Tema N 16 Respuesta Inmune Celular.
Tema N 17 Complejo Mayor de
Histocompatibilidad.
Tema N 18 Reacciones de
Hipersensibilidad.
Tema N 19 Inmunodiagnóstico
Célula tronco pluripotencial de la médula ósea Progenitor linfoide
Progenitor B Célula NK Progenitor T Célula pre-B Pre-Timocito
Célula B inmadura Timocito inmaduro Célula B madura Timocito maduro Linfocito B Linfocito T
Célula Plasmática Linfocitos Th y Tc Inmunoglobulinas Linfoquinas
IgM Th1 Th2 IgG IL-2 IL-3 IL-4 IgA INF-g GM-CSF IL-13 IgE TGF-b IL-5 IgD IL-9
FUNCIONES Respuesta inmune humoral Memoria Respuesta inmune celular Hipersensibilidad retardada Citotoxicidad Memoria prolongada Inmunidad anti-tumoral y anti-viral Citotoxicidad NK
LINFOCITOS T
•
Representan el 60-70% de los linfocitos
periféricos.
•
Ubicados en regiones paracorticales
de ganglios linfáticos y manguitos
periarteriolares del bazo.
•
Genéticamente programados para
LINFOCITOS T
• Marcadores comunes:
CD2, CD7, CD3, CD28
• CD4+: linfocitos T cooperadores/inductores
• CD8+: linfocitos T citotóxicos/supresores
• CD4 y CD8 son mutuamente excluyentes
LINFOCITOS T
Moléculas de Superficie de las Th y Tc
Linfocito T
ICAM-1 y LFA-1 son moléculas de
LINFOCITOS T
Complejo Receptor de las Células T (TCR)
Sitio de unión del antígeno
CD3
cadenas gamma, delta y epsilon TCR
alfa - beta CD3
LINFOCITOS B
• Representan el 10- 20% de linfocitos circulantes
• Ubicados en centros germinales y folículos
linfoides de ganglios, bazo, amígdalas y tejido linfoide asociado a mucosas
• Se transforman en células plasmáticas para la secreción de inmunoglobulinas
• Reconocen específicamente a los antígenos
mediante su complejo receptor específico BCR compuesto por cadenas μ y cadenas Ig
LINFOCITOS B
CÉLULA PLASMÁTICA Marcadores de
CÉLULAS CITOLITICAS NATURALES
(NK)
• Representan el 5 a 10% de linfocitos periféricos
• Marcadores: CD2, CD56 y CD16 (receptor para Fc de IgG)
• No presentan receptores específicos para los antígenos ni inmunoglobulinas de superficie
• Capacidad de lisar de células neoplásicas,
células infectadas por virus y algunas células normales por citotoxicidad directa o
Marcadores de superficie
CÉLULAS CITOLITICAS NATURALES
(NK)
GRANULOCITOS
Fagocitos PMN
Primera respuesta inflamatoria
Secretan enzimas proteolíticas (mieoloperoxidasa)
Migran de la sangre a los tejidos por factores quimiotácticos Sobrevida y proliferación inducida por IL-5
Respuestas alérgicas y contra los parásitos (citotoxicidad)
CÉLULAS PRESENTADORAS DE
ANTÍGENOS (CPA)
Se originan a partir de progenitores comunes de granulocitos-monocitos por acción de la IL-3, GM-CSF y M-GM-CSF
Circulan por la sangre, migran a los tejidos y se diferencian en macrófagos
Fagocitos tisulares
Segregan citoquinas, enzimas proteolíticas y factores citotóxicos
Presentadoras de antígenos profesionales
Se encuentran en superficies tisulares mucosos y cutáneas. Captan los antígenos y migran a los
CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENOS
MACRÓFAGOS
• Sistema monocito-macrofágico
• Procesan y presentan el antígeno a células T
• Producen (IL-1 e IFN-alfa)
• Secretan metabolitos tóxicos y enzimas
• Son células efectoras en algunas formas de inmunidad celular,
tal como en las reacciones
CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENOS
CÉLULAS DENDRÍTICAS y de LANGERHENAS
• Presentan prolongaciones citoplasmáticas dendríticas y gran cantidad de moléculas
MHC tipo II
• Son excelentes
presentadores de
antígenos
FAGOCITOSIS
2 sistemas
Neutrófilos Macrófagos
• rápida
• corta
• lenta
• sostenida
AGUDA CRÓNICA
Células actuantes
Actividad
Inflamación
Sistema
