condiciones de laboratorio y de invernadero, estos cultivos puros se aislaron y se. CI. seleccionaron tres cultivos nativos de Trichoderma spp. (TSCL2, TSCS2, TSCZ2), por. CI EN. su mayor crecimiento radial y cantidad de conidias/mL. Se usaron treinta plantas de Lycopersicum esculentum, las cuales se distribuyeron en seis grupos y recibieron distintos tratamientos por dos meses. Pasado el periodo de tratamiento, las plantas de L. esculentum. DE. fueron extraídas calculando el porcentaje de nodulaciones de las raíces y el porcentaje de. CA. peso radicular, estos resultados fueron procesados aplicando la prueba de análisis de varianza ANOVA y la prueba de Tukey, encontrando diferencias significativas entre los. TE. tratamientos en ambos resultados. Por tal motivo, se concluye que los tres cultivos de. IO. Trichoderma spp. nativo seleccionados y evaluados tienen efecto biocontrolador sobre. BL. huevos de Meloidogyne sp., pero, el cultivo nativo TSCL2 es el que presenta un menor. BI. porcentaje de nodulación y un mayor porcentaje de peso radicular. Palabras claves: Trichoderma spp., Meloidogyne sp., Santiago de Cao.. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ABSTRACT. AS. In order to reduce the use of chemical pesticides that produce high toxicity and damage. IC. the ground, it is necessary to look for ecological alternatives, using biological controllers. G. such as fungi, to treat diseases and blight that affect to the plants, especially, the. LO. underground part without leaving polluting residues. For this reason, the objective of this. O. research work is to know the effect of the native crops of Trichoderma sp., isolated from. BI. the district of Santiago de Cao on eggs of Meloidogyne sp. in laboratory conditions. These. TSCS2,. TSCZ2),. due. to. its. AS. pure crops were isolated and selected three crops native Trichoderma sp. (TSCL2, greater. radial. growth. and. amount. CI. of conidia/mL. Thirty Lycopersicum esculentum plants were used, which were. CI EN. distributed in six groups and received different treatments for two months. After the treatment period, the plants of L. esculentum were extracted by calculating. DE. the percentage of Root nodulations and percentage of root weight, these results were processed applying the variance analysis test ANOVA and the Tukey test,. CA. finding significant differences between the treatments in both results. For this reason, it. TE. is concuted that the threecultures of Trichoderma spp. native selected and evaluated have. IO. a biocontrol effect on Meloidogyne sp. eggs, but the TSCL2 native crops has the lowest. BI. BL. percentage of nodulation and a higher percentage of root weight.. Keywords: Trichoderma spp., Meloidogyne sp., Santiago de Cao. xi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. ÍNDICE. AS. Autoridades de la Universidad Nacional de Trujillo……………………………………ii. IC. Autoridades de la Facultad de Ciencias Biológicas……………………………………...iii. LO. G. Del asesor………………………………………………………………………………..iv. O. Presentación……………………………………………………………………………...v. BI. Miembros del jurado…………………………………………………………………….vi. AS. Aprobación……………………………………………………………………………..vii. CI EN. CI. Dedicatoria…………………………………………………………………………….viii Agradecimiento…………………………………………………………………………ix. DE. Resumen…………………………………………………………………………………x Abstract………………………………………………………………………………….xi. CA. Índice…………………………………………………………………………………...xii Introducción………………………………………………………………………..1. TE. I.. IO. II. Material y Método………………………………………………………………….10. BL. 1. Material………………………………………………………………………...10. BI. 2. Procedimiento………………………………………………………………….10 2.1.. Recolección de muestras de suelo de cultivos agrícolas…………...…….11. 2.2.. Transporte de las muestras de suelo………..……………………………11. xii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3.. Aislamiento de Trichoderma spp. nativos a partir de las muestras de suelo agrícola recolectados del distrito de Santiago de Cao………………..….12 Obtención de cultivos de Trichoderma spp. nativos……………...……..12. 2.5.. Determinación de las características fenotípicas de Trichoderma…..…..13. AS. 2.4.. IC. 2.5.1. Determinación de las características macroscópicas……….……13. Selección de cultivos de Trichoderma spp. nativos……...……………...14. LO. 2.6.. G. 2.5.2. Determinación de las características microscópicas…………….13. O. 2.6.1. Determinación de la velocidad de crecimiento de los cultivos de. BI. Trichoderma spp. nativos……………………………………….14. AS. 2.6.2. Determinación del número de esporas de los cultivos de. Evaluación de la capacidad nematófaga de los cultivo seleccionados de. CI EN. 2.7.. CI. Trichoderma spp. nativos……………………………………….14. Trichoderma spp. nativos contra huevos de Meloidogyne sp. …….……15 2.7.1. Obtención de los huevos de Meloidogyne sp…………………….15. DE. 2.7.2. Evaluación in vitro de la actividad nematófaga de Trichoderma. 2.8.. CA. spp. nativos sobre los huevos de Meloidogyne sp. ……………..16 Evaluación de los cultivos de Trichoderma spp. nativos sobre huevos de. TE. Meloidogyne sp. en condiciones de invernadero………………………...17. BI. BL. IO. 2.8.1. Obtención de cultivos puros de cada cultivo nativo de Trichoderma spp. ……………………………………………………………...31. 2.8.2. Propagación de los cultivos nativos de Trichoderma spp. ………17 2.8.3. Recolección, esterilización y preparación del sustrato…………..17 2.8.4. Tratamiento superficial y siembra de semillas de Lycopersicum esculentum………………………………………………………18. xiii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.8.5. Estandarización de inóculos de Trichoderma spp. nativos……...18 2.8.6. Inoculación de Meloidogyne sp…………………………………19 2.8.7. Inoculación de Trichoderma spp. nativos seleccionados……….19. AS. 2.8.8. Inoculación de Oxamyl (Control Positivo)..