Determinación de fitoconstituyentes del extracto etanólico de la raíz de rumex crispus l (lengua de vaca) y su efecto antibacteriano in vitro frente a escherichia coli y staphylococcus aureus

Texto completo

(1)Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. Q UI. M IC A. ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA. BI O. Determinación de fitoconstituyentes del extracto etanólico de la raíz de. IA. Y. Rumex crispus L. (lengua de vaca) y su efecto antibacteriano in vitro. M. AC. frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. FA R. TESIS II. PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE BACHILLER EN. CA. DE. FARMACIA Y BIOQUÍMICA :. BL IO. :. Mg. Q.F. MARILÚ ROXANA, SOTO VÁSQUEZ. :. Mblga. KARINA, SOTO VÁSQUEZ. BI. ASESORA. MONCAYO VARGAS, Nadya Katherine SANTOS MENDOZA, Amado Agustín. TE. AUTORES. CO-ASESORA. TRUJILLO – PERÚ. 2014. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. JURADO DICTAMINADOR …………………………………………………………i. M IC A. PRESENTACIÓN……………………………………………………………..…….…iii. Q UI. RESUMEN……………………………………………………………………..….…....iv. BI O. ABSTRACT……………………………………………………………….……….…....v. IA. Y. INTRODUCCIÓN………………………………………………………………….…..01. FA R. M. AC. MATERIAL Y MÉTODO……………………………………………………………...12. RESULTADOS. CA. DE. …………………………………………………………………….......27. BL IO. TE. DISCUSIÓN……………………………………………………………………………31. BI. CONCLUSIONES………………………………………………………………….…..36. REFERENCIAS………………………………………………………………………..37. ANEXOS…………………………………………………………………………….…44. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Mg. Marilú Roxana Soto Vásquez. ……………….. Dr. Edmundo Arturo Venegas Casanova. ……………….. PRESIDENTE. Q UI. ……………….. MIEMBRO. MIEMBRO. BI. BL IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI O. Dr. Segundo Guillermo Ruiz Reyes. M IC A. JURADO DICTAMINADOR. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A Dios. Por los triunfos y los momentos difíciles que nos han enseñado a. Q UI. M IC A. valorarnos cada día más.. BI O. A nuestros Padres. Por habernos educado y soportar nuestros errores. Gracias a sus. Y. consejos, por el amor que siempre nos han brindado, por cultivar e. FA R. M. AC. IA. inculcarnos ese sabio don de la responsabilidad.. DE. A nuestros maestros.. CA. Gracias por su tiempo, por su apoyo así como por la sabiduría que nos. TE. transmitieron en el desarrollo de Tesis II, en especial: a la Mg. Marilú Roxana. BL IO. Soto Vásquez por habernos guiado en el desarrollo de este trabajo y llegar a la culminación del mismo, gracias por su apoyo ofrecido en los momentos difíciles. BI. en este trabajo, por su tiempo compartido y por impulsar el desarrollo de nuestra formación profesional en el área de la investigación científica.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. PRESENTACIÓN. M IC A. Señores Miembros del Jurado Dictaminador: En cumplimiento con las disposiciones vigentes emanadas del reglamento de Grados y. Q UI. Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo,. BI O. sometemos a vuestra consideración y elevado criterio, la presente Tesis II titulada:. Y. Determinación de fitoconstituyentes del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus. IA. L. (lengua de vaca) y su efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli y. M. AC. Staphylococcus aureus.. FA R. Con el cual pretendemos obtener el Grado Académico de Bachiller en Farmacia y. DE. Bioquímica.. Esperando que el jurado se sirva a calificar este trabajo según su criterio establecido, a. CA. pesar de la existencia de alguna deficiencia encontrada durante el desarrollo del presente. BL IO. TE. trabajo de investigación.. BI. Trujillo, julio de 2014. MONCAYO VARGAS, Nadya Katherine. SANTOS MENDOZA, Amado Agustín. Autor. Autor 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El presente trabajo de investigación estuvo orientado a la determinación de los fitoconstituyentes del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca) y su efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus. Para. M IC A. la preparación del extracto etanólico se trabajó con la raíz de Rumex crispus L. procedente del distrito de Otuzco, provincia Otuzco, región La Libertad, se preparó el extracto. catequinas, azúcares reductores, lactonas, saponinas,. BI O. encontrando la presencia de. Q UI. etanólico mediante reflujo, al cual se le realizó la determinación de fitoconstituyentes,. quinonas, flavonoides, antocianidinas, compuestos fenólicos y taninos. Se determinó el. Y. efecto antibacteriano in vitro mediante la técnica de difusión en pozos de agar basada en. AC. IA. el método de Kirby- Bauer modificado.. M. El extracto etanólico de las hojas de Rumex crispus L. presentó efecto antibacteriano in. FA R. vitro frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Escherichia coli (ATCC 25992), a las concentraciones de 5%, 15% y 30%, mostrando mayores porcentajes de inhibición. DE. (83% y 59%), a la concentración de 30%, con diferencias estadísticamente significativos. CA. (p<0,05). Asimismo la concentración mínima inhibitoria frente Escherichia coli y. BL IO. TE. Staphylococcus aureus fue de 2.5 mg/mL y 1 mg/mL respectivamente.. Palabras claves: Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Rumex crispus L., efecto. BI. antibacteriano.