Caracterización molecular de los genes HSP70: (ecorregión eje cafetero-Colombia)

(1)

CESAR AUGUSTO RAMÍREZ SEGURA

APROBADO

______________________________ Concepción J. Puerta

Directora

______________________________ Manuel Soto

Jurado

______________________________ Manuel A. Patarroyo

Jurado

______________________________ Patricia Cuervo E.

Jurado

______________________________ Marcel Marín Villa

Jurado

______________________________ Gustavo Adolfo Vallejo

Jurado

_____________________________ ,QJULG6FKXOOHU3K' 'HFDQD$FDGpPLFD)DFXOWDG

GH&LHQFLDV

_____________________________

0DQXHO$QWRQLR)UDQFR0'3K'

(2)

PROGRAMA POSTGRADO

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LOS GENES HSP70, -tubulina y ND8

DE Leishmania braziliensis Y DETECCIÓN DE FACTORES PROTEICOS

ASOCIADOS A LA REGULACIÓN DE LOS GENES HSP70

CESAR AUGUSTO RAMIREZ SEGURA

Directora

Concepción Judith Puerta Bula PhD.

Asesor

José María Requena Rolanía

TESIS

Presentada como requisito parcial para optar al título de DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS.

(3)

3

NOTA DE ADVERTENCIA

La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia.

(4)

4

AGRADECIMIENTOS

A toda mi familia, por creer en mí y apoyarme en todo momento, saber que los tengo y que puedo confiar en ellos me impulsa a continuar.

A Colciencias por la financiación del proyecto: Caracterización de factores asociados a secuencias reguladoras de la expresión de la proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70) de Leishmania braziliensis No. 12010N80101103 y la

financiación de mis estudios de Doctorado.

A la Pontificia Universidad Javeriana por la financiación del proyecto: Caracterización de la expresión de los genes alfa tubulina de Leishmania braziliensis No. 12010SK04011200.

A mi director de tesis, la Doctora Concepción J. Puerta B. también director del laboratorio de Parasitología Molecular de la PUJ. Por su orientación y apoyo en el desarrollo del proyecto.

A todos los integrantes del laboratorio de parasitología molecular de la PUJ.

A la Doctora Janneth González del laboratorio de Bioquímica estructural y computacional.

Al Doctor Francisco Bolas director de los laboratorios de Inmunobiología e Inmunomodulación Parasitaria, de la Facultad de Farmacia de la Universidad Complutense de Madrid (España).

A la Doctora María Auxiliadora Dea del Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad CEU-Cardenal Herrera.

Al Doctor José María Requena director del grupo de Regulación de la Expresión Génica en Leishmania del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, de la

(5)

(6)

6

TABLA DE CONTENIDO

1. RESUMEN ... 12

2. ABSTRACT ... 14

3. INTRODUCCIÓN ... 16

4. MARCO TEÓRICO ... 20

4.1. Epidemiologia y aspectos relevantes en la transmisión y control de las leishmaniasis ... 20

4.1.1 Situación de la leishmaniasis cutánea en América Latina ... 22

4.1.2 Insectos vectores ... 25

4.1.3 Reservorios domésticos y silvestres ... 26

4.1.4 Ciclo de transmisión ... 27

4.1.5 Formas clínicas ... 27

4.1.6 Diagnóstico ... 30

4.1.7 Tratamiento ... 32

4.2 Generalidades del parásito Leishmania ... 36

4.2.1 Taxonomía ... 36

4.2.2 Ciclo de vida ... 38

4.3 Genética y biología molecular de Leishmania ... 40

4.3.1 Genoma nuclear ... 40

4.3.2 Regulación de la expresión génica ... 45

4.3.2.1 Regulación a nivel del procesamiento y maduración de los ARNm ... 47

4.3.2.2 Regulación a nivel de la estabilidad de los ARNm ... 47

4.3.2.3 Regulación a nivel de la eficiencia de la traducción ... 49

4.3.3 Genoma mitocondrial y edición del ARN ... 50

4.4 Proteína de choque térmico de 70 kDa (HSP70) ... 53

4.5 -tubulinas ... 56

4.6 Subunidad 8 de la nicotinamida adenín dinucleótido ubiquinona oxidoreductasa (ND8) ... 58

(7)

7

6. OBJETIVOS ... 64

6.1 Objetivo general ... 64

6.2 Objetivos específicos ... 64

6.2.1 Objetivo específico 1 ... 64

7. MATERIALES, MÉTODOS Y RESULTADOS ... 65

Objetivo específico 1 ... 65

7.1 Artículo No. 1 Identification of the HSP70-II gene in Leishmania braziliensis HSP70 locus: genomic organization and UTRs characterization ... 67

7.2 Artículo No. 2 Alpha tubulin genes from Leishmania braziliensis: genomic organization, gene structure and insights on their expression ... 79

7.3 Artículo No. 3 Secuencia parcial del genoma del maxicírculo de Leishmania braziliensis, comparación con otros tripanosomátidos ... 92

7.4 Artículo No. 4 Evidence of RNA editing in Leishmania braziliensis promastigotes ... 115

7.5 Artículo No. 5 Identification of HSP70-RNA messenger interacting proteins in Leishmania braziliensis ... 125

8. DISCUSIÓN GENERAL ... 178

8.1 Organización genómica ... 178

8.1.1 Genes nucleares ... 178

8.1.2 Gen mitocondrial ... 184

8.2 Estructura y expresión de los ARNm ... 185

8.2.1 Genes nucleares ... 185

8.2.2 Gen mitocondrial ... 198

8.3 Regulación de la expresión génica y factores proteicos asociados a las UTR de los genes HSP70 de L. (V.) braziliensis ... 203

9. PRINCIPALES HALLAZGOS... 224

(8)

8

11. PERSPECTIVAS ... 228

12. REFERENCIAS ... 230

13. ANEXOS ... 255

13.1.ANEXO 1. FIGURAS SUPLEMENTARIAS ARTICULO No. 1 ... 255

13.2.ANEXO 2. FIGURAS SUPLEMENTARIAS ARTICULO No. 2 ... 258

13.3. ANEXO 3. FIGURAS SUPLEMENTARIAS ARTICULO No. 4 ... 259

13.4.ANEXO 4. POSTER: Evento: XIV Congreso Colombiano de Parasitología y Medicina Tropical ... 260

13.5.ANEXO 5. POSTER: Primer Congreso Colombiano de Biología Computacional. 13.6.ANEXO 6. POSTER: XX CONGRESO LATINOAMERICANO DE PARASITOLOGÍA Y XV CONGRESO COLOMBIANO DE PARASITOLOGÍA Y MEDICINA TROPICAL ... 264

13.7.ANEXO 7. POSTER: I Jornada de Investigaciones Grupo de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Ciencias _– PUJB ... 266

13.8.ANEXO 8. RESUMEN: XX CONGRESO LATINOAMERICANO DE PARASITOLOGÍA Y XV CONGRESO COLOMBIANO DE PARASITOLOGÍA Y MEDICINA TROPICAL ... 268

13.9.ANEXO 9. RESUMEN: XX CONGRESO LATINOAMERICANO DE PARASITOLOGÍA Y XV CONGRESO COLOMBIANO DE PARASITOLOGÍA Y MEDICINA TROPICAL ... 271

13.10. ANEXO 10. RESUMEN: II Jornada de Investigaciones Grupo de Enfermedades Infecciosas, Facultad de Ciencias _– PUJB ... 275

(9)

9 LISTA DE ABREVIATURAS Y SIMBOLOS

ADN Ácido desoxirribonucleico.

ADNc ADN copia.

ADNk ADN del kinetoplasto.

PCR reacción en cadena de la polimerasa

RFLP Polimorfismos en longitud de los fragmentos de restricción

ARN Ácido ribonucleico.