FAGOCITOSIS 4 etapas 1 Quimiotaxis 2 Adhesión 3 Ingestión 4 Digestión y destrucción
• Invasión bacteriana
• Daño tisular
• Opsonización
• Atrapamiento celular
FAGOSOMA
Destrucción
2 procesos
EXPLOSIÓN RESPIRATORIA
ENZIMAS LÍTICAS
Radicales
oxidantes citoplasmáticos Gránulos
MACRÓFAGOS
PRESENTACIÓN DE AG
REPARACIÓN TISULAR Y CICATRIZACIÓN
FAGOCITOSIS BACTERIANA
DESTRUCCIÓN DE CÉLULAS TUMORALES
SECRECIÓN
Funciones
Citocinas Enzimas Otros factores
MACRÓFAGOS
Mecanismos de DESTRUCCIÓN
Oxidativos No oxidativos
ÓXIDO NÍTRICO
Bacterias
Hongos
Protozoarios
Helmintos
Cél. tumorales
ENZIMAS LÍTICAS
MACRÓFAGOS
SECRECIÓN
CITOCINAS ENZIMAS OTROS FACTORES
IL-1 IL-6 IL-12 IL-8 TNF-a Lisozima Proteasas Colagenasas Elastasas
Activ. de plasminógeno
Fracciones del C’
Prostanoides
Factores de coagulación
Fibronectina
Activ. de plasminógeno
MACRÓFAGOS
CICATRIZACIÓN
Degradación tisular Remodelación tisular
Colagenasa
Elastasa
Activador de plasminógeno
Factor de crecimiento de fibroblastos
Factores angiógenos
Control síntesis de proteína de matriz del TC
CITOQUINAS
• Moléculas que inducen y regulan la respuesta inmunitaria mediante el establecimiento de
interacciones con receptores específicos presentes en linfocitos, monocitos, células inflamatorias y células endoteliales.
• Son producidas por distintos tipos de células.
• Efecto pleiotrópico (actúan sobre muchos tipos celulares) con acción autocrina, paracrina y
• Citoquinas pro-inflamatorias que median la inmunidad natural:
(IL-1, TNF-alfa, IFN-gamma, IL-8).
• Citoquinas que regulan el crecimiento,
activación y diferenciación de los linfocitos (IL-2, IL-4, IL-10, IL-12 y TGF-beta).
• Ciroquinas que estimulan a otras células (IL-13 a linfocitos B, IL-5 a eosinófilos)
• Citoquinas que estimulan la hematopoyesis (GM-CSF, M-CSF, IL-3).
CITOQUINAS
MOLÉCULAS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
• Moléculas glucoproteicas de la superficie de las células que se unen a fragmentos peptídicos, a fin de presentarlos a las células T específicas
• Son importantes en el rechazo de transplantes y en la predisposición a enfermedades
• Varios genes codifican antígenos de
histocompatibilidad, pero los principales se
MOLÉCULAS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
Todos los mamíferos estudiados hasta el momento
poseen un grupo de genes, el Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (CMH) o MHC del inglés Major
El CMH es un conjunto de genes alineados en una región grande y continua del genoma. Algunas
localizaciones son:
MOLÉCULAS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
Genes de clase I (CMH-I): determinan glicoproteínas de membrana que aparecen en casi todas las células
nucleadas y sirven para presentar antígenos
MOLÉCULAS DE
HISTOCOMPATIBILIDAD
Genes de clase II (CMH-II): determinan glicoproteínas de membrana que sólo se expresan en células presentadoras de antígeno (macrófagos, células dendríticas, linfocitos B) y sirven para presentar antígenos peptídicos a linfocitos T colaboradores (TH).
3 clases de genes
Clase III Clase II
Clase I
Receptores MHC I para
antígenos ENDÓGENOS Receptores MHC II para antígenos EXÓGENOS
Grupo mixto de
proteínas, incluyendo componentes de
complemento y
proteínas relacionadas
Genética Genética
EXPRESIÓN
Presentación de Ag a LT colaboradores Presentación de Ag a
LT citotóxicos
FUNCIÓN
LINFOCITOS B MACRÓFAGOS
CÉL. DENDRÍTICAS
CMH Y PRESENTACIÓN DE ANTÍGENO
• Para que una proteína extraña sea reconocida por un linfocito T, debe ser degradada en péptidos pequeños que luego tienen que formar complejos con moléculas de clase I y/o II.