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT. The present investigation was aimed at determining the phytoconstituents the ethanol extract of the root of Rumex crispus L. (beef tongue) and in vitro antibacterial effect against Escherichia coli and Staphylococcus aureus. For the preparation of the ethanol. M IC A. extract was worked with the root of Rumex crispus L. from the district Otuzco Otuzco province, La Libertad region, the ethanol extract was prepared by refluxing, which. Q UI. underwent phytoconstituents determination, finding the presence of catechins, reducing. BI O. sugars, lactones, saponins, quinones, flavonoids, anthocyanins, phenolics and tannins. The antibacterial effect in vitro was determined by the well diffusion method based agar. IA. Y. Kirby-Bauer method modified.. AC. The ethanol extract of the leaves of Rumex crispus L. showed antibacterial effect in vitro. M. against Staphylococcus aureus (ATCC 25923) and Escherichia coli (ATCC 25992), at. FA R. concentrations of 5%, 15% and 30%, showing higher percentages of inhibition (83% and. DE. 59%) at the concentration of 30%, with statistically significant differences (p <0.05). Also the minimum inhibitory concentration against Escherichia coli and Staphylococcus. BL IO. TE. CA. aureus was 2.5 mg / mL and 1 mg / mL respectively.. Keywords: Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Rumex crispus L., antibacterial. BI. effect.. 7 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I. INTRODUCCIÓN. Las plantas medicinales en la actualidad forman parte del cuidado de la salud de las personas de todo el mundo, tanto en las comunidades indígenas y rurales de los países. M IC A. subdesarrollados, como en los países desarrollados, pues desde su aparición en la tierra, el hombre, ha buscado instintivamente en las plantas el alivio para sus dolores, de la. BI O. Q UI. misma forma que buscó en ellas la alimentación y protección 1,2.. Por ello el hombre entró en relación íntima y vital con las plantas y depende de ellas para. Y. alimentarse y satisfacer muchas de sus necesidades, incluyendo las medicinales, debido a. IA. que no solo elaboraban compuestos químicos que el hombre y animales utilizaban para. M. .. FA R. 1,2. AC. alimentarse, sino también, una gran variedad de sustancias que ejercen efecto fisiológico. DE. La Organización Mundial de la Salud estima que en muchos países desarrollados el 70-. CA. 80% de la población ha usado de alguna forma la medicina tradicional; además, en. TE. algunos países asiáticos y africanos el 80% de la población depende de la medicina. BI. BL IO. tradicional para la atención primaria de su salud 3.. El empleo de plantas medicinales en el Perú es una práctica popular de gran arraigo desde la época prehispánica. En la actualidad el empleo de estas plantas está muy difundido sobre todo en las zonas suburbanas y rurales de la costa en toda la sierra y selva peruana. Los conocimientos sobre propiedades terapéuticas de muchos vegetales fueron transmitidos por los aborígenes a través del tiempo, sentando las bases de la medicina. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. empírica que se ha mantenido hasta la actualidad y que aún los conocimientos científicos del presente siglo pudieran prescindir de ello 3, 4.. Los tratamientos con plantas medicinales gozan cada vez más del interés de los. M IC A. profesionales de la salud por diferentes razones, entre estas, los escasos recursos de los servicios de salud en zonas rurales y urbanas marginales, elevados costos de los fármacos. Q UI. que la población no puede adquirir, elevada demanda de la población y comprobación. BI O. científica de la efectividad de muchas plantas 3, 4.. IA. Y. Las plantas son capaces de producir cientos de compuestos de amplia diversidad y distinta. AC. funcionalidad. Las propiedades medicinales de las plantas pueden provenir de cualquiera. M. de sus partes (hojas, tallos, corteza, raíces, flores o semillas) que producen sustancias. FA R. químicas llamadas metabolitos secundarios o principios activos los cuales poseen. DE. propiedades terapéuticas 3, 4.. CA. Un gran porcentaje de principios activos están comprendidos dentro de los productos. TE. naturales o metabolitos secundarios, que son compuestos de estructura compleja y de. BL IO. distribución más restringida; entre ellos tenemos: alcaloides, esteroides, terpenos, flavonoides, aceites esenciales, aceites grasos, glucósidos, gomas, resinas, quinonas ,. BI. compuestos fenólicos, etc 5.. Es por tal motivo que la medicina ha utilizado una gran variedad de plantas medicinales para desarrollar medicamentos altamente efectivos contra diversas enfermedades, los cuales hubieran sido difíciles de encontrar sin los conocimientos que ofrece la medicina tradicional 5. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La industria farmacéutica se ha basado en este conocimiento para la extracción y elaboración de fármacos modernos para la cura de las enfermedades 6.. M IC A. Sin embargo, los problemas de salud y el elevado costo de los medicamentos sintéticos han llevado al aumento del uso de la medicina tradicional para tratar enfermedades. Q UI. principalmente en países en vías de desarrollo; es así, como el conocimiento de las plantas. BI O. medicinales ocupa un lugar preponderante como una de las medicinas alternativas del futuro que garantiza eficacia, seguridad y bajos costos, siempre y cuando sean usadas en. AC. IA. Y. forma adecuada y por personal calificado6.. M. En los últimos 20 años ha habido un resurgimiento de la investigación de productos. FA R. naturales, debido a la gran diversidad química y biológica del reino vegetal, la cual es una fuente rica y un recurso renovable para el desarrollo de nuevas moléculas de interés. DE. farmacéutico. Se estima que más del 90 por ciento de las especies vegetales no han sido. CA. estudiadas