ARNm ARN mensajero.

ARNi ARN de interferencia

ARNg ARN guías

ARNr ARN ribosomales

ARNdc ARN de doble cadena

ARNpol II ARN polimerasa II

SL Secuencia líder

LC leishmaniasis cutánea

LCA leishmaniasis cutánea Americana

LCL leishmaniasis cutánea localizada

LR leishmaniasis cutánea recidiva

LD leishmaniasis diseminada

(10)

10

LMC leishmaniasis mucocutanea

LV leishmaniasis visceral

LCD leishmaniasis cutánea difusa

PGC grupos de genes policistrónicos

UTR secuencias transcritas pero no traducidas

CPB cisteín proteasa B

CAT cloranfenicol acetiltransferasa

kDa kilodalton

mg miligramos

g microgramos

HSP70 proteína del choque térmico de 70 kDa

HSP83 proteína del choque térmico de 83 kDa

MSPL principal proteasa de superficie

CHX cicloheximida

PFR2 paraflagellar rod

PRE elemento regulador de PFR

RPS12 proteína ribosomal S12

CyB apocitocromo b

COI citocromo C oxidasa subunidad I

(11)

11 COIII citocromo C oxidasa subunidad III

NADH Nicotinamida adenín dinucleótido

ND subunidad de la nicotinamida adenín dinucleótido deshidrogenasa

MURF marcos abiertos de lectura del maxicírculo

CAD ADNasa activada por caspasas

ATP Adenosín trifosfato

ADP Adenosín difosfato

PFE electroforesis de campo pulsado

CoQ coenzima Q

pb pares de bases

aa aminoácidos

DIRE degenerate ingi/L1Tc-related elements

SIDER Short Interspersed Degenerated Retroposons

SLACS Spliced Leader Associated Conserved Sequence

CZAR cruzi-associated retrotransposon

(12)

12

1. RESUMEN

Leishmania es el agente etiológico de la leishmaniasis, entidad caracterizada por

un amplio espectro de manifestaciones clínicas incluyendo afecciones cutáneas, mucocutáneas y viscerales. En el mundo, más de 350 millones de personas están en riesgo de contraer leishmaniasis y anualmente se reportan 2 millones de casos nuevos. En América Latina, la leishmaniasis es endémica en 22 países, siendo

Leishmania Viannia braziliensis el principal agente causante de la leishmaniasis

mucocutánea.

En su ciclo de vida, Leishmania se expone a diversas temperaturas y

recursos nutricionales que inducen cambios en su expresión génica, necesarios para adaptarse al nuevo ambiente. Así, durante la transición de promastigote (insecto-vector) a amastigote (hospedero mamífero), se requiere de la actividad chaperona de la proteína de choque térmico de 70 kDa, de la modulación de la expresión de componentes del citoesqueleto como las -tubulinas y de la actividad oxido-reductasa de enzimas como la subunidad 8 de la nicotinamida adenín dinucleótido deshidrogenasa (ND8).

Dado que la regulación de la expresión génica en tripanosomátidos opera a nivel post-transcripcional, el conocimiento de la arquitectura genómica es vital para entender los mecanismos de control génico. En este trabajo, mediante ensayos de

“Southern blot”, “Northern blot” y RT-PCR se determinó la organización y

expresión de los genes HSP70, -tubulina y ND8 de L. (V.) braziliensis. En primer

lugar, se encontró la existencia de dos tipos de genes HSP70, los cuales difieren

únicamente en su región 3´ no traducida (3´ UTR). Así, existen 6 copias del gen HSP70-I y una única copia del gen HSP70-II, localizada al final del tándem en el

(13)

13 dispuestas en tándem (cromosoma 13), siendo, al igual que para los genes HSP70, el último gen divergente en su región 3´ UTR. De interés, la abundancia

de los mensajeros -tubulina disminuye a 35°C, efecto dependiente de la síntesis

proteica. Consecuentemente, se postula la existencia de un factor proteico implicado en la desestabilización de estos mensajeros. Del gen ND8, se determinó

su presencia en los maxicírculos del parásito y si bien se logró confirmar su expresión, solo se detectaron transcritos parcialmente editados correspondientes o bien a transcritos inmaduros de las proteínas mitocondriales canónicas no funcionales o a transcritos con un patrón alterno de edición. De resaltar, se reportó por vez primera, la edición del ARNm en L. (V.) braziliensis.

Dado que la regulación post-transcripcional ocurre a través de interacciones entre factores proteicos y elementos ubicados en las regiones 5´ UTR y 3´ UTR

del ARNm, se procedió a la identificación de proteínas de unión a las UTR de los

mensajeros HSP70. Lo anterior, con el fin de contribuir al descubrimiento de

nuevas dianas para el diseño de fármacos. Así, mediante ensayos de “pull down”

combinados con proteómica se identificaron 52 proteínas. Algunas de éstas, como los factores de elongación 1 y 2, los putativos factores de iniciación 3.k, 4, 5 y las proteínas putativas de unión a poli-(A) 2 y 3, se relacionan con el metabolismo del ARN y la traducción de proteínas. También, se identificaron proteínas, hasta ahora reportadas como hipotéticas, que presentan motivos de unión a ARN. Otras proteínas aparentemente no relacionadas con el metabolismo del ARN, también fueron identificadas, las cuales pueden corresponder a proteínas inespecíficas (resultado del ruido de fondo de la técnica) o a proteínas que de forma similar a las

denominadas “moonlight” cumplen distintas funciones dependiendo de su

localización celular. En conclusión, se identificaron diversas proteínas que de acuerdo con su blanco y temperatura, constituyen un punto de partida para estudiar su participación en la expresión de los genes HSP70-I y II de L. (V.) braziliensis y por ende, en la virulencia y supervivencia del parásito en el

(14)

14

2. ABSTRACT

Leishmania is the etiologic agent of the leishmaniasis, characterized for a broad

spectrum of clinical manifestations including cutaneous, mucocutaneous and visceral manifestations. More than 350 million people are at risk of contracting leishmaniasis around the world and yearly are reported 2 million of new cases. In America Latina, the leishmaniasis is endemic in 22 countries, being Leishmania Viannia braziliensis the main causative agent of the mucocutaneous leishmaniasis.

In its life cycle, Leishmania is exposed at several temperatures and nutritional

sources which induce changes in its genetic expression, required for adaptation to the new environment. Thus, during the transition of promastigote (insect vector form) to amastigote (mammalian host form), are required the chaperone activity of the 70 kDa heat shock protein (HSP70), modulation of the expression of cytoskeletal components as -tubulin and oxidoreductase activity of the mitochondrial enzymes as nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit 8 (ND8).

Since the regulation of genetic expression in trypanosomatids operates at the posttranscriptional level, the knowledge of the genomic architecture is basic to understand the genetic control mechanism. In this work, through southern blot, northern blot and RT-PCR assays the organization and expression of the HSP70, -tubulin and ND8 genes from L. (V.) braziliensis was determined. First, it was

found that there are two types of HSP70 genes, which differ only in its 3´ untranslated region (3´ UTR). Thus, there are 6 copies of HSP70-I gene and only

one copy of HSP70-II gene, the latter localized at end of the tandem on

chromosome 28. Strikingly, the levels of both types of mRNAs do not are affected by heat shock. Findings that suggest the existence of a control at the translational level, regulating the gain of protein under heat shock condition. In regard to the  -tubulin genes, as for HSP70 genes, there exist several copies tandemly organized

(15)

15 messenger’s decreases when parasites are incubated at 35°C, and this effect was found to be dependent on protein synthesis. Consequently, it was postulated the existence of a protein factor implicated in destabilizing these messengers. Of ND8 gene, it was determined its presence in the parasite maxicircles and evidence of its expression was obtained; however, only partially edited transcripts, corresponding to immature transcript, or transcripts with alternative edition pattern were detected.