• Esta transformación de las proteínas en péptidos asociados al CMH es denominada “procesamiento antigénico”.
RESPUESTA INMUNE
RECONOCIMIENTO DE ANTÍGENOS
RESPUESTA
INMUNE
PRESENTACIÓN
DEL ANTÍGENO
CÉLULA PRESENTADORA DE ANTÍGENOS Molécula Clase II del MHC
CÉLULA T CD4*
Presentación del péptido antigénico por moléculas MHC clase II a las células T CD4+ (helper).
Importancia de las
CMH Y ENFERMEDAD
• Ciertas enfermedades se asocian con
determinados alelos del CMH. Sin embargo en casi todos los casos están implicados otros genes no situados en el complejo CMH
• Entre ellas se incluyen (procesos autoinmunes, susceptibilidad a virus,alteraciones neurológicas y del sistema del complemento y algunos tipos de alergias)
CMH Y ENFERMEDAD
• La población actual de guepardo (amenazado de extinción) posee poca variedad de haplotipos de CMH, ya que proceden de un
número muy limitado de
animales. Esto limita el rango de péptidos procesados con los que esas moléculas del CMH pueden interactuar, por lo que los guepardos actuales (y otros félidos salvajes) son más susceptibles a los ataques de ciertos virus que otros grandes felinos.
En ciertos casos se ha llegado a determinar qué alelos son los
responsables de la susceptibilidad o resistencia; así, por ejemplo: pollos
HIPERSENSIBILIDAD
• Es una reacción inmunológica excesiva frente a un Ag, que produce lesiones en los tejidos del sujeto que lo padece.
• Para que se produzca, el individuo debe haber tenido un contacto previo con ese Ag y haberse sensibilizado frente a él.
• Se clasifican en cinco tipos (I a V).
• Reacciones de sensibilidad inmediata: – Los tipos I, II, III y V
– Se manifiestan rápidamente (minutos u horas). – Dependen de la interacción Ag-Ac
• Reacciones de hipersensibilidad retardada: – Tipo IV
HIPERSENSIBILIDAD
TIPO I
• Alergia o atopia (Ej.: Eczema atópico, rinitis, etc.) • El Ag se llama alergeno.
• Los Ac responsables son las IgE (1) que se producen localmente por los linfocitos B en las mucosas donde se encuentra el Ag. • Las IgE se fijan a los mastocitos y basófilos por su fragmento Fc
(sensibilización) (2).
• En un segundo encuentro con el Ag, éste se fija a mastocitos y basófilos formando puentes entre dos IgE vecinas (3),
produciendo la liberación de mediadores vasoactivos (4 • Existe predisposición familiar al desarrollo de una alergia
HIPERSENSIBILIDAD TIPO I
•
Los mediadores vasoactivos liberados por
mastocitos y basófilos son:
– Histamina procedente de sus gránulos
(Desgranulación).
– Sustancias derivadas del Ác araquidónico
(prostaglandinas, y leucotrienos) responsables de un
HIPERSENSIBILIDAD TIPO I (Cont.)