para el descubrimiento y desarrollo de nuevas moléculas de interés. TE. farmacéutico 6.. BL IO. Una de estas estas especies vegetales es Rumex crispus L. conocida también como: lengua de vaca, romaza, acitosa, llaque –llaque, mostaza, llague, huacaha, acelga, guaitata. BI. perteneciente a la familia de las Poligonáceas 7, 8.. Rumex crispus L. es considerada como maleza de climas fríos, es una planta de 50 cm a 1.5 m de altura. Las hojas forman densas agrupaciones en la parte baja de la planta, son alargadas y semejan una lengua, las hojas de arriba están reducidas. Las flores son de color rosa o verdes y se encuentran en racimos, verticiladas y dispuestas en panículas 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. densas, estrechas, alargadas, ascendentes. Los frutos son cafés y lustrosos. Los tallos son angulosos, acanalados y usualmente ramificados desde la base. Tiene una raíz de 20 a 30 cm de largo, 1,5 cm de grosor, carnosa y generalmente ramificada, de color marrón por fuera, blancuzca amarillenta por dentro y tejido dérmico algo grueso. Esta raíz contiene varios nutrientes minerales que incluyen taninos, quinonas, oxalatos, glucósidos y. M IC A. antraquinona 7, 8.. Q UI. Dentro de sus usos medicinales se utiliza para el tratamiento de estreñimiento crónico, es antianémico, remineralizante, cicatrizante, vitamínico, expectorante, estimulante de las. Y. BI O. defensas orgánicas, y también se puede atribuir la acción diurética 9, 10.. IA. De igual forma, ayuda a promover la salud digestiva, en general, mediante la producción. AC. de la bilis que descompone los ácidos grasos. También ayuda en el tratamiento del. M. estreñimiento. Junto con eso, también reduce la inflamación y la irritación de la mucosa. FA R. intestinal y ayuda en la normalización del movimiento intestinal lento. Sus propiedades diuréticas conduce a la formación efectiva de la orina. Beber los extractos ayuda en la. CA. DE. digestión y mejora el apetito enormemente 9,10.. TE. Se ha encontrado que las personas que sufren de enfermedades de la piel, como picazón,. BL IO. descamación heridas infectadas y erupciones cutáneas, pueden usar el jugo de esta raíz y frotarlo sobre la piel.. Esto trae un alivio instantáneo, además trata las dolencias y. BI. trastornos, como eczemas, psoriasis, forúnculos y erupciones cutáneas 9,10.. Es relevante mencionar que todas estas propiedades que presenta se deben a la presencia de determinados fitoconstituyentes que se encuentran en forma compleja y heterogénea. Contribuyendo a que sea utilizada para el tratamiento de una o varias enfermedades incluidas las de etiología infecciosa 6.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Entre los principales microorganismos causantes de las infecciones más frecuentes se encuentran Escherichia coli y Staphylococcus aureus 11.. Escherichia coli, es un bacilo que reacciona negativamente a la tinción de Gram (gram negativo), es anaerobio facultativo, móvil por flagelos peritricos (que. M IC A. rodean su cuerpo), no forma esporas, es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa. Es una bacteria habitual en el intestino del ser humano y de otros animales de. Q UI. sangre caliente. Aunque la mayoría de las cepas son inofensivas, algunas pueden. BI O. causar una grave enfermedad de transmisión alimentaria. La infección por E. coli se transmite generalmente por consumo de agua o alimentos contaminados, como. IA. Y. productos cárnicos poco cocidos y leche cruda 11.. AC. Los síntomas de la enfermedad incluyen cólicos y diarrea, que puede ser. M. sanguinolenta. También pueden aparecer fiebre y vómitos. La mayoría de los. FA R. pacientes se recuperan en el término de 10 días, aunque en algunos casos la. DE. enfermedad puede causar la muerte 12.. CA. Son más comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra (25 a 50 mm, o. TE. bien 1 a 2 pulgadas) en comparación con los hombres (unos 15 cm, o unas 7. BL IO. pulgadas) 12.. Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma proporción. BI. entre hombres y mujeres. Debido a que la bacteria invariablemente entra al tracto urinario por la uretra (una infección ascendente), los malos hábitos sanitarios pueden predisponer a una infección, sin embargo, otros factores cobran importancia, como el embarazo, hipertrofia benigna o maligna de próstata, y en muchos casos el evento iniciante de la infección es desconocido 12, 13.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Aunque las infecciones ascendentes son las causantes de infecciones del tracto urinario bajo y cistitis, no es necesariamente esta la causa de infecciones superiores como la pielonefritis, que puede tener origen hematógeno 12, 13.. Staphylococcus aureus es una bacteria anaerobia facultativa, gram-positiva,. M IC A. productora de coagulasa, catalasa, inmóvil y no esporulada que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada tres. Q UI. personas se hallan colonizadas, aunque no infectadas, por ella 14.. BI O. Puede producir una amplia gama de enfermedades, que van desde infecciones. Y. cutáneas y de las mucosas relativamente benignas, tales como foliculitis,. IA. forunculosis o conjuntivitis, hasta enfermedades de riesgo vital, como celulitis,. AC. abscesos profundos, osteomielitis, meningitis, sepsis, endocarditis o neumonía.. FA R. M. Además, también puede afectar al aparato gastrointestinal, ya sea por presencia física de Staphylococcus aureus o por la ingesta de la enterotoxina estafilocócica. DE. secretada por la bacteria 14.. CA. En la actualidad, este microorganismo se encuentra como el principal causante de. TE. las infecciones nosocomiales. Esta situación se ve favorecida por el hecho de que. BL IO. esta especie habita tanto en las mucosas como en la piel de los seres humanos, lo que permite que a través de las heridas quirúrgicas pueda penetrar en el torrente. BI. sanguíneo del paciente por medio del contacto directo o indirecto con el personal sanitario, con un objeto contaminado o incluso con otro paciente 15.. Las cepas habituales de Staphylococcus aureus son resistentes a la penicilina, dejando como los antibióticos más eficaces para combatirlos a los aminoglucósidos, las cefalosporinas, la oxacilina o la nafcilina. Además de la. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. administración del tratamiento antimicrobiano correspondiente, puede ser conveniente, en función del caso, la eliminación de puertas de entradas como catéteres venosos permanentes o drenajes quirúrgicos 15.. Los principales factores que favorecen el surgimiento de la resistencia bacteriana son: el. M IC A. movimiento de paciente dentro y entre instituciones médicas; la aprobación de prescripción y uso de antibióticos (automedicación); las medidas excesivas de control de. BI O. Q UI. las infecciones: los viajes y otros factores socioeconómicos diversos 16,17.. La resistencia a los antibióticos supone un problema clínico, pero también se traduce en. IA. Y. un problema económico. Según un informe del Centro Europeo para la Prevención y. AC. Control de Enfermedades y la Agencia Europea del Medicamento, se estima que en. M. Europa se producen alrededor de 25.000 muertes al año causadas por un grupo. FA R. seleccionado de bacterias multirresistentes (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, y Pseudomona aeruginosa), y las infecciones causadas por. CA. DE. estos microorganismos podrían suponer alrededor de 1,5 billones de euros al año 18.. TE. En los Estados Unidos de América se calcula un gasto anual como consecuencia de la. BL IO. resistencia bacteriana, de aproximadamente 4 billones de dólares. Por otra parte, para poder contener el problema y evitar las consecuencias, el uso prudente de los agentes. BI. antimicrobianos y el adecuado control en la infecciones intrahospitalarias parecen ser las mejores herramientas de combate contra la diseminación de la resistencia bacteriana 19.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Instituto de Salud Pública de Chile lleva una vigilancia en patógenos asociados a infecciones ambulatorias: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae (como agentes causales de infecciones invasoras), Salmonella sp y Shigella. sp 20.. M IC A. En el Perú los microorganismos más frecuentemente reportados como aislados en pacientes hospitalizados son la Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Klebsiella. Q UI. pneumoniae y Pseudomona aeruginosa. Esta frecuencia es más o menos similar en comparación entre los servicios de hospitalización y la unidad de cuidados intensivos. BI O. (UCI). En el análisis por edad y sexo, las frecuencias son diferentes dependiendo de la. Y. frecuencia de determinadas tipos de infecciones en cada grupo 21.. IA. La prevalencia de la resistencia del Staphylococcus aureus procedente de pacientes. AC. hospitalizados a la meticilina (u oxacilina) es de 66.7%. Esta prevalencia es mucho mayor. FA R. M. cuando solo se analiza los aislamientos procedentes de pacientes hospitalizados en UCI (82.1%). En los aislamientos procedentes de pacientes que son manejados. CA. DE. ambulatoriamente esta es de 48.9% 21.. TE. La resistencia de la Escherichia coli procedente de pacientes hospitalizados a la. BL IO. cefotaxima es 28.1%, sin embargo, los aislamientos procedentes de pacientes hospitalizados en UCI es más alta, 85.3%. Esta prevalencia puede estar relacionada. BI. también a la producción de betalactamasas de espectro extendido. La resistencia a otros antibióticos también es importante: 75% a aztreonam, 72.2% a cefepime, 62.3% a ciprofloxacina 21.. Ya en el año 2001, la Organización Mundial de la Salud (OMS) apuntaba hacia el aspecto global de la resistencia a los antimicrobianos, definiéndolo como un problema complejo, 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. impulsado por múltiples factores que exigía la búsqueda de respuestas multisectoriales. Parece que todas estas alertas no tuvieron los efectos esperados y sigue siendo una cuestión de flagrante actualidad 22.. M IC A. La emergencia de bacterias resistentes a los antibióticos ha ido paralela a la incorporación de los mismos al arsenal terapéutico. La industria farmacéutica fue modificando la. Q UI. estructura química de las moléculas de antibióticos ya conocidos y buscó, así mismo, nuevos antibióticos que fuesen esquivando los mecanismos de resistencia adquiridos por. BI O. las bacterias 22.. Y. Sin embargo, aunque estas nuevas moléculas fueron eficaces durante unos años, las. IA. bacterias de nuevo desarrollaban nuevos mecanismos que incluían la resistencia a estos. FA R. M. AC. nuevos antibióticos 22.. Las compañías farmacéuticas están buscando drogas de otras fuentes incluyendo las. DE. plantas y los animales. Las plantas medicinales son consideradas como una fuente. CA. principal de nuevas drogas quimioterapéuticas debido a su alto contenido de. BL IO. TE. fitoconstituyentes y a su poco o nulo efecto tóxico 22.. BI. Debido a esto, los medicamentos naturales constituyen una alternativa dentro de una política de salud; para resolver el problema que acarrean los medicamentos de síntesis química que actualmente se utilizan 22.. Para la validación científica de la práctica tradicional, es de gran importancia el estudio de las plantas usadas en medicina folklórica, porque mediante dichos estudios se puede. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. determinar la composición química que poseen, y evaluar la inocuidad para el consumo humano antes de la aplicación médica.. Es por tal razón que el presente trabajo de investigación se planteó el siguiente problema: ¿Cuáles son los fitoconstituyentes presentes en el extracto etanólico de la raíz de Rumex. M IC A. crispus L. (lengua de vaca) y su efecto antibacteriano in vitro frente a Escherichia coli y. Q UI. Staphylococcus aureus?. BI O. Para responder a este problema se empleó la marcha fitoquímica preliminar de Martínez M. y Cuellar A; y la técnica de difusión en pozos de Agar basada en el método de Kirby-. AC. Los objetivos fueron los siguientes:. IA. Y. Bauer modificado.. M. a. Determinar los fitoconstituyentes presentes en el extracto etanólico de la raíz de. FA R. Rumex crispus L. (lengua de vaca). b. Evaluar el efecto in vitro del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L.. DE. frente a Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. CA. c. Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de la raíz. TE. de Rumex crispus L. (lengua de vaca) frente a Escherichia coli y Staphylococcus. BI. BL IO. aureus.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II MATERIAL Y MÉTODO. 1.1. MATERIAL. 1.1.1. MATERIAL BIOLÓGICO Material Vegetal: Se utilizó 1Kg de la raíz de Rumex crispus L.(lengua. M IC A. 1.1.1.1.. de vaca), recolectadas del distrito de Otuzco - La Libertad. Material microbiológico: Dos cepas de bacterias: Escherichia coli. Q UI. 1.1.1.2.. BI O. (ATCC 25992) y Staphylococcus aureus (ATCC 25923) que fueron. Y. proporcionadas por el Hospital Belén de Trujillo.. AC. IA. 1.1.2. MATERIAL DE VIDRIO 01 Fiolas 100 mL. “KIMAX”. -. 03 Fiolas de 25 mL. “PYREX”. -. 03 Cápsula de porcelana.. -. 01 Mortero de porcelana.. -. 04 Balones de 50 mL. “PYREX”. -. 02 Probetas de 100 mL “KIMAX”. -. 02 Vasos de precipitación de 50mL. “KIMAX”. -. 02 Vasos de precipitación de 100mL. “KIMAX”. -. 02 Vasos de precipitación de 250 mL. “KIMAX”. -. 02 Pipetas de 1 mL. “KIMAX”. -. 02 Pipetas de 5 mL “KIMAX”. -. 02 Pipetas de 10 mL. “KIMAX”. -. 15 Tubos de ensayo. “KIMAX”. BI. BL IO. TE. CA. DE. FA R. M. -. 1.1.3. EQUIPOS E INSTRUMENTOS DE LABORATORIO 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Alcoholímetro. -. Balanza analítica. -. Balanza triple brazo. -. Baño maría. -. Bomba al vacío. -. Cocina eléctrica. -. Equipo de flujo laminar. -. Refrigerante. -. Estufa. -. Incubadora Microbiológica. -. Refrigeradora. IA. Y. BI O. Q UI. M IC A. -. -. Ácido nítrico. -. Ácido pícrico. -. Ácido sulfúrico. -. Alcohol amílico. M. Ácido clorhídrico. -. CA. DE. FA R. -. AC. 1.1.4. MATERIAL REACTIVO. -. Bicloruro de mercurio. -. Carbonato de sodio cristales. -. Clorhidrato de hidroxilamina. -. Cloruro férrico. -. Hidróxido de potasio. -. Hidróxido de sodio. -. Hipoclorito de sodio. -. Ninhidrina. BI. BL IO. TE. Anhídrido Acético. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Nitrato de plata. -. Pentacloruro de antimonio. -. Subnitrato de Bismuto. -. Sudán III. -. Sulfato cúprico. -. Tricloruro de antimonio. -. Tricloruro férrico. -. Yoduro de potasio. BI O. Q UI. M IC A. -. Agua destilada. -. Etanol 96º. FA R. M. AC. IA. -. Y. 1.1.5. SOLVENTES. 1.1.6. MEDIO DE CULTIVO. Agar Muller Hinton. -. Caldo Muller Hinton. Gentamicina 10µg/mL. TE. -. CA. 1.1.7. FÁRMACO. DE. -. BI. BL IO. 1.1.8. OTROS -. Asa de platino. -. Calibrador de Vernier. -. Caja de guantes estériles. -. Gradilla. -. Mechero. -. Papel filtro. -. Placas de petri descartables. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. -. Puntas estériles. -. Rollos de algodón. -. Hisopos. M IC A. 1.2. MÉTODO. 1.2.1. RECOLECCIÓN DE LA ESPECIE. Q UI. La especie de Rumex crispus L. se recolectó del distrito de Otuzco, ubicado a 2641 m.s.n.m., a 7º54’10’’ Latitud Sur y 78º34’20’’ Longitud Oeste, en la. BI O. provincia de Otuzco de la región La Libertad 23.. Y. 1.2.2. IDENTIFICACIÓN Y DETERMINACIÓN TAXÓMICA DE LA. IA. ESPECIE. AC. Se llevó un ejemplar de la planta al Herbarium Tuxillense (HUT) para su. M. identificación y posterior verificación taxonómica según el sistema filogenético. FA R. de la especie, registrándose con el código 52886 (Anexo 1) 5. 1.2.3. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA . DE. Selección de la muestra:. CA. El material vegetal recolectado se transportó al laboratorio de. TE. Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad. BI. BL IO. Nacional de Trujillo, en donde se eliminó las sustancias extrañas presentes. . en el material vegetal. Lavado de la droga: Luego de la separación de las sustancias extrañas, se procedió a lavar el material vegetal con agua destilada, seguido de una desinfección utilizando hipoclorito de sodio a una concentración de 200 ppm. Durante 5 minutos. Posteriormente se realizó un enjuague de la raíz con suficiente agua destilada estéril, esto es para retirar los residuos de hipoclorito.. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. . Secado: Una vez lavado la raíz se procedió a realizar cortes finos a fin de adecuar la droga en bolsas de papel Kraft con orificios y se colocó en la estufa a una temperatura de 40°C.. . Pulverización:. . M IC A. Una vez secada la raíz se pulverizó con ayuda de un molino. Tamizaje:. Q UI. El material obtenido de la pulverización, se pasó a través de un set de. . BI O. tamices y se trabajó con partículas de tamaño de 2mm. Almacenamiento:. Y. El polvo de la raíz obtenida, se guardó en frascos de vidrio de color ámbar. IA. de boca ancha y en un lugar sin humedad y luz directa, hasta su posterior. DE. FA R. M. AC. utilización.. 