Of note, it was reported for the first time the mRNA editing in L. (V.) braziliensis.

Since posttranscriptional regulation occurs through interactions between protein factors and elements on 5´ and 3´ UTR, we proceeded to the identification

of UTR-binding proteins with affinity to the HSP70 messenger. Thus, through pull

down assays combined with proteomic approaches, 52 proteins were identified. Some of these, as elongation factor 1a and 2, the putative initiation factors 3.k, 4a and 5, the putative poly A binding proteins 2 and 3, are related to RNA metabolism and protein translation. Also proteins until now annotated as hypothetical were identified in L. (V.) braziliensis protein extracts; remarkably, they contains RNA

binding motifs. Other proteins apparently no related to RNA metabolism also were identified. At present, we do not know whether they correspond to unspecifically bound proteins or they are “moonlight” proteins, which meet different functions

depending of its cellular location. In summary, several proteins were identified on the basis of their specific RNA association and their dependence on the parasite growth temperature. This work represents a starting point for future studies leading to analyze their participation in the regulation of gene expression of HSP70-I and II

genes from L. (V.) braziliensis, and hence in virulence and survival of parasite on

(16)

16

3. INTRODUCCIÓN

Leishmania es el agente etiológico de la leishmaniasis, parasitosis que abarca

distintas manifestaciones clínicas que incluyen desde lesiones cutáneas de auto curación (LC), lesiones mucosas (LM), lesiones mucocutáneas (LMC) necrotizantes, lesiones nodulares múltiples en piel conocidas como leishmaniasis cutánea difusa (LCD) hasta afecciones viscerales (LV), frecuentemente de evolución fatal (1). Más de 350 millones de personas se consideran en riesgo de contraer leishmaniasis en 98 países de los 5 continentes y anualmente se reportan alrededor de 2 millones de nuevos casos (2). En América Latina, la LC y LMC constituyen un problema de salud pública descuidado, endémico en 22 países, en donde las especies del subgénero Leishmania Viannia causan la mayoría de

casos de LC, siendo L. (V.) braziliensis el principal agente etiológico de la LMC (3).

Los antimoniales pentavalentes constituyen el tratamiento convencional contra la leishmaniasis (4), seguido por anfotericina B, paromomicina, pentamidina y miltefosina. Sin embargo, la elevada toxicidad y el incremento en los casos de resistencia frente a su uso (5), aparte de otras consideraciones como el costo y la disponibilidad en el caso de la anfotericina B y la miltefosina (6-8), plantean la necesidad urgente de nuevos enfoques terapéuticos basados en el descubrimiento de nuevos blancos parasitarios (5, 7, 9).

Durante su ciclo de vida, las especies de Leishmania que infectan al hombre

(17)

17 El cambio de temperatura, de ambiente oxido-reducción y de recursos nutricionales causados por la entrada en hospederos mamíferos, desencadena una serie de respuestas adaptativas a nivel de la expresión génica del parásito (11), que responden a necesidades específicas como: I) prevenir la generación de proteínas disfuncionales debido al estrés térmico, donde la proteína del choque térmico de 70 kDa (HSP70) juega un papel central como chaperona contribuyendo con la generación de proteínas correctamente plegadas; II) responder a los cambios morfológicos que debe sufrir el parásito en la transformación de promastigote a amastigote, proceso que es dependiente de componentes básicos del citoesqueleto como las -tubulinas y III) afrontar el desafío que representa la supervivencia y la reproducción en las células del hospedero, adaptando su metabolismo energético al uso de nuevos recursos nutricionales y condiciones de óxido-reducción, en donde se pueden encontrar implicadas diferentes subunidades y componentes de la cadena respiratoria mitocondrial como el gen de la subunidad 8 de la nicotinamida adenín dinucleótido deshidrogenasa (ND8).

Por otro lado, debido a la falta de promotores para la ARNpol II en tripanosomátidos, los genes se transcriben constitutivamente como grupos de genes policistrónicos (PGC por su sigla en inglés) (12, 13). Así, el control de la expresión génica en Leishmania depende de mecanismos post-transcripcionales

relacionados con el procesamiento, estabilidad y traducción del ARNm. Por lo anterior, el entendimiento de la regulación génica en tripanosomátidos parte del conocimiento de la organización genómica de los genes de interés. Si bien el genoma de L. (V.) braziliensis se encuentra disponible, este no incluye la

determinación de las secuencias transcritas pero no traducidas (UTR) y en el caso

de genes repetidos como los genes HSP70 y -tubulina, el número de copias

(18)

18 En relación a los genes HSP70, en otras especies de Leishmania se conoce

que éstos se organizan en tándem y que existen dos tipos de genes que se diferencian únicamente en su región 3´ UTR (HSP70-I y HSP70-II), sin embargo,

este tipo de organización hasta el momento no ha sido descrita para L. (V.) braziliensis (14). Con respecto a los genes -tubulina, en Leishmania major se

sabe de la existencia de 12 copias localizadas en el cromosoma 13. En L. (V.) braziliensis, por ejemplo, el genoma muestra una agrupación de tan solo 3 copias

(dos enteras y una truncada), delimitada en el 5´ por un fragmento de longitud y secuencia desconocida que se localizan en el cromosoma 13. Una copia truncada adicional de estos genes se reporta en el cromosoma 29. En relación a los genes

ND8, se conoce que en Leishmania tarentolae, Leishmania donovani, L. (L.) amazonensis y L. (L.) major, estos se localizan en los maxicírculos del genoma

mitocondrial (15-19). Así, en este trabajo se determinó la organización genómica de los genes codificantes para las proteínas HSP70, -tubulina y ND8 de L. (V.) braziliensis.

Dado que el conocimiento de la expresión génica es vital para entender la biología del parásito y su interacción con el hospedero, paralelamente, en este trabajo, se determinó la expresión de todos los genes en estudio en promastigotes de L. (V.) braziliensis mantenidos en condiciones normales de crecimiento y luego

de exposición a choque térmico (35 °C, por tratarse de una especie causante de LC y LMC).

Debido a la dependencia de los mecanismos de regulación postranscripcional que tienen los tripanosomátidos, en estos parásitos se ha elucidado la existencia de factores proteicos que en conjunto con elementos reguladores situados en las regiones UTR del ARNm blanco, modulan la expresión

génica en estos parásitos (11, 13, 20).

Por otro lado, se ha demostrado que la proteína HSP70 de L. (L.) infantum es

(19)

19 amastigotes, tanto in vitro como in vivo (21). Es más, la deleción del gen HSP70-II

disminuye la capacidad infectiva del parásito y por ende, la patología ocasionada en diferentes modelos animales (21, 22). Por tanto, dada la importancia de la proteína HSP70 para la virulencia y supervivencia del parásito, en este trabajo, se identificaron factores proteicos que interactúan con las regiones UTR de los

transcritos HSP70 I y II, potencialmente implicados en la regulación de la

(20)

20

4. MARCO TEÓRICO

4.1. Epidemiologia y aspectos relevantes en la transmisión y control de las leishmaniasis

Los protozoos parásitos del género Leishmania (Ross, 1903) son los agentes

patógenos responsables de la leishmaniasis. En la naturaleza, todas las especies de Leishmania se transmiten cuando flebótomos infectados (Diptera: Psychodidae,

de los géneros Lutzomyia y/o Phlebotomus ) se alimentan de sangre, inoculando

también promastigotes metaciclicos al mamífero (23). Estas parasitosis se han generalizado en todos los continentes excepto en la Antártida (1). Leishmania se

encuentra en ecosistemas extremadamente diversos y es capaz de infectar una amplia variedad de mamíferos. En los seres humanos, la mayoría de las infecciones por Leishmania conducen a casos asintomáticos (1). Sin embargo,

cuando la enfermedad se presenta, se expresa un conjunto de manifestaciones clínicas que incluyen desde lesiones cutáneas de auto curación (LC) hasta la mortal infección visceral (LV) (1, 24).