SOLUBLE
PARTICULADO
SUPERFICIE + COMPLEMENTO
PRECIPITACIÓN
AGLUTINACIÓN
FIJACIÓN DE COMPLEMENTO
La prueba a realizar depende de las
Comparación precipitación - aglutinación
Antígeno SOLUBLE
Antígeno PARTICULADO
Formación de “retículo” “Amontonamiento”
PRECIPITACIÓN AGLUTINACIÓN
PRECIPITACIÓN
Fundamento: un antígeno soluble, al ser puesto en
contacto con su anticuerpo específico, forma
complejos inmunes que al encontrarse en
proporciones óptimas se insolubilizan dando una
MEDIO
LÍQUIDO SÓLIDO
• DIFUSIÓN DOBLE
• INMUNOELECTROFORESIS (IEF)
• INMUNODIFUSIÓN RADIAL (IDR)
• CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIEF) Test de Ascoli - Valente
DIFUSIÓN DOBLE
Fundamento: empleando el medio adecuado (agar gel), es posible hacer migrar por difusión tanto Ag
como Ac (difusión “doble”), de modo que al encontrarse en proporciones óptimas, interaccionen, produciendo una banda de
precipitado visible
Inmunodifusión en Gel de Agar
Test de Coggins para AIE
Placa de Petri
1. Agar gel 1 2 6
7 5
4 3 2.Sacabocados
3. Suero problema 1 3 5
4. Suero testigo (+) (reactivo)
6.Cámara húmeda
48 hs 7. LECTURA (fondo oscuro) e INTERPRETACIÓN
A
C B
A. NEGATIVO
B. POSITIVO
C. Débilmente POSITIVO
D. NEGATIVO
E. Fuertemente POSITIVO
F. POSITIVO
G. POSITIVO
H. Banda INESPECÍFICA
I. Banda INESPECÍFICA 2
6
7
4
D
F E
G
APLICACIONES EN VETERINARIA
ANEMIA INFECCIOSA EQUINA
PIROPLASMOSIS EQUINA
LEUCOSIS BOVINA
BRUCELOSIS OVINA
AGLUTINACIÓN
Fundamento: un antígeno particulado (ejemplo:
bacterias, eritrocitos), al ser puesto en contacto con su
anticuerpo específico en proporciones óptimas, se une por medio de enlaces cruzados. Este complejo de unión
Se produce cuando existe un marcado exceso de Ac con
respecto a los determinantes antigénicos de la partícula, de
tal manera que es poco probable que los dos sitios de unión
de la Ig puedan unirse a dos determinantes antigénicos de
dos partículas distintas, inhibiéndose de este modo la
aglutinación. Generalmente ocurre en las diluciones bajas de
sueros muy positivos.
AGLUTINACIÓN
AGLUTINACIÓN PASIVA COAGLUTINACIÓN
Antígeno particulado
(reactivo)
+
Y Y
Y Y
Y
Suero problema
Proporción
Medio
Y
Y
AGLUTINACIÓN
En PLACA En TUBO
Brucella
Aglutinación en placa: BPA
1. Suero problema 2. Antígeno específico (reactivo)
Aglutinoscopio + placa de vidrio
3. Mezclar
8 MINUTOS
LECTURA E INTERPRETACIÓN
Con GRUMOS Sin GRUMOS
Aglutinación en tubo: SAT + 2-ME
SAT (Seroaglutinación en Tubo)
Ig M Ig G
2- ME (2- Mercaptoetanol)
En TUBO: SAT + 2- ME
SUERO BPA (+)
1. Suero problema
Título
SAT
2-ME
37ºC-48 hs 2. Solución fisiológica fenicada (SFF)
2. Solución 2-ME
3. Antígeno
60 MINUTOS
1/25 1/50 1/100 1/200
LECTURA e INTERPRETACIÓN
37ºC-48 hs
Aglutinación en tubo: PAL
PRUEBA DEL ANILLO EN LECHE
Fundamento: si en una muestra de leche se encuentra
un anticuerpo específico, y se le agrega un antígeno particulado coloreado, ambos se unirán, formando un complejo Ag-Ac que se adhiere a los glóbulos de grasa y
1. Leche problema
2. Antígeno (reactivo)
37ºC-1 hora
LECTURA e INTERPRETACIÓN
+
++
+++
++++
APLICACIONES EN R. A.
BRUCELOSIS BOVINA
Prueba
TAMIZ BPA – ELISA I
COMPLEMENTARIAS SAT + 2-ME – FPA
ELISA C
DEFINITORIA FC
VIGILANCIA
EPIDEMIOLÓGICA PAL - ELISA I
IN VITRO NEUTRALIZACIÓN
IN VIVO PROTECCIÓN
NEUTRALIZACIÓN
Fundamento: estimación de la capacidad de una
anticuerpo de neutralizar la actividad biológica
PROTECCIÓN
Fundamento: forma de análisis de neutralización
que se realiza totalmente in vivo para determinar
la capacidad protectora de un anticuerpo
RESPUESTA INMUNE CELULAR
PURIFICACIÓN DE LINFOCITOS
IDENTIFICACIÓN LINFOCITOS T
IDENTIFICACIÓN LINFOCITOS B
1. PRIMARIAS
2. SECUNDARIAS
3. TERCIARIAS
Miden la cantidad de complejo Ag-Ac formado
Miden las consecuencias de la unión Ag-Ac in vitro
Miden las consecuencias o el efecto
protector de anticuerpos en el animal (in
vivo)
PRUEBAS PRIMARIAS
Pruebas INMUNOENZIMÁTICAS: - ELISA
- Western blotting
Pruebas de INMUNOFLUORESCENCIA: - Directa
- Indirecta
- Citometría de flujo
Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac formado a través de marcadores ligados a enzimas, que en presencia del sustrato específico, producen una reacción colorimétrica.