…………………….19. IC. 2.8.9. Lectura de resultados……………………………………..……..20. G. 2.8.10. Análisis de datos………………………………………………...20. LO. III. Resultados………………………………………………………………………….21. O. IV. Discusión…………………………………………………………………………..27. BI. V. Conclusiones……………………………………………………………………….32. AS. VI. Recomendaciones………………………………………………………………….33. CI. VII. Referencias Bibliográficas………………………………………………………....34. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. Anexos………………………………………………………………………………….46. xiv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. AS. Existen diversos organismos patógenos que afectan a la agricultura en el mundo,. IC. además de plagas y enfermedades que afectan a los diferentes cultivos. También es. G. necesario prestarle atención a los nematodos, que son organismos vermiformes. LO. microscópicos, que tienen una amplia gama de plantas huéspedes, por lo que ciertas. O. especies de nematodos del suelo ocupan un importante lugar en la agricultura. (Doucett,. AS. BI. 1993; Tylka, 2007).. CI. El nivel de daño causado por nematodos depende del grado de asociación hospedante-. CI EN. nematodo, de la especie o raza, de la densidad poblacional de éste, de la susceptibilidad del hospedante, de las condiciones de suelo, del ambiente y de la interrelación entre los. DE. nematodos y otros organismos fitopatógenos. La combinación de todos estos factores determina la severidad de la enfermedad y, consecuentemente, la disminución en la. TE. CA. producción (García, 2006).. IO. El daño que estos nematodos provocan, suele ser de muy difícil evaluación debido, al. BL. hecho de que los síntomas que provocan son generalmente inespecíficos: falta de vigor,. BI. bajo rendimiento, decoloraciones y poca resistencia a la sequía que pueden confundirse con estrés hídrico o deficiencias nutricionales (Dagatti et al., 2014).. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A pesar de existir cientos de géneros y especies de nematodos fitoparásitos a nivel mundial, solo un número reducido están reconocidas como causantes de los principales impactos en los cultivos agrícolas. El género Meloidogyne está considerado como el de. AS. mayor importancia económica (Fernández, 2007), por su amplia distribución geográfica. IC. y su amplio rango de hospederos, además de ser causante de importantes daños. O. LO. G. económicos en cultivos vegetales y frutales. (Sasser, 1983).. BI. Meloidogyne sp., el nematodo del nudo de la raíz, se encuentra asociado a muchos. AS. cultivos de importancia agrícola. Este nematodo es un endoparásito sedentario que causa nódulos en las raíces de sus hospedantes y puede interaccionar con hongos fitopatógenos. CI. causando mayores daños al sistema radical, en menor tiempo que los que causarían el. CI EN. hongo o el nematodo por sí solo (Guzmán et al., 2012).. DE. Los nematodos del género Meloidogyne son conocidos por su habilidad para producir. CA. cambios fisiológicos en el sistema radicular de las plantas y causar pérdidas en la. TE. absorción de nutrientes afectando su crecimiento (enanismo), clorosis y marchitamiento.. BL. IO. (Wishart et al., 2002; Coyne et. al., 2007).. BI. Según García (2006) afirma que entre las especies de Meloidogyne se pueden. mencionar: M. hapla, M. incognita, M. arenaria, M. javanica, M. fallax, M. chitwoodi, entre otras. Algunas especies de Meloidogyne sp., como M. chitwoodi y M. fallax, son plagas cuarentenarias y varían mucho, tanto en organismos hospederos como en el nivel. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. de virulencia, por lo que su rápida y acertada identificación es de gran importancia en el. AS. manejo que se le da a estas plagas.. IC. El ciclo de vida de M. incognita involucra cinco estados de desarrollo, que comienza. G. con el desarrollo embriogénico dentro del huevo, de lo cual resulta la formación del. LO. primer estado juvenil; este posteriormente muda y da origen al segundo estado juvenil. O. (II) dentro del huevo. El juvenil II eclosiona del huevo y migra en el suelo buscando su. BI. alimento, siendo este el único estado infectivo (Farfán, 2011). Además, Starr et al. (2002). AS. indica que cuando el hospedero es susceptible al nematodo, responde a la penetración del. CI. estilete e inyección de enzimas de este, modificando las células, las que comienzan a. CI EN. incrementar su división y crecimiento estimulando la formación de agallas (células gigantes); así, una vez establecidos en el tejido, el juvenil aumenta su tamaño en un breve tiempo. El ciclo de vida puede completarse entre 3-4 semanas, dependiendo, entre otros. CA. DE. factores, de la temperatura del suelo (Hidalgo, 2008; Singh et al., 2013).. TE. Los nematodos fitopatógenos son considerados parásitos difíciles de controlar.. IO. Históricamente el método de control más utilizado es el uso de nematicidas químicos que,. BL. además de costosos, son altamente contaminantes. (Vinueza et al., 2006) Controlar a los. BI. nematodos fitopatógenos, con criterios ecológicos y económicos, como: el control cultural que utiliza a los barbechos, las inundaciones, aplicaciones de abonos orgánicos, plantas trampa y de cobertura, rotación de cultivos, etc.; y el control físico, a la solarización, vapor de agua, encharcamiento, etc.; estos métodos reducen notoriamente las poblaciones de Meloidogyne sp. y pueden ser usados de manera individual o. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. combinada, pero son poco usados por los agricultores por su alta inversión y largos. AS. periodos de aplicación. (Zavaleta, 1999).. IC. Además de los métodos anteriores, es necesario mencionar la utilización de hongos. G. mitospóricos como controladores biológicos frente a las enfermedades y plagas de los. LO. cultivos agrícolas, dentro de este grupo de hongos representativos están los géneros de:. O. Pochonia, Paecilomyces, Trichoderma. Este último, es un hongo que se caracteriza por. BI. predominar en los ecosistemas terrestres (suelos agrícolas, pastizales, bosques y. CI. AS. desiertos) y acuáticos (Zhang et al. 2005).. CI EN. Martínez et al. (2013), afirma que las especies de Trichoderma se encuentran ampliamente distribuidas por todas las latitudes, y se presentan naturalmente en diferentes ambientes, especialmente en aquellos que contienen materia orgánica o desechos. CA. DE. vegetales en descomposición.. TE. Algunas especies de este género son de vida libre en el suelo, oportunistas, simbiontes. IO. de plantas, y otras son micoparásitas. Además, pueden colonizar distintos ambientes,. BL. debido a su alta capacidad reproductiva (Bissett, 1991; Harman et al., 2004). De manera. BI. particular, los hongos del género Trichoderma se pueden encontrar en la rizosfera, donde. son capaces de competir por nutrimentos y espacio con otros microorganismos. (Argumedo et al., 2009).. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Las características macroscópicas de Trichoderma, describen a la mayoría de las especies de este género, de color blanco, en un inicio, y luego se tornan a verde oscuro o amarillento, con esporulación densa. (Rifai, 1969). Por otro lado, las características. AS. microscópicas de las especies del género Trichoderma en su estado vegetativo, presentan. IC. micelio con septos simples. Las especies son haploides y su pared está compuesta por. G. quitina y glucano. Se reproducen asexualmente por conidios. Presentan conidióforos. LO. hialinos ramificados, fiálides simples o en grupos, conidios de 3 a 5 µm de diámetro,. O. generalmente ovalados, unicelulares, coloreados (usualmente verdes); de rápido. BI. desarrollo en medios sintéticos. Tiene la capacidad de producir clamidosporas en. AS. sustratos naturales que, son unicelulares, pero pueden unirse entre dos o más. Estas. CI. estructures son de vital importancia para la sobrevivencia del género en el suelo bajo. CI EN. condiciones adversas. El organismo crece y se ramifica desarrollando típicas hifas, de 5. DE. a 10 µm de ancho. (Harman, 2001).. Trichoderma, es un género de hongos del suelo que incluye especies ampliamente. CA. utilizadas como agentes de control biológico en la agricultura, además de ser de fácil. TE. manejo y rápido crecimiento. Muchas cepas son conocidas por secretar metabolitos. IO. secundarios con diferentes actividades biológicas, así como por incrementar el. BL. aprovechamiento de los nutrientes por parte de las plantas. Los biofungicidas basados en. BI. este hongo comprenden más de 50 formulaciones, disponibles como productos registrados en todo el mundo. Investigaciones recientes han identificado y determinado la función de nuevos genes, enzimas y otras proteínas que producen resistencia inducida en las plantas (Infante et al., 2011; Vinale et al., 2014; Woo et al., 2006).. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Según el Ministerio de Agricultura de Chile (2008), señala que las especies de Trichoderma, pueden desarrollarse en una amplia gama de sustratos, lo cual facilita su producción masiva para uso en la agricultura. Su gran tolerancia a condiciones. AS. ambientales extremas y hábitats donde otros hongos son causantes de diversas. IC. enfermedades, le permiten ser un eficiente agente de control; de igual forma puede. G. sobrevivir en medios con contenidos significativos de pesticidas y otros químicos.. AS. BI. O. biológico bajo diferentes sistemas de producción y cultivos.. LO. Además, su gran variabilidad se constituye en un reservorio de posibilidades de control. Las especies con mayor efecto en control biológico incluyen a T. atroviride, T.. CI. hamatum, T. asperellum y T. harzianum. Estas especies se caracterizan por presentar un. CI EN. rápido crecimiento, poseer una gran capacidad de esporulación y de adaptación a un. DE. amplio rango de suelos agrícolas. (Hjeljord y Tronsmo, 1998). CA. Las diferentes especies de Trichoderma ejercen biocontrol de manera indirecta, ya sea. TE. por competencia de nutrientes o espacio, antibiosis (producción de metabolitos), modificando las condiciones ambientales o mediante la producción de sustancias. IO. promotoras del crecimiento vegetal y de una forma directa por micoparasitismo (Benítez. BI. BL. et al., 2004).. Ezziyyani et al. (2004) afirma que las especies de Trichoderma actúan como hiperparásitos competitivos que producen sustancias antifúngicos y enzimas hidrolíticas a los que se les atribuyen los cambios estructurales a nivel celular, tales como 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. vacuolización, granulación, desintegración del citoplasma y lisis celular, encontrados en. AS. los organismos con los que interactúa.. IC. Entre hongos fitopatógenos que controlan las diversas especies de Trichoderma se. G. pueden mencionar a Phytium, Rhizoctonia, Fusarium y Sclerotinia, Botrytis, mildius. LO. polvoroso, entre otras. (Suárez, 2008). Además, tiene un efecto antagonista contra. O. Meloidogyne incognita y M. javanica, al inhibir la eclosión de huevos, y la inmovilidad. AS. BI. y muerte de Juveniles (J2) (Rosso et al., 2004; Siddiqui y Shaukat, 2004).. CI. De acuerdo a investigaciones de Al-Hazmi y TariqJaveed (2016) dos especies nativas. CI EN. de Trichoderma harzianum y Trichoderma viride redujeron significativamente la irritación en la raíz, la producción de huevos y juveniles (J2) de Meloidogyne javanica en el suelo y estimularon el crecimiento de la planta; aumentando el control biológico. DE. conforme se aumentaba el inóculo de estas especies de Trichoderma. Además, Zhang col.. CA. (2015) reportaron la disminución de los números de nematodos y aumento de crecimiento. TE. de la planta que mejora la resistencia contra Meloidogyne incognita empleando como. BL. IO. controlador biológico especies nativas de Trichoderma longibrachiatum.. BI. Según, Mendoza y col., (2013) informan que Trichoderma atroviride, Trichoderma. harzianum y Trichoderma viride tienen un efecto negativo sobre huevos y juveniles (J2) Meloidogyne sp. en condiciones de laboratorio. Asimismo, Del Castillo y col., (2014). notificaron que dos especies nativas de Trichoderma sp. tienen un efecto negativo sobre los huevos y juveniles (J2) de Meloidogyne sp.