El área de distribución de las leishmaniasis ha sido ampliamente subdividida

en “Nuevo Mundo” (Las Américas) y “Viejo Mundo” (África, Asia y Europa). Las especies de Leishmania se asocian generalmente con una u otra de las dos

subdivisiones. Todas las especies del subgénero Leishmania Viannia fueron

aisladas en el “Nuevo Mundo”, mientras que la mayoría del subgénero Leishmania Leishmania se aislaron del “Viejo Mundo”, a excepción de las especies del

complejo Leishmania (L.) mexicana, Leishmania (L.) hertigi y Leishmania (L.) deanei que se encuentran sólo en el “Nuevo Mundo” y Leishmania (L.) infantum

que se encuentra tanto en el “Viejo” como en el “Nuevo Mundo” (1). En la Tabla 1 se resumen las especies de Leishmania que causan enfermedad al hombre y

(21)

21 Tabla 1. Especies de Leishmania que infectan al hombre.

Adaptado de Reithinger y colaboradores, 2007 (25); Oddone y colaboradores, 2009 (3).

Aproximadamente, entre 0,2 y 0,4 millones de casos de LV y 0,7 a 1,2 millones de casos de LC se producen cada año. Más del 90% de los casos mundiales de LV se producen en sólo seis países: India, Bangladesh, Sudán,

patología Principal

clínica

Ciclo de

transmisión Distribución geográfica

Leishmanias del Nuevo

Mundo

L. Viannia braziliensis LC, LMC Zoonótico Sur América, Centro _{América y México}

L. Viannia panamensis LC, LMC Zoonótico Norte de Sur América y _{Sur de Centro América}

L. Viannia guyanensis LC, LMC Zoonótico Sur América

L. Viannia peruviana LC Zoonótico Perú

L. Viannia lainsoni LC Zoonótico Sur América

L. Viannia colombiensis LC Zoonótico Norte de Sur América

L. Leishmania amazonensis LC, LCD Zoonótico Sur América

L. Leishmania mexicana LC, LCD Zoonótico Centro América, _{México y USA}

L. Leishmania pifanoi LC Zoonótico Sur América

L. Leishmania venezuelensis LC Zoonótico Norte de Sur América

L. Leishmania garnhami LC Zoonótico Sur América

Leishmanias del Viejo Mundo

L. Leishmania aethiopica LC, LCD Zoonótico Etiopia y Kenya

L. Leishmania killicki LC Zoonótico Norte de África

L. Leishmania tropica LC antroponótico

Asia Central, medio Este, sur este y parte

del Norte de África

L. Leishmania donovani LV antroponótico África, Centro y sureste _{de Asia}

L. Leishmania major LC Zoonótico Asia Central, Norte y _{Este de África}

Leishmanias del Nuevo y

Viejo Mundo

L. Leishmania infantum LC, LV Zoonótico

Europa, Norte de África, Centro y Sur

(22)

22 Sudán del Sur, Brasil y Etiopía, registrándose de 20.000 a 40.000 muertes anuales (2). La leishmaniasis cutánea se distribuye más ampliamente, con cerca de un tercio de los casos producidos en cada una de las siguientes tres regiones: Las Américas, la cuenca del Mediterráneo y Asia occidental (desde el Medio Oriente hasta Asia Central). Los diez países con las estimaciones más altas de casos son: Afganistán, Argelia, Colombia, Brasil, Irán, Siria, Etiopía, Sudán del Norte, Costa Rica y Perú, representando en conjunto el 70 a 75% de la incidencia mundial estimada (2). A pesar del gran impacto que tiene a nivel mundial, la leishmaniasis es considerada como enfermedad olvidada, afectando en gran medida a la población más pobre, sobre todo en los países en desarrollo (26). Por ser L. (V.) braziliensis el objeto de este estudio, a continuación se presenta el panorama de

la LC y la LMC en América Latina.

4.1.1 Situación de la leishmaniasis cutánea en América Latina

En América Latina, la leishmaniasis cutánea americana (LCA) es causada principalmente por especies del subgénero Leishmania Viannia. Las especies más

frecuentes son L. (V.) braziliensis, L. (V.) panamensis, L. (V.) peruviana, L. (V.) guyanensis y L. (V.) lainsoni (27, 28).

En México, los agentes causantes de la LCA son L. (L) mexicana y L. (V.) braziliensis (29, 30). Esta enfermedad se ha extendido por 17 estados de México,

incluyendo Campeche, Chiapas, Coahuila, Jalisco, Michoacán, Nayarit, Nuevo León, Oaxaca, Tamaulipas, Quintana Roo, Tabasco, Veracruz, Yucatán, Durango y Sinaloa. Por su parte, la LMC se ha reportado en Tabasco y Chiapas (30-33).

En Venezuela, las principales especies causantes de leishmaniasis cutánea son L. (L.) mexicana y L. (V.) braziliensis (34). También se ha encontrado a L. (L) venezuelensis pero se sugiere que es una variante de L. (L.) mexicana y que la

(23)

23 En Ecuador, la enfermedad es endémica en la mayoría de provincias costeras de la región Pacífica, las tierras bajas amazónicas y algunos valles interandinos. Mientras que la LC se encuentra en todo el Ecuador, la LMC parece estar restringida a la región amazónica. L. (V.) panamensis es la especie más

frecuentemente identificada en la región del Pacífico y se ha asociado con varias formas clínicas de la enfermedad cutánea (LC). En el foco amazónico la leishmaniasis mucocutánea se asocia con L. (V.) braziliensis y la variante papular

de LC conocida como Uta, se encuentra en el altiplano andino y se relaciona principalmente con L. (L.) mexicana (36).

El 70% de la región del Perú se ve afectada por la leishmaniasis, siendo el 96% de los casos causados por tres especies: L. (V.) braziliensis, L. peruviana y L. guyanensis (28, 37).

L. (V.) braziliensis predomina en casi todo el territorio de Brasil, incluyendo la

región Amazónica. Algunos estudios reportan a L. (V) braziliensis Algunos en

aproximadamente el 55% de los casos de leishmaniasis cutánea LC en el Amazonas y en aproximadamente el 95% de los casos de LC en el resto del país tanto en zonas urbanas como rurales (38-43).

Bolivia tiene la mayor incidencia de LCA en América Latina (44), siendo endémica en seis a siete de los nueve departamentos (44, 45). Entre 2001 a 2006 se detectaron 2909 casos, de los cuales 2.488 (85,5%) correspondieron a leishmaniasis cutánea localizada (LCL) y 421 (14,5%) a LMC (46). En la actualidad, la leishmaniasis muestra un patrón creciente en las tierras bajas tropicales y subtropicales que son aptas para la agricultura y la ganadería (45). Estudios previos han descrito una compleja distribución de diferentes especies de

Leishmania en la zona endémica del departamento de La Paz: L. (V.) braziliensis, L. (L.) chagasi, L. (L.) amazonensis y L. (V.) lainsoni (45).

(24)

24 0,2 casos/10.000 habitantes/año) y desde entonces se inició un período interepidémico con pequeños focos dispersos en toda la zona endémica (150-370 casos). Tres especies de Leishmania se han aislado de pacientes con LCA en

Argentina: L. (V.) braziliensis, L. (L.) amazonensis y L. (V.) guyanensis. De éstas, L. (V.) braziliensis ha sido el principal agente asociado con brotes de LCA y LMC

(47).

En Colombia, existen tres ciclos de transmisión de la leishmaniasis cutánea: la leishmaniasis cutánea zoonótica de transmisión selvática, la leishmaniasis cutánea zoonótica de transmisión peridoméstica y urbana (48).