ENZIMAS UTILIZADAS • PEROXIDASA
• Fosfatasa alcalina
SUSTRATO
• ortofenildiamina • paranitrofenilfosfato ELISA
Tipos de pruebas
INDIRECTA SANDWICH COMPETICIÓN
detección de ANTICUERPO
detección de ANTÍGENO
detección de ANTICUERPO
ELISA INDIRECTO
ANTÍGENO adsorbido
(reactivo)
Suero
PROBLEMA ANTIGLOBULINA marcada con
ENZIMA (reactivo)
SUSTRATO de la enzima (reactivo)
CAMBIO DE COLOR
Lavado
Detección de ANTICUERPOS
N E G A T I V O P O S I T I V O Antígeno Suero Problema Ac monoclonal Conj. con enzima peroxidasa Sustrato cromógeno COLOR
Y
Y
Y
Y
AUSENCIA DE COLOR
ELISA COMPETICIÓN
Lavado Lavado Lavado Lavado
EL
ISA
VENTAJAS
Alta sensibilidad y especificidad
Rápido
Reactivos estables
Resultado visual
DESVENTAJAS
Costo microplacas
Costo equipo automatización
Brucelosis
IBR
BVD
Peste porcina
Aujesky
Newcastle
Bia
Leucemia felina
Salmonella
Aftosa
Estreptococos
TBC
Babesia
Trichinella
Toxoplasma
Toxocara
Hormonas
Micotoxinas
INMUNOFLUORESCENCIA
Fundamento: visualización de la cantidad de Ag-Ac
formado a través de colorantes fluorescentes utilizados como marcadores
INMUNOFLUORESCENCIA
Tipos de pruebas
DIRECTA INDIRECTA CITOMETRÍA DE FLUJO
detección de ANTÍGENO
detección de ANTICUERPO
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA
3. Anticuerpo
conjugado con FITC (reactivo)
1. Corte o impronta
(Ag desconocido)
2. Fijado con acetona
4. Lavado
5. OBSERVACIÓN
Incubación
Microscopio
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
1. Extendido de cultivo celular
2. Suero problema
3. Lavado
4. Antiglobulina conjugada con FITC (reactivo)
6. OBSERVACIÓN Microscopio fondo
oscuro-Luz UV
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA e INDIRECTA
VENTAJAS
• alta sensibilidad
• rápida, sencilla
• evidencia de Ag intracelulares
• reactivos estables
DESVENTAJAS
• costo equipo
• lectura subjetiva
APLICACIONES EN VETERINARIA
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
(PCR)
Multiplicación de una secuencia de ADN
específica y conservada de la especie a
identificar, que puede ser visualizada y
NUCLÉOTIDO
Fosfato
Base nitrogenada
CADENA DE AZÚCAR Y FOSFATO
AZÚCAR
FOSFATO
ADN
OLIGONUCLEÓTIDOS (PRIMERS)
A T
G C
NUCLEÓTIDOS
Primers
Primers
Polimerasa
100 90 80 70 60 50 40 30 20 Detección 35 ciclos ADN Primers Polimerasa dNTP
Desnaturalización 94º C
1 min
Extensión 72º C
1 min
Tipos de PCR
CON PRIMERS ANIDADOS
ASIMÉTRICA
INVERSA
MULTIPLEX
VENTAJAS
FIDELIDAD
SENSIBILIDAD
ESPECIFICIDAD
APLICACIONES
Diagnóstico (virales- bacterianas- parasitarias- micóticas)
Enfermedades hereditarias
Enfermedades autoinmunes
OncologÍa
Medicina forense
Organización del laboratorio de biología molecular
ÁREA DE ALMACENAMIENTO DE REACTIVOS
ÁREA DE PREPARACIÓN DE MUESTRAS
ÁREA DE AMPLIFICACIÓN