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. En la presente investigación, se tiene en cuenta la problemática de los agricultores para combatir enfermedades que afectan principalmente a las partes subterráneas de las plantas, por eso, es necesario buscar alternativas de solución frente a estos problemas,. LO. G. IC. patógenos, causando una alta toxicidad y contaminando el manto freático.. AS. reemplazando a los pesticidas químicos, los cuales disminuyen el impacto de los. O. Ante los reportes encontrados, las especies nativas de Trichoderma son muy usadas. BI. como controladores biológicos de hongos fitopatógenos ejerciendo un efecto positivo en. AS. el crecimiento de las plantas, con mejor desarrollo radicular y aumentando el mecanismo de defensa de las plantas. Por ello, es importante conseguir cultivos nativos de. CI. Trichoderma porque, según investigaciones, poseen una conducta que se adecua a. CI EN. condiciones agroecológicas regionales iguales e incluso similares de donde procede, debido a su adaptación a factores edáficos particulares ya sean biológicos o ambientales,. DE. a diferencia de especies introducidas que pueden tener difícil adaptación, modificación en su estructura y obtener resultados inesperados; siendo su hallazgo y evaluación. TE. CA. beneficioso para los agricultores.. IO. Además, Trichoderma sp. es utilizado como controlador de nematodos, permitiendo. BL. que los agricultores puedan utilizar a este hongo y así disminuir los costos de tratamiento. BI. en el control de plagas, mejorando la producción agrícola y disminuir el impacto ambiental producido por los pesticidas usados. Por los antecedentes, hasta la actualidad, no se han realizado estudios para evaluar a Trichoderma como controlador biológico. sobre huevos de Meloidogyne sp. en el distrito de Santiago de Cao; por ende, se necesita. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. buscar hongos nativos del género Trichoderma que tengan capacidad de controlar nematodos, por lo que el presente trabajo de investigación tiene como objetivo evaluar el efecto de Trichoderma spp. nativos provenientes de suelos del distrito de Santiago de Cao. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. sobre huevos de Meloidogyne sp. en condiciones de laboratorio y de invernadero.. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. II.. MATERIAL Y MÉTODO. AS. 1. Material. . . LO. G. Zea mays y Lactuca sativa del distrito de Santiago de Cao.. IC. Cien gramos de suelo procedente de cultivos de Saccharum officinarum,. BI. provenientes del distrito de Santiago de Cao.. O. Cultivos puros de Trichoderma spp. nativos aislados de muestras de suelo. Huevos de Meloidogyne sp. extraídos de raíz de Lactuca sativa “lechuga”.. . Treinta plántula de Lycopersicum esculentum var. Río grande “tomate”.. . Nematicida Nemate® 240 SL, cuyo principio activo es el Oxamyl.. DE. 2. Procedimiento.. CI EN. CI. AS. . Tratamiento Control Negativo (C1): Plantas de Lycopersicum esculentum.. TE. . CA. Se utilizó un diseño experimental que incluyó 6 tratamientos.. Tratamiento Control Positivo (C2): Plantas de Lycopersicum esculentum. IO. . BL. infectadas con Meloidogyne sp.. BI. . Tratamiento Control Positivo (C3): Nematicida Nemate® inoculado en plantas de Lycopersicum esculentum infectadas con Meloidogyne sp.. . Tratamientos Experimentales (E): Trichoderma spp. nativos seleccionados, inoculados en plantas de Lycopersicum esculentum infectadas con Meloidogyne sp.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.. Recolección de muestras de suelo de cultivos agrícolas. Se tomaron muestras de suelo agrícola procedente de cultivos de Saccharum officinarum, Zea mays y Lactuca sativa de diferentes puntos. AS. del distrito de Santiago de Cao, provincia de Ascope, departamento La. IC. Libertad. La metodología del muestreo fue tomar 5 muestras de cada. G. parcela, que posteriormente se obtuvo una mezcla de aproximadamente. LO. 100 g. de suelo muestreado. Las muestras de suelo se tomaron a una. AS. BI. plantas. (Bolsa de Comercio de Rosario).. O. profundidad aproximada de 30 cm. en la parte de la rizósfera de las. CI. Las muestras de suelo se depositaron en bolsas de plástico de primer uso. CI EN. previamente rotuladas. Todas las herramientas utilizadas para la recolección fueron lavadas para remover partículas de suelo antes y. DE. después de cada muestreo. (Ministerio del Ambiente del Perú).. Transporte de las muestras de suelo.. CA. 2.2.. Las muestras recolectadas fueron colocadas dentro de un cooler a 4°C y. Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo.. BI. BL. IO. TE. se trasladaron al laboratorio de Fitopatología del Departamento de. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.3.. Aislamiento de Trichoderma spp. nativos a partir de las muestras de suelo agrícola recolectados del distrito de Santiago de Cao. Las muestras de suelo, se homogenizaron y se tamizó para separar los. AS. restos vegetales y piedras que tuvieron. Se pesaron 10 g. de suelo cernido. IC. y se vertieron en frascos de vidrio con 90 mL. de agua destilada estéril,. G. siendo la dilución 10-1, luego se tomó 1 mL. de la dilución mencionada y. LO. se agregó en un tubos con 9 mL de agua destilada estéril, realizando. O. diluciones hasta 10-2 y 10-3. Posteriormente, se sembró 0,1 mL de cada. BI. una de las diluciones (10-2 y 10-3) en placas de Petri conteniendo Agar. AS. Papa Sacarosa más antibiótico, se homogenizó con ayuda de una asa de. CI. Drigalski y finalmente se incubó durante siete días a temperatura. CI EN. ambiente (25°C). (Vargas et al., 2009). 2.4.. Obtención de cultivos puros de Trichoderma spp. nativos.. DE. Las colonias de hongos que correspondían a Trichoderma, fueron. CA. sembradas por puntura en tubos de ensayo conteniendo Agar Papa Sacarosa más antibiótico, incubadas a temperatura ambiente (25°C) por. BI. BL. IO. TE. siete días, obteniendo un cultivo puro. (Vargas et al., 2009).. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.5.. Determinación de las características fenotípicas de Trichoderma.. AS. 2.5.1. Determinación de las características macroscópicas. A partir de los cultivos puros de los medios aislados en medio. IC. Agar Papa Sacarosa, donde se observó las características. O. LO. G. culturales de la colonia.. BI. 2.5.2. Determinación de las características microscópicas.. AS. Se procedió a realizar microcultivos, con el propósito de poder. CI. observar las características microscópicas de los hongos aislados.. CI EN. Se colocaron bloques delgados de Agar Papa Sacarosa en láminas portaobjetos que se depositaron dentro de una placa de Petri estéril. Las láminas se colocaron sobre soportes de vidrio. DE. contenidas en la placa de Petri. A partir de los cultivos puros. CA. obtenidos, se sembró por puntura en el centro de cada bloque de. BI. BL. IO. TE. Agar Papa Sacarosa y se cubrió con una lámina cubreobjeto.. Finalmente, se agregó agua destilada estéril dentro de la placa de Petri para dar condiciones de humedad, y se incubó a 25°C por cuatro días. Luego de ese tiempo, se descartaron los bloques de Agar Papa Sacarosa, teniendo cuidado de no dañar el crecimiento del hongo. Se colorearon las muestras con azul de lactofenol y se observaron al microscopio a 40x.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.6.. Selección de los cultivos de Trichoderma spp. nativos. Para realizar la selección de los cultivos nativos de Trichoderma spp. se tomaron en cuenta la velocidad de crecimiento y producción de esporas.. IC. AS. Se seleccionaron los cultivos que presentaban los valores más altos.. G. 2.6.1. Determinación de la velocidad de crecimiento de los cultivos. LO. de Trichoderma spp. nativos.. O. A partir de los cultivos puros, se sembraron por puntura en el. BI. centro de una placa de Petri conteniendo Agar Papa Sacarosa, y. AS. se incubó a 25°C. Los diámetros de las colonias se midieron cada. CI. 24 días hasta que se cubrió el total de la placa de Petri. Luego, se. CI EN. calculó el radio promedio de crecimiento para los mismos días de siembra. Con los radios promedios, se procedió a calcular la velocidad de crecimiento a partir de la ecuación lineal obtenida. CA. DE. para cada cultivo nativo de Trichoderma spp. aislado.. BI. BL. IO. TE. 2.6.2. Determinación del número de esporas de los cultivos de Trichoderma spp nativos. Se sembró cada hongo por puntura, a partir de cada cultivo puro, en el centro de la placa de Petri con Agar Papa Sacarosa y se incubó a 25°C por siete días. Con un sacabocado de 8 mm de diámetro se obtuvo al azar un disco de agar con crecimiento fúngico. Los discos de agar se colocaron en 10 ml de agua destilada y se agitaron para desprender las esporas. Se determinó. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. el promedio de esporas/cm2 de cada hongo aislado para lo cual se empleó una cámara de Neubauer. Este procedimiento se realizó. AS. por triplicado.. Evaluación de la capacidad nematófaga de las cultivos seleccionadas. IC. 2.7.. LO. G. de Trichoderma spp. nativos contra huevos de Meloidogyne sp.. O. 2.7.1. Obtención de huevos de Meloidogyne sp.. BI. Los huevos de Meloidogyne sp. fueron extraídas de raíces. AS. infestadas y con presencia de nódulos de Lactuca sativa. CI. “lechuga”. Luego, se colocaron en un mortero donde se trituraron. CI EN. por unos 10 a 15 segundos aproximadamente. Se pasó a un frasco estéril con hipoclorito de sodio al 2% y agitó durante 5 minutos.. DE. Después de este tiempo, se enjuagaron 5 veces consecutivas con. CA. agua destilada estéril para eliminar los residuos de hipoclorito de. BI. BL. IO. TE. sodio. Se tamizó, recogiendo lo tamizado en un frasco estéril. (Cedeño, 2005; Zavaleta, 1999).. Finalmente, con la ayuda del microscopio se procedió a determinar el húmero de huevos/por mililitro en la cámara de Neubauer, estandarizando la suspensión a una concentración de 105 huevos/mL. (Thorne, 1961).. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.7.2. Evaluación in vitro de la actividad nematofaga de Trichoderma spp. nativo sobre los huevos de Meloidogyne sp. De cada cultivo puro de los cultivos nativos aislados de. AS. Trichoderma spp., se resembró por puntura en tubos de ensayo. IC. conteniendo Agar Papa Sacarosa inclinado, los cuales se. LO. G. incubaron a 25 °C durante siete días.. O. A partir de los cultivos jóvenes de los cultivos nativos, se. BI. obtuvieron suspensiones de esporas, las cuales se sembraron por. AS. superficie en frascos planos con Agar Papa Sacarosa inclinados,. CI EN. CI. que se incubaron a temperatura ambiente (25°C) por siete días.. Luego de este tiempo, se agregó 50 mL. de agua destilada estéril a cada frasco plano y con la ayuda de una asa micológica se. DE. desprendió las esporas del agar. La suspensión se recolectó en un. CA. frasco de vidrio estéril y se ajustó a una concentración de 106. BI. BL. IO. TE. esporas/mL.. Luego, utilizando el método propuesto por Hío (2000), en frascos de vidrio estériles de 10 mL, se colocó 1 mL. de la suspensión de 106 esporas/mL. más 1 mL de una suspensión de 105 huevos de Meloidogyne/mL. Los frascos fueron tapados, para evitar la evaporación y contaminación, y rotulados. Se incubaron a 25 °C por 72 horas, evaluándolos al microscopio cada 24 horas,. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. observando el parasitismo de los cultivos nativos seleccionados de Trichoderma spp. contra los huevos de Meloidogyne sp.. AS. 2.8. Evaluación de los cultivos de Trichoderma spp. nativos sobre huevos. G. IC. de Meloidogyne en condiciones de invernadero.. LO. 2.8.1. Obtención de cultivos puros de cada cultivo nativo de. O. Trichoderma spp.. BI. De los cultivos nativos aisladas de Trichoderma spp., se resembró. AS. por puntura en tubos de ensayo conteniendo Agar Papa Sacarosa,. CI EN. CI. que fueron incubados a 25°C durante siete días.. 2.8.2. Propagación de los cultivos nativos de Trichoderma spp. A partir de los cultivos jóvenes de Trichoderma spp, se sembró. DE. en frascos planos de vidrio, conteniendo Agar Papa Sacarosa. CA. inclinado, que se incubó a temperatura ambiente (25 °C) por siete. BI. BL. IO. TE. días. Luego, se obtuvo una suspensión de conidias de cada frasco.. 2.8.3. Recolección, esterilización y preparación del sustrato. Se recolectó suelo agrícola y se trasladó al Laboratorio de Fitopatología donde se tamizó a través de un cernidor. Luego, se esterilizó en la autoclave a 121°C por 15 minutos. El humus no se esterilizó porque perdería sus propiedades como abono. La preparación del sustrato consistió en colocar 2 Kg de suelo estéril. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. y 1 Kg. de humus en cada bolsa de almácigo, proporción (2:1) y se distribuyeron en 5 bolsas por tratamiento.. superficial. y. siembra. de. de. IC. Lycopersicum esculentum.. semillas. AS. 2.8.4. Tratamiento. G. Las semillas de L. esculentum se lavaron con agua destilada. LO. estéril para eliminar los productos químicos de la certificación de. O. las semillas, luego se desinfectó sumergiéndolas en alcohol al. BI. 70% durante tres minutos y se lavó 10 veces consecutivas con. CI EN. CI. esterilidad.. AS. agua destilada estéril, dejándolas secar en condiciones de. Por último, se determinó el porcentaje de germinación de las semillas. Se sembraron 3 semillas por punto de siembra y a 1 cm.. CA. DE. de profundidad aproximadamente.. BI. BL. IO. TE. 2.8.5. Estandarización de inóculos de Trichoderma spp. nativos. A partir de los frascos planos de vidrio sembrados con Trichoderma spp., se obtuvo una suspensión de conidias y se estandarizó a una concentración de 106 conidias/mL. Este procedimiento se utilizó para cada uno de los hongos a evaluar. Por otro lado, los huevos de Meloidogyne sp. se obtuvieron de acuerdo a la metodología previamente descrita (ítem 4.2.8.1.) ajustándose a 105 huevos/mL.. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.8.6. Inoculación de Meloidogyne sp. Luego de sembrar las semillas de L. esculentum, se inoculó la concentración de la dosis estandarizada de huevos de. AS. Meloidogyne sp (105 huevos/mL). Esto se realizó a los. IC. tratamientos a excepción del grupo control negativo, el cual no se. LO. G. inoculará con Meloidogyne sp.. O. 2.8.7. Inoculación de Trichoderma spp. nativos seleccionados.. BI. Después de 5 días de haber sembrado la semilla de L. esculentum,. AS. se inoculó 30 mL de la suspensión de 106 conidias/ml a cada. CI. tratamiento. A cada tratamiento se realizó 3 inoculaciones más. CI EN. del hongo respectivo, con un intervalo de 10 días entre cada inoculación. Los almácigos se incubó a temperatura ambiental y. DE. en fotoperiodo.. CA. 2.8.8. Inoculación de Oxamyl (Control Positivo).. BI. BL. IO. TE. Se agregó 2 mL del Nematicida a un matraz conteniendo 500 mL de agua destilada, cantidad necesaria para lograr una concentración de 900 ppm. Después de 5 días de haber inoculado Meloidogyne sp. y de haber sembrado de Lycopersicum. esculentum, se realizó la primera y única inoculación del Nematicida.. Todos los sistemas de tratamientos se realizaron en paralelo.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.8.9. Lectura de resultados. Se realizó a los dos meses de haber inoculado la suspensión de huevos de nematodos. Para este proceso, se procedió a extraer las. AS. plantas pertenecientes a cada tratamiento y se analizó el. IC. porcentaje de peso radicular y porcentaje de nodulación radicular. LO. G. de plantas de L. esculentum. (Blakeman y Fokkema, 1982).. O. 2.8.10. Análisis de datos.. BI. Los resultados fueron procesados mediante la prueba de análisis. AS. de varianza Unidireccional (ANOVA) y la prueba de Tukey,. BI. BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. utilizando el software “InfoStat”.. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. III.. RESULTADOS. AS. En la figura 1, 2 y 3, se observa los enfrentamientos in vitro entre los cultivos de. IC. Trichoderma spp, TSCL2, TSCS2 y TSCZ2, respectivamente, frente a los huevos de. G. Meloidogyne sp, a las 24, 48 y 72 horas, notándose un parasitismo mediante la adherencia. BI. O. LO. y penetración de hifas y ruptura de la pared del huevo.. En la figura 4, se observa el porcentaje de nodulación presentes en raíces de las plantas. AS. de L. esculentum var. Río Grande infectadas con huevos de Meloidogyne sp., siendo. CI. mayor el porcentaje en el tratamiento 2, plantas de L. esculentum var. Río Grande. CI EN. inoculadas solo con huevos de Meloidogyne sp., mientras que el menor porcentaje de nodulación se presentó en el tratamiento 3, plantas de L. esculentum var. Río Grande. DE. inoculadas con huevos de Meloidogyne sp. y Nemate® 240 SL y en el tratamiento 4,. CA. plantas de L. esculentum var. Río Grande inoculadas con TSCL2.. TE. En la figura 5, se observa el porcentaje del peso radicular de las plantas de L. esculentum. IO. var. Río Grande infectadas con huevos de Meloidogyne sp., donde el porcentaje es mayor en. BI. BL. las plantas inoculadas con TSCL2. *T: Trichoderma spp., SC: del distrito de Santiago de Cao, L: Lactuca sativa (lechuga), S: Saccharum officinarum (caña de azúcar), Z: Zea mays (maíz).. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. Fig. 1. Observación microscópica (40x) del parasitismo de huevos de Meloidogyne sp. por Trichoderma spp., TSCL2, evaluado a las 24 horas (a, b, c), las 48 horas (d, e, f) y a las 72 horas (g, h, i). Observándose la adherencia y penetración de las hifas y ruptura de pared de los huevos de Meloidogyne sp.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IO. Fig. 2. Observación microscópica (40x) del parasitismo de huevos de Meloidogyne sp.. BL. por Trichoderma spp., TSCS2, evaluado a las 24 horas (a, b, c), observándose la. BI. adherencia de las hifas a los huevos, a las 48 horas (d, e, f) y a las 72 horas (g, h, i), observando la penetración de las hifas a los huevos de Meloidogyne sp.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) BL. IO. TE. CA. DE. CI EN. CI. AS. BI. O. LO. G. IC. AS. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. BI. Fig. 3. Observación microscópica (40x) del parasitismo de huevos de Meloidogyne sp. por Trichoderma spp., TSCZ2, evaluado a las 24 horas (a, b, c), observándose la. adherencia de las hifas a los huevos, a las 48 horas (d, e, f) y a las 72 horas (g, h, i), observándose la penetración de las hifas a los huevos de Meloidogyne sp.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 100%. K. 100%. AS. 80%. 60.28%. 50%. G. 60%. LO. 41.30%. A. D. A. B. 6.32%. 10%. 0%. 0%. T2. T3. C. T4. T5. T6. CI. T1. C. BI. 20%. O. 40% 30%. IC. 65.81%. 70%. AS. Porcentaje De Nodulación. 90%. CI EN. Tratamientos. Fig. 4. Porcentaje de nodulación en raíces de L. esculentum var. Río Grande infectadas con huevos de Meloidogyne sp, cultivadas en bolsas de almácigo en condiciones de. DE. invernadero después de dos meses de inoculación con los tres cultivos de Trichoderma. TE. CA. spp. nativos.. BL. IO. *Medias con una letra en común no son significativamente diferentes (p > 0.05).. T1: L. esculentum var. Río Grande.. BI. T2: L. esculentum + Meloidogyne sp. T3: L. esculentum + Meloidogyne sp. + Nemate® 240 SL.. T4: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCL2. T5: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCS2. T6: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCZ2.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 277.44%. 100%. A. A. C. B. A. C. B. G. A 100%. LO. 150%. 177.84%. IC. 192.22% 200%. AS. 250%. A. A. 65.07%. 72.26%. C A. O. C A. A. 50%. BI. Porcentaje De Peso Radicular. 300%. T1. T2. T3. AS. 0%. T4. T5. T6. CI. Tratamientos. CI EN. Fig. 05. Porcentaje de peso radicular de L. esculentum var. Río Grande infectadas con huevos de Meloidogyne sp, cultivadas en bolsas de almácigo en condiciones de. DE. invernadero después de dos meses de inoculación con los tres cultivos de Trichoderma. CA. spp. nativos.. BL. IO. TE. *Medias con una letra en común no son significativamente diferentes (p > 0.05).. T1: L. esculentum var. Río Grande.. BI. T2: L. esculentum + Meloidogyne sp. T3: L. esculentum + Meloidogyne sp. + Nemate® 240 SL.. T4: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCL2. T5: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCS2. T6: L. esculentum + Meloidogyne sp. + TSCZ2.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IV.. DISCUSIÓN. AS. De acuerdo a los resultados de la presente investigación, se observó un parasitismo en. IC. la evaluación in vitro de la actividad nematófaga por parte de los cultivos de Trichoderma. G. spp. nativos sobre huevos de Meloidogyne sp. notándose la espora adherida y en proceso. LO. de penetración en el huevo a las 24 horas (Fig. 1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 3c), en los. O. tres tratamientos, posteriormente en el rango comprendido de las 48 y 72 horas, se observa. BI. el paulatino crecimiento y ramificación de las hifas tratando de envolver al huevo (Fig.. AS. 1d, 1e, 1f, 1g, 1h, 1i, 2d, 2e, 2f, 2g, 2h, 2i, 3d, 3e, 3f, 3g, 3h, 3i) evitando su eclosión. Sin embargo, como resultado de la comparación, se pude evidenciar que solo en el. CI EN. CI. enfrentamiento con el cultivo TSCL2 se observa la ruptura de la pared del huevo de Meloidogyne sp. (Fig. 1i). Esto indica un claro parasitismo por parte del hongo evaluado,. DE. corroborando lo investigado por Hernández-Ochandía (2015).. CA. Según Khan (2004), la cáscara del huevo es la parte más dura cumpliendo un papel. TE. principal de resistencia a los nematicidas químicos y biológicos. Asímismo, afirma que esta parte contiene una capa interna lipoproteica, una capa media de quitina y una capa. IO. vitelina exterior. Además, Bird et al. (1991) menciona que el principal papel de la capa. BL. de quitina es proporcionar resistencia estructural y proteger la capa lipídica, y la capa. BI. lipoproteica, está compuesta de una serie de membranas de lipoproteínas, siendo más grueso en los polos, ésta capa es la responsable de la impermeabilidad protegiendo al huevo de sustancias químicas nocivas.