Tabla 2. Número de casos de leishmaniasis reportados en Colombia durante el período 2000 – 2007.

Forma clínica

Años

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

Cutánea 3219 3154 5464 9118 11096 17893 8296 3166

Mucosa 236 64 88 70 102 61 107 53

Visceral 443 37 68 120 100 62 44 36

Tomado de Peñuela y Sánchez, 2007 (48).

A continuación se citan algunos reportes de caso en el país: En el año 2004 se reportaron 11.298 casos de leishmaniasis en todas sus formas; en el 2005 fueron informados 18.097 casos y en el año 2006 se reportaron 8.447, de los cuales 8.295 (98,2%) correspondieron a LC, ver Tabla 2 (48).

En el 2008 se reportó que L. (V.) guyanensis fue el principal agente etiológico

(94,6% de los casos) de una epidemia de LC en tres municipios del Tolima en el centro del país (49). En el departamento de Santander se reportaron dos casos de pacientes procedentes de zonas endémicas con LCD generados por una cepa de

L. (V.) panamensis (50). En la zona urbana de Cartagena se detectó en el 2012 un

(25)

[image:25.612.143.547.136.337.2]

25

Tabla 3. Departamentos con mayor número de casos de leishmaniasis cutánea y mucocutánea en Colombia, semanas epidemiológicas 1 a 40 de 2011.

Tomado de Boletín Epidemiológico semana 40 (52)

En el año 2011 hasta la semana epidemiológica 40 se notificaron 6.102 casos de leishmaniasis distribuidos así: 5.967 casos de LC, 113 de LMC y 22 casos de LV. El 70% de la notificación de LC y LMC procedió de los departamentos de Antioquia, Meta, Guaviare, Caquetá, Nariño, Putumayo, Vaupés y Santander, ver Tabla 3 (52).

4.1.2 Insectos vectores

Los vectores de Leishmania son insectos pequeños del orden Diptera, que

pertenecen a la subfamilia Phlebotominae, comúnmente llamados flebótomos o

moscas de arena. Sólo la hembra es hematófaga ya que necesita alimentarse de sangre para completar el desarrollo de los huevos (53, 54).

Las especies de flebótomos responsables de la transmisión de Leishmania

varían de acuerdo con la región y pueden transmitir diferentes especies de

Leishmania (55-57). De los seis géneros de flebótomos descritos, sólo dos están

implicados en la transmisión del parásito: Phlebotomus del “Viejo Mundo”, dividido

Procedencia Leishmaniasis cutánea Leishmaniasis mucosa

Antioquia 1266 17

Meta 616 18

Guaviare 568 15

Caquetá 393 13

Nariño 358 6

Putumayo 323 3

Santander 302 6

(26)

26 en 12 subgéneros y Lutzomyia del “Nuevo Mundo”, dividido en 25 subgéneros. De

las 500 especies de flebotomínos conocidas, sólo 31 han sido identificadas como vectores de especies de Leishmania y 43 como probables vectores (55, 56, 58).

Algunos flebótomos se consideran vectores restringidos ya que solo transmiten determinadas especies del parásito, como Phlebotomus papatasi y Phlebotomus sergenti que son los vectores de L. (L.) major (53) y Leishmania (L.) tropica, respectivamente (54). Por el contrario, otras especies como Lutzomyia longipalpis (permite el desarrollo de los subgéneros Leishmania Leishmania y Leishmania Viannia) (59), Phlebotomus argentipes (permite el desarrollo de L. (L.) donovani, L. (L.) amazonensis y L. (L.) major) (53) y Phlebotomus halepensis

(permite el desarrollo de L. (L.) major y L. (L.) tropica) (60) son capaces de

desarrollar infecciones transmisibles cuando se infectan con varias especies de

Leishmania y son conocidos como vectores permisivos (53, 54, 60-63).

4.1.3 Reservorios domésticos y silvestres

El perro puede hospedar tanto a Leishmanias causantes de LV como a las

responsables de la LC, aun en infecciones mixtas (64, 65). Otros animales domésticos como el caballo (66) y los gatos también se han encontrado infectados con Leishmania (67). En la naturaleza, pequeños mamíferos silvestres

frecuentemente se encuentran infectados con parásitos del subgénero Leishmania Viannia, entre los cuales están: ratas de agua (Squamipes nectomys), ratas

negras (Rattus rattus), ratones de hierba (Bolomys lasiurus), ratones de pantano

(Holochilus scieurus), ratones de campo (Akodon arvieuloides), oposums lanudos

(Marmosa sp.) y zarigüeyas comunes (Didelphis albiventris). Aunque muchos

mamíferos se han encontrado infectados de manera natural, ninguno de los estudiados cumple completamente los requisitos para ser definido como el principal reservorio de las especies de Leishmania Viannia causantes de LCA y

(27)

27

4.1.4 Ciclo de transmisión

La mayoría de las infecciones por Leishmania son de origen zoonótico, aunque se

conocen algunos casos de transmisión de L. (L.) donovani de humano a humano

(1). Se reconocen 3 ciclos de transmisión diferentes: (i) un ciclo primitivo o silvestre (transmisión accidental a humanos, que se produce en focos silvestres), por ejemplo, L. (V.) braziliensis, (ii) un ciclo secundario o peridoméstico (el

reservorio es un animal doméstico o peridoméstico y el parásito se transmite a los seres humanos por vectores antropofílicos), por ejemplo, L. (L.) infantum y (iii) un

ciclo terciario, estrictamente antroponótico, en el que el reservorio animal ha desaparecido (o no ha sido identificado) y los insectos vectores son totalmente antropofílicos, por ejemplo L. (L.) donovani (69).

4.1.5 Formas clínicas

Las infecciones con Leishmania pueden producir una amplia gama de patologías,

desde portadores asintomáticos (individuos infectados sin manifestaciones clínicas) y lesiones cutáneas de autocuración a los casos más graves, como la forma visceral. Cuando los seres humanos han sido picados por un insecto vector infectado, pueden desarrollar la leishmaniasis o no. La tasa de portadores asintomáticos, no se conoce con precisión, pero diferentes estudios han sugerido que puede ser mayor de lo esperado. Por ejemplo, en las Islas Baleares, ADN de

L. (L.) infantum fue amplificado por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del

22% de los donantes de sangre (70). Portadores asintomáticos de especies causantes de LV se han identificado en Brasil (71), el sur de Francia (72) y la India (73). La infección subclínica con especies del subgénero Leishmania Viannia

también ha sido reportada (74, 75).

(28)

28 hospedero. La lesión inicial ocurre en el sitio de la picadura del vector en forma de una mácula, que a partir de 2 semanas a 3 meses en adelante se puede presentar como una pápula pequeña, pruriginosa y eritematosa o como un nódulo. La lesión también puede comprometer ganglios linfáticos de drenaje y convertirse en un granuloma más adelante que puede progresar a engrosamiento de la piel en placas (76, 77). Esta lesión puede resolverse espontáneamente o puede convertirse en una úlcera característica. Algunas lesiones pueden transformarse en otras formas crónicas de la enfermedad. Aunque hay evidencias que sugieren una correlación entre las características clínicas y las especies de Leishmania (78,

79), esta relación no está claramente definida, sobre todo en regiones en las que conviven muchas especies diferentes del parásito (76).

Con base en sus diferentes presentaciones clínicas, las leishmaniasis cutáneas se clasifican como leishmaniasis cutánea localizada (LCL), leishmaniasis cutánea recidiva (LR), leishmaniasis diseminada (LD), leishmaniasis cutánea difusa (LCD), mucocutánea (LMC) y La leishmaniasis cutánea Post-kala-azar (PKDL) (76).