1.2.4. PREPARACIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO:. CA. En un balón de 1 litro de capacidad, se colocaron 100 g de raíz de Rumex crispus. TE. L. (lengua de vaca) previamente molida y tamizada. Luego se añadieron 500 mL. BL IO. de etanol al 70° GL. y se llevaron a reflujo por espacio de 2 horas. Luego el extracto etanolico se filtró con papel Whatman N° 1. Posteriormente se llevó a. BI. evaporar el extracto etanolico hasta sequedad en una estufa a 40°C. El extracto seco se pesó y se guardó en refigeración a 2 °C en frasco de vidrio de color ámbar estéril.24. 1.2.5. DETERMINACIÓN DE FITOCONSTITUYENTES DEL EXTRACTO ETANÓLICO:. 24. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La determinación de metabolitos secundarios del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca) procedente del distrito de Otuzco - La Libertad, se llevó a cabo siguiendo el esquema I (Anexo N° 01) y se realizó los siguientes ensayos: . M IC A. Ensayo de Catequinas: Para ello se tomó I gota de la solución alcohólica, con la ayuda de un capilar y aplicó sobre papel filtro. Sobre. Q UI. la mancha se aplicó solución de carbonato de sodio. La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, ha de indicar un ensayo. . BI O. positivo.. Y. Ensayo de Resinas: Para detectar este tipo de compuesto, se añadió a. IA. 2 mL de la solución alcohólica, 10 mL de agua destilada. La aparición. AC. de un precipitado hubiera indicado un ensayo positivo. . FA R. M. Ensayo de Fehling: Permitió reconocer en un extracto la presencia de azúcares reductores. Para ello, si la alícuota del extracto no se. DE. encontrase en agua, debió evaporarse el solvente en baño de agua y el. CA. residuo redisolverse en 1 a 2 mL de agua. Se adicionó 2 mL del reactivo y se calentó en baño de agua 5 a 10 min. El ensayo se. BL IO. TE. considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece. BI. . precipitado rojo. Ensayo de Baljet: Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos con agrupamiento lactónico, en particular cumarinas, aunque otros compuestos lactónicos pueden dar positivo al ensayo. Para ello, si la alícuota del extracto no se encontrase en alcohol, debió evaporarse el solvente en baño de agua y redisolverse en la menor cantidad de alcohol (1 mL). En estas condiciones se adicionó 1mL del. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. reactivo, considerándose un ensayo positivo la aparición de coloración o precipitado rojo (++ y +++) respectivamente.. . Ensayo de Liebermann-Burchard: Permitió. reconocer en un. M IC A. extracto la presencia de triterpenos y/o esteroides, por poseer ambos tipos de productos un núcleo del androstano, generalmente insaturado. Q UI. en el anillo B y la posición 5-6.. Para ello, si la alícuota del extracto no se encontrase en cloroformo, el. BI O. solvente debió evaporarse en baño de agua y el residuo redisolverse. Y. en 1 mL de cloroformo. Se adicionó 1mL de anhídrido acético y se. IA. mezcló bien. Por la pared del tubo de ensayo se dejó resbalar II a III. AC. gotas de ácido sulfúrico concentrado sin agitar.. coloración:. FA R. M. Un ensayo positivo ha de reconocerse por un cambio rápido de. DE. 1. Rosado-azul muy rápido. 2. Verde intenso-visible aunque rápido.. CA. 3. Verde oscuro-negro-final de la reacción.. BI. BL IO. TE. Muy pocas veces puede observarse el primer cambio. El tercer cambio generalmente ocurrirá cuando el material evaluado tiene cantidades importantes de estos compuestos. Importante: Para realizar este ensayo no puede haber agua en el medio de reacción, pues ésta con el ácido sulfúrico reacciona de forma violenta y puede ocurrir un accidente. La reacción de Liebermann-Burchard se emplea también para diferenciar las estructuras esteroidales de los triterpenoides, las. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. primeras producen coloraciones azul o azul verdoso, mientras que para las segundas se observa rojo, rosado o púrpura. Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos, xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes.. M IC A. . Ensayo de La Espuma: Permitió reconocer en un extracto la. Q UI. presencia de saponinas, tanto del tipo esteroidal como triterpénica. De modo que si la alícuota se encontró en alcohol, se diluyó con cinco. BI O. veces su volumen en agua y se agitó, dicha mezcla, fuertemente. Y. durante 5 a 10 min.. IA. El ensayo se consideró positivo si apareciese espuma en la superficie. AC. del líquido de más de 2mm de altura y persistente por más de 2 min. . FA R. M. Ensayo del Cloruro Férrico: Permitió reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos en un extracto vegetal. Si el extracto. DE. de la planta se realizó con alcohol, el ensayo determinó tanto fenoles. CA. como taninos. A una alícuota del extracto alcohólico se le añadió III gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina. BI. BL IO. TE. fisiológica. Si el extracto fue acuoso, el ensayo determinó fundamentalmente taninos. A una alícuota del extracto se añadió acetato de sodio para neutralizar y III gotas de una solución de tricloruro férrico al 5% en solución salina fisiológica, un ensayo positivo pudo dar la siguiente información general: o Desarrollo de una coloración rojo-vino: compuestos fenólicos en general.