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Para Sharma et al. (2009), Trichoderma sp. afecta mayormente la capa de quitina de la cutícula de los huevos de nematodos. Según, Bonants (1995) y Sharon et. al. (2007) afirman que la cáscara del huevo y la cutícula del nematodo son los sitios de infección de. AS. los hongos nematófagos, pues éstos colonizan la rizósfera y cuando las hifas se. IC. encuentran con la cáscara se forman apresorios que secretan lisozimas y enzimas como. G. proteasas y quitinasas, las cuales son parte de la actividad antifúngica en la interacción. LO. entre Meloidogyne sp y Trichoderma sp., además, el hongo biocontrolador de nematodos. AS. BI. O. es capaz de cambiar el pH del microambiente para facilitar la actividad enzimática.. De igual modo, se evidenció la destrucción que sufren los huevos de Meloidogyne sp.. CI. por los cultivos de Trichoderma spp. nativos seleccionados, pues este género de hongo. CI EN. parasita a los nematodos fitopatógeno mediante enrollamiento, ganchos y cuerpo de tipo apresorio, que penetran la pared celular por acción hidrolítica de las enzimas quitinasas y. DE. gluconasas (Zeilinger y Omann; 2007). Además, Trichoderma es capaz de producir diferentes antibióticos volátiles y no volátiles; y se ha demostrado que pueden parasitar,. CA. controlar y destruir los fitonematodos (Baños et al; 2010). Es así que, Pérez et. al. (2006),. TE. afirman que Trichoderma sp., es un biorregulador efectivo contra nematodos del género. BL. IO. Meloidogyne por medio de sus toxinas e hifas.. BI. Con respecto al porcentaje de nódulos producidos por Meloidogyne sp. en raíces de L.. esculentum var. Rìo Grande (Fig. 04), en el tratamiento 2 (inoculado solo con Meloidogyne sp) se obtuvo el 100% siendo este el mayor porcentaje, mientras que en el tratamiento3 (inoculado con Nemate® 240SL) se obtuvo 6.32% que es el menor. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. porcentaje y en el tratamiento 4 (inoculado con TSCL2), el resultado fue de un 41.30%. Según el análisis estadístico existe diferencia significativa entre los tratamientos 1 y 3, tratamiento 4, tratamiento 5 y 6 y tratamiento 2 (control positivo) donde solamente se. AS. inoculó Meloidogyne sp., es decir, se puede observar que los cultivos nativos de. IC. Trichoderma spp. nativos afectó considerablemente a los huevos de nematodo. O. LO. G. impidiendo que se forme mayor cantidad de nódulos.. BI. Los cultivos de Trichoderma spp. nativos (TSCL2, TSCS2 y TSCZ2) consiguieron. AS. reducir los nódulos pero estos no fueron muy efectivos como el producto químico Nemate® 240 SL utilizado como control positivo en el tratamiento 3. Estadísticamente,. CI. el tratamiento 3 resultó ser igual que el tratamiento 1 (control negativo, sin inoculación. CI EN. de Meloidogyne sp.). A diferencia del tratamiento 2 (inoculados solo con Meloidogyne sp.), el porcentaje de nódulos formados en las raíces de L. esculentum fue mayor a. DE. comparación del resto de tratamientos evaluados. En relación a los nódulos, las especies Meloidogyne sp. son endoparásitos sedentarios. Los especímenes jóvenes móviles en la. CA. segunda etapa (J2) emergen de los huevos, se mueven hacia las raíces y penetran en ellas. TE. a través de la punta, en las regiones de una penetración previa, o donde se encuentran. BL. IO. pequeñas heridas (Mendoza, Wilson y Colina; 2013).. BI. El nematicida Nemate ® 240 SL, cuyo principio activo es el oxamyl, indica en su ficha. técnica: “Es un nematicida sistémico que rápidamente inhibe la actividad del cuerpo del nematodo, estimulando un movimiento anormal del estilete evitando la habilidad de penetrar en las raíces, además previene y reduce la eclosión de huevos”. Este producto. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. químico disminuyó a un 6.32% la cantidad de nódulos formados a comparación del tratamiento 2, que se tomó como el 100%; a pesar que el producto químico controló mejor la formación de nódulos en las raíces de L. esculentum, se pudo observar en la evaluación. AS. en condiciones de invernadero, que las plantas tratadas con este nematicida químico. IC. tuvieron un menor crecimiento y las raíces de éstas fueron pequeñas y con menos pelos. G. radiculares a diferencia de las plantas inoculadas con los cultivos nativos de Trichoderma. LO. spp., pues estas crecieron en mayor proporción y calidad. Además, en los cultivos nativos. O. disminuyó el porcentaje de nódulos presentes en las plantas de L. esculentum, esto puede. BI. deberse a que Trichoderma, forma una capa protectora en la rizósfera, haciendo una. AS. simbiosis. El hongo se alimenta de los exudados de las raíces y las raíces son protegidas. CI. por el hongo impidiendo además el ingreso del nematodo a la raíz, variando este tipo de. CI EN. protección según la especie de Trichoderma (Howell; 2003).. DE. Por otro lado, con respecto al peso radicular (Figura 5), de Lycopersicon esculentum var. Río Grande disminuye cuando se encuentra infectado por Meloidogyne sp.; esto se. CA. debe a que la formación de huevos implica una mayor cantidad de agua y nutrientes, por. TE. lo tanto, las raíces son más susceptibles volviéndose más delgadas, por lo que, disminuye. BL. IO. la capacidad de formar raíces primarias y secundarias (De Waele y Davide; 2013).. BI. Por otro lado, el porcentaje de peso radicular de L. esculentum var. Río Grande. aumentó significativamente en los tratamientos utilizados (T4, T5 y T6) respecto a las plantas de L. esculentum no inoculadas (T1), plantas de L. esculentum infectadas con Meloidogyne sp. (T2) y plantas de L. esculentum infectadas con Meloidogyne sp con. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..