La LCL es la forma más frecuente con 1 a 10 lesiones que se localizan en áreas expuestas del cuerpo. El tipo de lesión más común se caracteriza por ser una úlcera indolora, rosada, redonda, bien delimitada con bordes elevados, una base indurada y un fondo limpio, donde puede aparecer una costra central que sangra. Resolución espontánea, seguida de una cicatriz hipopigmentada, fina y lisa puede ocurrir en algunos casos (76).

La LR, más frecuente en el “Viejo Mundo”, en donde es asociada a la infección por L. (L.) tropica, se caracteriza por una lesión activa en o cerca del

borde de una lesión previa ya cicatrizada. Se desarrolla después de un período de tiempo variable con o sin tratamiento. En el “Nuevo Mundo”, la LR se asocia con L. (V.) braziliensis y L. (L.) amazonensis en Brasil (80) y L. (V.) panamensis en

(29)

29 La LD se caracteriza por la aparición de múltiples lesiones pleomórficas (10-300) en 2 o más áreas no contiguas y expuestas del cuerpo, probablemente causadas por propagación hematógena o linfática. Las lesiones son acneiformes, ulceradas y papulares. La mucosa se ve afectada en el 29% de los casos. En Brasil, esta presentación se atribuye a L. (V.) braziliensis (82).

La LCD es una forma anérgica de leishmaniasis cutánea en la cual los pacientes presentan baja respuesta inmune celular (83), por lo que las lesiones están llenas de parásitos. La LCD es una enfermedad rara que se presenta en América del Sur, América Central y Etiopía. Se desarrolla progresivamente a partir de LCL y se caracteriza por múltiples nódulos, pápulas o tubérculos con infiltración cutánea difusa sin ulceración. Se localiza principalmente en las zonas expuestas del cuerpo. Las principales especies implicadas incluyen L. (L.) mexicana y L. (L.) amazonensisen el “Nuevo Mundo” y L. (L) aethiopica en el “Viejo Mundo” (84, 85).

También, se ha encontrado que L. (V.) braziliensis puede causar lesiones

cutáneas diseminadas.

La LM puede ocurrir simultáneamente con una manifestación cutánea (LMC), sin embargo, la LM generalmente ocurre meses o años después de la leishmaniasis cutánea. La LM afecta principalmente a la mucosa nasal y con menor frecuencia la oral. Los síntomas iniciales son inespecíficos, lo que hace difícil el diagnóstico. Los síntomas pueden incluir picazón en la nariz, que progresa a la formación de la costra y el sangrado. Inicialmente, se observa inflamación y congestión al examinar las fosas nasales, sin embargo, lentamente puede sobrevenir ulceración y perforación del tabique. Partes de la cara, el paladar, la faringe y la laringe pueden verse afectadas (86). La especie principalmente

implicada en el “Nuevo Mundo” es L. (V.) braziliensis, aunque L. (V.) panamensis, L. guyanensis y L. (L.) amazonensis también pueden estar involucradas (28). En

el “Viejo Mundo”, L. (L.) major y L. (L.) infantum viscerotrópica están relacionadas

(30)

30 Brasil, la incidencia puede variar de 0,4% a 2,7% (28), mientras que en los países andinos, la incidencia media es del 7,1% (88).

La PKDL es una complicación de la (LV), se caracteriza por una erupción nodular, macular y maculopapular, en pacientes que se han recuperado de LV. La erupción comienza generalmente alrededor de la boca, desde donde se extiende a otras partes del cuerpo, dependiendo de la gravedad. Se ve sobre todo en Sudán y la India, limitándose en gran medida a las áreas donde L. (L.) donovani es el

parásito causante de LV. El intervalo en el que la PKDL sigue a la LV es de 0-6 meses en Sudán y 2-3 años en la India. La PKDL probablemente tiene un papel importante en los periodos interepidémicos de LV, actuando como reservorio para los parásitos (89).

4.1.6 Diagnóstico

El diagnóstico de la leishmaniasis se basa en la sospecha clínica de la enfermedad, la presencia de riesgo epidemiológico y de pruebas de laboratorio positivas para la infección, donde el médico debe tener en cuenta la fiabilidad de los resultados del laboratorio (90).

La caracterización de la especie del parásito responsable de la infección puede ser importante en el diagnóstico para dirigir el tratamiento adecuado (28), pues las especies de Leishmania muestran diferente susceptibilidad a los fármacos (91).

Así mismo, la evolución y el pronóstico de la enfermedad también depende de la especie del parásito (28). Por ejemplo, los pacientes infectados con L. (V.) braziliensis tienen un riesgo más alto de desarrollar LMC (92).

Debido a su alta especificidad, el diagnóstico parasitológico es el “gold standard”

(31)

31 de lesiones y el cultivo de aspirados o biopsia triturada (93). De éstos, el más comúnmente usado es el examen microscópico. El método de cultivo, seguido de la caracterización de especie por isoenzimas o anticuerpos monoclonales es probablemente el más informativo, ya que permite la identificación y caracterización de especies, sin embargo, requiere de mayor infraestructura, conocimientos y tiempo. La sensibilidad de todas estas técnicas, sin embargo, tiende a ser baja y puede ser muy variable, dependiendo del número de parásitos, la dispersión de estos en la muestra de biopsia, los medios de cultivo y la experticia del operario entre otros (25).

Las pruebas serológicas y la prueba cutánea de la leishmanina (LST) han sido utilizadas como herramientas de diagnóstico rutinario, pero no distinguen entre infecciones actuales y pasadas y su especificidad es baja en las zonas endémicas (28). Por lo anterior, se han desarrollado una gran variedad de pruebas moleculares dirigidas a optimizar el diagnóstico de la leishmaniasis. Por ejemplo, los métodos de PCR basados en la detección de ADN del kinetoplasto (ADNk) son muy sensibles debido a la presencia de miles de copias de estas secuencias en el parásito.

La PCR parece ser una herramienta valiosa para el diagnóstico de la leishmaniasis, que además puede proporcionar información epidemiológica valiosa sobre la enfermedad en los países en donde es endémica (94). Así, en el 2002, en el estado de Pernambuco (Brasil), se mostró que los métodos basados en la PCR a partir de muestras de biopsias cutáneas, fueron significativamente superiores en cuanto a sensibilidad (88,2 - 95,4%) y especificidad (100%) comparados con el examen de frotis, tinción histológica y el aislamiento por cultivo (95). En el 2003, en Bahía (Brasil) se estudió la utilidad de la PCR para el diagnóstico de LC, en un área donde L. (V.) braziliensis es endémica. El ADN de Leishmania se detectó en

(32)

32 Paulo (Brasil) en el 2008, se evaluó la utilidad de iniciadores diseñados para amplificar una región de la secuencia líder derivada del gen mini-exon (SL), en la detección del complejo L. (V.) braziliensis en biopsias, demostrando tener una

mayor sensibilidad que los métodos convencionales (97).

Variaciones de la PCR como el método PCR-RFLP (Polimorfismos en longitud de los fragmentos de restricción), ha sido aplicado en biopsias para diagnosticar e identificar L. (V.) braziliensis y L. (L.) amazonensis con un alto valor

de concordancia ( = 91.5%) con respecto a la hibridación molecular, presentando potencial importancia para el diagnóstico y la identificación de Leishmania en

muestras clínicas, reservorios y vectores infectados (98).

4.1.7 Tratamiento

El arsenal quimioterapéutico actual contra la leishmaniasis consiste en moléculas que incluyen el antimonio pentavalente, medicamento usado desde 1924, la pentamidina, diversas formulaciones del antibiótico anfotericina B y más recientemente, la miltefosina (99-101). Desafortunadamente, la elección del tratamiento en lugar de obedecer a indicaciones terapéuticas racionales, a menudo se debe a consideraciones económicas (102). Por lo anterior, en la gran mayoría de los países afectados, los enfoques quimioterapéuticos para todas las formas de leishmaniasis se basan en el uso de antimoniales pentavalentes.

(33)

33 Antimoniales genéricos también han sido analizados mostrando que estos también pueden ser eficaces (106).

La falla terapéutica causada por diversos factores, como la generación de resistencia por parte del parásito durante el tratamiento con antimonio es un problema bien conocido (5). Otros factores que conducen a la falla terapéutica son: factores relacionados con el hospedero (la inmunosupresión por VIH o desnutrición), el fármaco (la calidad del lote o medicamentos falsificados), la especies de Leishmania implicadas (91) o el seguimiento incompleto del

tratamiento por falta de adherencia o tolerancia (6-8, 107, 108).

La anfotericina B (amp B) es un antibiótico macrólido polienico aislado de

Streptomyces nodosus. Su actividad anti-leishmanial se reportó desde 1960 y

pronto fue utilizado en el tratamiento de la leishmaniasis mucocutánea (109-111). La amp B se utiliza predominantemente como un fármaco antifúngico, específicamente para el tratamiento de micosis sistémicas. La actividad selectiva de la anfotericina B contra hongos y Leishmania se debe a la mayor afinidad del

fármaco por los esteroles que se encuentran en la membrana plasmática de estos microorganismos. Aunque la amp B ha sido considerada como una alternativa de tratamiento para la leishmaniasis mucocutánea y visceral (4), su uso se ha visto limitado por los efectos secundarios tóxicos que presenta, en particular, cardiotoxicidad y nefrotoxicidad (112). La formulación estándar que se utiliza en el tratamiento es la anfotericina B desoxicolato (Fungizone), una dispersión coloidal tensioactiva disponible para la administración intravenosa. Las dificultades que ha demostrado el tratamiento de la LMC (113) y los problemas cada vez mayores de

“resistencia” al antimonio en los casos de LV han llevado a un renovado interés en el fármaco (4).

(34)

34 tratamiento primario para LCD causada por L. (L) aethiopica y como fármaco de

segunda línea para casos de resistencia a los antimoniales en la India y Kenya (114). Recientemente, la pentamidina ha demostrado ser altamente eficaz contra la LC en Colombia (115). Su toxicidad ha sido una limitación en su uso, pues se ha reportado hipoglucemia, diabetes, nefrotoxicidad, taquicardia y dolor en el sitio de inyección (115, 116).

La actividad anti-leishmanial de los alquil-lisofosfolipidos como la miltefosina se registró por primera vez en 1987, específicamente contra promastigotes y amastigotes de L. (L.) donovani (117). Estudios diferentes confirmaron la alta

actividad in vivo de la miltefosina contra L. (L.) donovani, con >98% de supresión

de amastigotes en el hígado y el bazo de los ratones después de la administración de 10 mg/kg x 5 dosis (118). Contra L. (L.) infantum, el tratamiento oral durante 5

días con 20 mg/kg de peso corporal/día, dio lugar a la supresión de amastigotes en el bazo y el hígado en un 78 y 94 %, respectivamente (119). Por tanto, la miltefosina ha sido usada como un nuevo fármaco oral para el tratamiento de la leishmaniasis visceral (120). En las fases 1, 2 y 3 de ensayos clínicos para el tratamiento de leishmaniasis visceral leve a moderada en Bihar (India) ha tenido una tasa de curación de 95% cuando se utiliza a una dosis de 100 mg/kg durante 28 días (121, 122). En un ensayo en Colombia, un esquema de tratamiento de 28 días con dosis orales de 100 mg/kg o 150 mg/kg dio una tasa de curación de 90% de LC causada por L. (V.) braziliensis o L. (V.) panamensis (9). La tasa de

(35)

35 para formas menos frecuentes de la enfermedad que requieren largos periodos de tratamiento (126).

Por otra parte, terapias combinadas de aminoglucósidos como la paromomicina y antimoniales pentavalentes están siendo usadas para tratar LCD causada por L. (L) aethiopica (127) y LV (128, 129).

(36)

36

4.2 Generalidades del parásito Leishmania

4.2.1 Taxonomía

Las Leishmanias son protozoarios pertenecientes al orden Kinetoplastida, orden

caracterizado por la presencia del kinetoplasto (red concatenada de ADN circular que contiene numerosas copias del genoma mitocondrial). Leishmania, junto con Trypanosoma, Phytomonas y Endotrypanum constituyen los cuatro géneros de

parásitos digenéticos pertenecientes a la familia Trypanosomatidae, agrupación

caracterizada por la presencia de un único flagelo. El género Leishmania

comprende dos subgéneros: Leishmania Viannia y Leishmania Leishmania, los

cuales se diferencian sobre la base de su desarrollo en el intestino del vector. Así, el subgénero Leishmania Leishmania se desarrolla en la parte anterior del píloro

(suprapilaria) y los parásitos del subgénero Leishmania Viannia se desarrollan

alrededor del píloro (peripilaria) (1, 133). Los complejos en Leishmania, aunque no

corresponden a una categoría taxonómica, son muy utilizados para agrupar especies relacionadas cuyo estatus es cuestionable (figura 1) (134).

Reino --- Protista Subreino --- Protozoa

Phyllum --- Sarcomastigophora Subphyllum --- Mastigophora Clase --- Zoomastigophorea Orden --- Kinetoplastida Suborden --- Trypanosomatina Familia --- Trypanosomatidae Género --- Leishmania

Subgénero --- Leishmania Viannia

(37)

[image:37.792.87.707.115.451.2]

37

Figura 1. Taxonomía de Leishmania, las especies subrayadas son o han sido cuestionadas, tomado de Banuls y

colaboradores, 2007 (1).

Subreino

Orden

Familia

Género

Subgénero

Complejo

Especies

No patógenas para el hombre Viejo mundo

Nuevo mundo

(38)

38 La clasificación taxonómica tradicional de L. (V.) braziliensis, basada

principalmente en criterios morfológicos, se describe en la página 35 y se muestra en la Figura 1. Recientemente, la Sociedad de Protozoología, propuso un nuevo esquema de clasificación de los organismos Eucariotas, basados en análisis de vías bioquímicas y estudios de filogenia molecular (135). Así, el género

Leishmania en conjunto con los otros miembros de la familia Trypanosomatidae,

se ubica en el Super-grupo Chromalveolata, primer rango Alveolata y segundo

rango Euglenozoa (135).

4.2.2 Ciclo de vida

[image:38.612.86.482.310.611.2]

(39)

39 Durante su ciclo de vida, los parásitos del genero Leishmania presentan 2 estadios

morfológicos principales: el promastigote, formas alargadas con un flagelo externo que se encuentran en el tubo digestivo del insecto flebótomo y el amastigote, formas redondas sin flagelo externo, que se diferencian al interior de las células del hospedero vertebrado (1, 76) (ver Figura 2).

(40)

40

4.3 Genética y biología molecular de Leishmania

4.3.1 Genoma nuclear

Hasta el momento se tiene el genoma de 5 especies de Leishmania y sus

secuencias están disponibles en la base de datos libre del GeneDB

http://www.genedb.org/Homepage (136). El primer proyecto genoma de

Leishmania se inició en 1994 con la cepa Friedlin de L. (L.) major y fue publicado

en su totalidad en el 2005 (137).

El tamaño del genoma de L. (L.) major se ha estimado en 32,8 Mb por

genoma haploide, distribuidas en 36 pares de cromosomas (138). Los cromosomas son lineales, entre 200 y 4000 kb de longitud, poseen telómeros, pero no se han identificado centrómeros (139). La variabilidad en tamaño cromosómico es característica de algunas especies de Leishmania, incluso entre

cromosomas homólogos (140-142). El genoma de L. (L.) major codifica para 911

genes de ARN, 97 pseudogenes y 8298 genes que codifican proteínas (143), al 36% de las cuales se les ha podido atribuir una función putativa. La mayor parte de los genes no poseen intrones, se encuentran en múltiples copias y frecuentemente están organizados en tándem o menos comúnmente, dispersos en el genoma (137, 144).

Mientras que las especies de Leishmania del “Viejo Mundo” tienen 36 pares

de cromosomas (0,28-2,8 Mb) (138), las especies del “Nuevo Mundo” tienen 34 o

35, con los cromosomas 8 y 29, y 20 y 36, fusionados en L. (L.) mexicana y 20 y

34 en L. (V.) braziliensis (145).

El genoma de L. (V.) braziliensis contiene 33 Mb que codifican para 8.314

genes (incluyendo los pseudogenes). Más de 10% del genoma corresponde a secuencias de ADN repetido. Cerca de 99% de los genes se mantienen en sintenia con los genomas de L. (L.) major y L. (L.) infantum. La identidad del

(41)

41 mencionadas anteriormente es de 77% (143). En la Tabla 4 se muestra un resumen de las características del genoma de L. (L.) major, L. (L.) infantum y L. (V.) braziliensis. Recientemente, se ha reportado que L. (V.) braziliensis es

triploide en 30 de sus 35 cromosomas, los cromosomas 4, 5 y 29 son tetrasómicos y el 31 es hexasómico (146). Con base en lo anterior, L. (V.) braziliensis es

claramente la más divergente de las especies hasta ahora secuenciadas (143) y la mayor fuente de variación se observa en el número de copias de genes y pseudogenes (146).

Tabla 4. Resumen de las características del genoma de L. (L.) major, L. (L.) infantum y L. (V.) braziliensis

Modificado de Peacock y colaboradores, 2007 (143); Rogers y colaboradores (146).

En el genoma de L. (V.) braziliensis se han encontrado varios elementos

transponibles como: 1) Los elementos DIRE relacionados con el retrotansposon ingi/L1Tc (147); 2) Repeticiones en tándem asociadas a las secuencias del grupo de genes SL en una disposición similar a la de los retrotransposones SLACS (por su sigla en inglés Spliced Leader Associated Conserved Sequence) presentes en

T. brucei (148) y CZAR (por su sigla en inglés cruzi-associated retrotransposon),

L. (L.) major

(V5.2)

L. (L.) infantum

(V2) L. (V.) braziliensis (V2)

Numero de

Cromosomas 36 36 35

Contigs 36 562 1.041

Tamaño en pb 32´816.678 32´134.935 32´005.207

% de G+C total 59,70 59,30 57,76

Genes que codifican

proteínas 8.298 8.154 8.153

Genes multicopia 200 207 213

Pseudogenes 97 41 161

% de G+C en regiones

(42)

42 presentes en T. cruzi (149); 3) Una familia de 20-30 elementos transponibles de

ADN localizados en los telómeros denominados “elementos transponibles

asociados a telómeros” (TATE) (143, 150) y 4) Elementos transponibles extintos como los denominados SIDERs (por su sigla en inglés: Short Interspersed Degenerated Retroposons), los cuales se encuentran de forma abundante en el genoma del parásito (1986 elementos por genoma) (151, 152).

La vía de ARN de interferencia (ARNi), es desencadenada por ARN de doble cadena (ARNdc) y se activa como mecanismo de defensa específica para eliminar ácidos nucleicos invasores potencialmente peligrosos, tales como virus o transcritos derivados de retroposones y transposones (153). En L. (V.) braziliensis

y otras especies dentro del subgénero Leishmania Viannia, se han detectado los

genes que componen la maquinaria de ARNi, observándose fuerte atenuación de la expresión de una variedad de genes reporteros y endógenos (143, 154, 155).

A pesar de las amplias diferencias en las manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por las diferentes especies del parásito, solo 47 genes que se distribuyen por todo el genoma son específicos de L. (V.) braziliensis (ver Tabla

5). Además, L. (V.) braziliensis carece de un número casi equivalente de genes

presentes en L. (L.) major y L. (L.) infantum (143). Así, la formación de

pseudogenes y la pérdida de genes son las principales fuerzas que distinguen a los diferentes genomas de Leishmania. Se cree además que los genes que se

expresan específicamente a partir del genoma en las diferentes especies de

Leishmania, codifican proteínas implicadas en las interacciones

(43)

[image:43.612.125.543.130.694.2]

43

Tabla 5. Genes de L. (V.) braziliensis que no se encuentran (-) o son pseudogenes

(en rojo) en L. (L.) major y L. (L.) infantum.

Genes de

L. (V.) braziliensis L. (L.) major

L. (L.)

infantum L. (V.) braziliensis

SLACS - - LbrM02_V2.0550

Proteína hipotética

repetida - - LbrM03_V2.0960

Metiltransferasa LmjF04.1165 LinJ04.1185 LbrM04_V2.1180

Proteína hipotética - - LbrM05_V2.0960

Proteína hipotética LmjF06.1195 LinJ06.1235 LbrM06_V2.1180

Proteína hipotética LmjF07.0155 - LbrM07_V2.0155

Argonauta LmjF11.0570 LinJ11.0500 LbrM11_V2.0360

Proteína hipotética

repetida - - LbrM14_V2.0940

Proteína hipotética LmjF22.0105 LmjF22.0110 LbrM22_V2.0105

Gen con dominio

ARNasa III - - LbrM23_V2.0390

(44)

44

Gen ARNasa III - - LbrM25_V2.1020

Adenin fosforribosil

transferasa - - LbrM26_V2.0120

Glutation peroxidasa - - LbrM26_V2.0810

Tirosina/dopa

descarboxilasa LmjF30.2500 LinJ30.2830 LbrM30_V2.2460

Beta galactofuranosil

transferasa - - LbrM20_V2.0480

Galactokinasa - - LbrM34_V2.3650

Transportador de

aminoacidos - - LbrM35_V2.1500

(45)

45

4.3.2 Regulación de la expresión génica

Para adaptarse a diferentes ambientes Leishmania requiere la capacidad de

modular su expresión génica y varios cientos de ARNm muestran al menos una doble regulación a lo largo de los estadios de desarrollo del parásito (156). Sin embargo, no se han encontrado promotores específicos para la ARNpol II (11, 13,

157, 158), como tampoco se ha detectado la presencia de factores de transcripción (137) y se considera que el genoma de Leishmania se expresa

constitutivamente (159). De manera interesante, se ha observado mediante análisis proteómico cuantitativo de la expresión relativa de proteínas en

Leishmania, que existe una baja correlación entre los niveles de expresión de

proteína y de los ARNm. Por lo tanto, la expresión de proteínas de Leishmania es

regulada a nivel post-transcripcional y/o traduccional (11, 159).

El único promotor de la ARNpol II que se ha caracterizado en Leishmania se

encontró asociado a la expresión del ARN de la secuencia líder (SL) de L. tarentolae (160). Los demás genes transcritos por la ARNpol II se transcriben

como policistrones (161), en unidades conocidas como PGC (por su sigla en inglés “Polycistronic Gene Cluster”) (12), en donde cada cromosoma contiene al menos dos PGC, que pueden ser divergentes (la dirección de la transcripción es hacia los telómeros) o convergentes (la dirección de la transcripción es desde los telómeros hacia el centro del cromosoma). Los genes de un PGC en tripanosomátidos generalmente no codifican proteínas funcionalmente relacionadas (162).

Antes de su traducción a proteína, los policistrones deben ser procesados a ARN monocistrónicos maduros mediante la acción de dos reacciones acopladas conocidas como trans-splicing y poliadenilación, que cortan las regiones

intergénicas del ARNm. En la reacción de trans-splicing, la secuencia SL, de 39