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. o Desarrollo de una coloración verde intensa: taninos del tipo pirocatecólicos. o Desarrollo. de. una. coloración. azul,. taninos. del. tipo. pirogalotánicos. . M IC A. Ensayo de la Ninhidrina: Permitió reconocer en los extractos vegetales la presencia de aminoácidos libres o de aminas en general.. Q UI. Se tomó una alícuota del extracto en alcohol y se mezcló con 2 mL de solución al 2% de ninhidrina en agua. La mezcla se calentó 5 a 10 min. Y. desarrolle un color azul violáceo.. BI O. en baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se. . IA. Ensayo de Borntrager: Permitió reconocer en un extracto la. AC. presencia de quinonas. Para ello el solvente se evaporó en baño de. FA R. M. agua y el residuo se redisolvió en 1mL de cloroformo. Se agregó 1mL de hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amonio al 5%. Se agitó,. DE. mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su ulterior separación.. CA. Si la fase acuosa alcalina (superior) se coloreara de rosado o rojo, el ensayo se considerará positivo. Coloración rosada (++), coloración. TE. roja (+++).. BI. BL IO. . Ensayo de Kedde: Permitió reconocer la presencia de glucósidos. cardiotónicos. Una alícuota del extracto en etanol se mezcló con 1mL del reactivo y se dejó reposar durante 5 a 10 min. En un ensayo positivo se desarrolla una coloración violácea, persistente durante 1 a 2 h.. . Ensayo de Shinoda: Permitió reconocer la presencia de flavonoides en el extracto etanólico. La alícuota del extracto se diluyó con 1mL de. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ácido clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálico. Después de la reacción se esperó 5min, se añadió 1mL de alcohol amílico, se mezclaron las fases y se dejó reposar hasta que se separaron.. M IC A. Si la alícuota del extracto se hubiera encontrado en agua, se procede de igual forma, a partir de la adición del ácido clorhídrico. Q UI. concentrado.. El ensayo se consideró positivo cuando el alcohol amílico se coloreó. BI O. de amarillo, naranja, carmelita o rojo; intensos en todos los casos. . Y. Ensayo de Antocianidinas: Permitió reconocer en los extractos. IA. vegetales la presencia de estructuras de secuencia C6-C3-C6 del grupo. AC. de los flavonoides. Se calentó 2 mL del extracto etanólico 10 min.. FA R. M. con 1 mL de HCl cc, se dejó enfriar y se añadirá 1 mL de agua y 2mL de alcohol amílico. Se agitó y se dejó separar las dos fases. La. DE. aparición de color rojo a marrón en la fase amílica fue indicativo de. Ensayo de Dragendorff: Permitió reconocer en un extracto la. TE. . CA. un ensayo positivo.. BI. BL IO. presencia de alcaloides, para ello, la alícuota del extracto se evaporó en baño de agua y el residuo se redisolvió en 1 mL de ácido clorhídrico al 1%. Con la solución acuosa ácida se realiza el ensayo, se añade III gotas del reactivo de Dragendorff, si existiera: opalescencia se ha de considerar (+), turbidez definida (++), precipitado (+++).. . Ensayo de Mayer: Se realizó según la forma descrita anteriormente, hasta obtener una solución ácida. Se añadió luego, una pizca de cloruro de sodio en polvo, se agitó y filtró. Se añadió II o III gotas de 27. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. la solución reactiva de Mayer, y si observase: opalescencia (+), turbidez definida (++), precipitado coposo (+++). . Ensayo de Wagner: Se partió al igual que en los casos anteriores de la solución ácida, se añadió II o III gotas del reactivo y clasificando. Q UI. M IC A. los resultados de la misma forma 24.. BI O. 1.2.6. ENSAYO MICROBIOLÓGICO: 25. EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA IN. Y. VITRO. AC. IA. Se empleó la técnica de difusión en pozos de Agar basada en el método de. FA R. Microorganismos. M. Kirby- Bauer modificado25.. Se trabajó con dos cepas bacterianas patógenas tipificadas, Gram positiva:. DE. Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y una bacteria Gram negativa:. CA. Escherichia coli (25992) proporcionadas por el Hospital Belén de Trujillo.. TE. Preparación de la muestra. BL IO. Se preparó a partir del extracto etanólico seco de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca) se preparó, una disolución de 200 mg/mL. De esta. BI. solución madre se preparó diluciones de 5 mg/mL, 10 mg/mL, 15 mg/mL disueltas en etanol de 70° GL.. Reactivación de las cepas Las bacterias fueron reactivadas en caldo Muller Hinton y se incubaron durante 18 horas a 37°C. Luego se tomó una asada de cada bacteria y se. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ajustó con solución fisiológica al patrón de turbidez de Mac Farland N° 0.5 (108 UFC/mL). Sembrado Se colocó en 8 placas de Petri, 20 mL de Agar Muller Hinton. Solidificado. M IC A. cada agar, se sembraron sobre la superficie de cada 4 placas de Petri las bacterias de Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Escherichia coli. Q UI. (25992) respectivamente. Se hisoparon uniformemente, girando cada placa 30 grados por 10 veces aproximadamente. Las placas recién sembradas. IA. Y. BI O. fueron colocadas en una estufa a 37°C de temperatura durante 10 minutos.. AC. Elaboración de los pozos de Agar. FA R. M. Se tomó 4 placas por cada microorganismo respectivo. Sobre estas placas sembradas se realizó 4 perforaciones de 11mm de diámetro, con un. DE. sacabocado y se sellaran con 0,1mL del mismo agar, para evitar la dispersión de los extractos.. CA. Posteriormente se colocó 200 μL del extracto etanólico de la raíz de Rumex. TE. crispus L. a las concentraciones de 5% p/v, 15% p/v y 30% p/v.. BL IO. Además se colocó como control negativo 200 μL de etanol de 70° G.L. y. BI. como control positivo se usó Gentamicina en concentración de 10 µg/mL en cada perforación. Luego las placas de Petri se incubaron a 37°C por 24 horas. Se determinó los diámetros de halo de inhibición del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. a las concentraciones de 5% p/v, 15% p/v y 30% p/v frente a los microorganismos en estudio.. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Finalmente, se calculó el porcentaje de inhibición mediante la fórmula siguiente:. 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑚𝑚)−𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙−𝐷𝑖á𝑚𝑒𝑡𝑟𝑜 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜. Q UI. M IC A. % 𝐼𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =. BI O. Diámetro del blanco = Halo de Inhibición de etanol en mm.. AC. IA. Y. Diámetro del Control = Halo de Inhibición de gentamicina en mm.. FA R. M. DETERMINACION DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI). DE. MÉTODO DE DILUCIÓN EN AGAR. CA. Preparación de la muestra. TE. Se preparó concentraciones de 5 mg/mL, 2.5 mg/mL, 1 mg/mL, 0.5. BL IO. mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.1 mg/mL del extracto etanólico de la raíz de Rumex. BI. crispus L.. Reactivaciones de las cepas Las bacterias fueron reactivadas en caldo Muller Hinton y se incubaron durante 18 horas a 37°C. Luego se tomó una asada de cada bacteria y se ajustó con solución fisiológica al patrón de turbidez de Mac Farland N° 0.5 (108 UFC/mL).. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Enfrentamiento con los microorganismos Se utilizó microplacas de fondo plano de 24 pozos, en las cuales se colocó 1mL de agar Muller Hinton (CMH) y cuando el medio aún estuvo líquido. M IC A. se añadió 10 µL de cada una de las concentraciones del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. preparadas anteriormente, luego en cada. Q UI. pozo se colocó 2 µL de la suspensión del inóculo de cada bacteria y se incubó a 37 °C por 24 horas.. BI O. Se empleó como control negativo etanol y como control positivo. IA. condiciones anteriormente descritas.. Y. gentamicina a una concentración de 10 µg/mL y se trabajó bajo las. AC. Después de 24 horas de incubación a 37°C, las microplacas se examinaron. FA R. M. visualmente. Se consideró la concentración mínima inhibitoria a la menor concentración del extracto a la cual el microorganismo ensayado no. DE. presentó desarrollo visible. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.. CA. ANÁLISIS ESTADÍSTICO. TE. El análisis estadístico se realizó utilizando el programa estadístico SPSS 18.0. BL IO. (Statistical Package for the Social Sciences), aplicando la prueba de Análisis de. BI. Varianza Unidireccional (ANOVA) para observar si hay diferencia significativa entre las diferentes concentraciones.26. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. Tabla N° 01: Fitoconstituyentes presentes en el extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca) procedente del distrito de Otuzco - La Libertad. Catequinas. +. Resinas. Resinas. Azúcares Reductores. Fehling. Lactonas. Baljet. Triterpenos y Esteroides. Liebermann - Burchard. Saponinas. Espuma. +++. +. ++. +. -. -. +++. +. y Cloruro Férrico. +++. +. +++. +. Shinoda. +. +. Kedde. -. -. ++. + -. IA. AC M. DE. Bornträger. CA. TE. BL IO. Antocianidina. Y. BI O. -. Quinonas. Cardenólicos. Antocianidinas. Aminoácidos. Ninhindrina. -. Alcaloides. Dragendorff. -. Mayer. -. Wagner. -. Hager. -. BI. +. -. taninos. Flavonoides. Identificación. M IC A. Catequinas. Compuestos fenólicos. Intensidad. Q UI. Ensayos. FA R. Fitoconstituyentes. -. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Leyenda:. INTENSIDAD: +. Baja. IDENTIFICACIÓN:. Moderada. +++. Alta. Positivo. –. Negativo. BI. BL IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI O. Q UI. M IC A. ++. +. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla N° 02: Actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico de las raíces de Rumex crispus L. frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25992). Halo a las 24 horas.. M IC A. HALO DE INHIBICIÓN (mm). CONTROL. Q UI. MICROORGANISMOS. 15%. 10 µg/mL Etanol 70°. 30 %. Staphylococcus aureus. AC. IA. Y. 5%. Gentamicina. BI O. CONCENTRACIÓN DEL EXTRACTO ETANÓLICO. BLANCO. 19.7±0.58*. FA R 12.8±0.29*. 30.3±0.58*. 0. 15.3±0.58*. 17.2±0.29*. 28.8±0.29*. 0. TE. CA. DE. Escherichia coli ATCC 25922. 25.3±0.58*. M. ATCC 25923. 21.8±0.29*. BL IO. p0.05 comparado con el grupo control positivo (test de ANOVA). BI. *: Promedio del halo de inhibición de 3 placas y desviación estándar.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 90% 83% 80% 72% 65% 59%. 60% 50%. M IC A. 53% 44%. S.aureus. Q UI. 40% 30%. E. coli. BI O. Porcentaje de inhibiciòn. 70%. Y. 20%. AC. IA. 10% 0%. 15%. 30%. M. 5%. DE. FA R. Concentración extracto etanólico Concentración del del extracto hidroalcohólico. CA. Fig.1 Porcentaje de inhibición del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. frente. BI. BL IO. TE. a Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25992).. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Tabla N° 03: Concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de las raíces de Rumex. M IC A. crispus L. frente a Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25992).. Concentración del extracto etanólico. 5.0. 2.5. mg/mL. mg/mL. 1.0. 0.5. 0.25. mg/mL. mg/mL. mg/mL. 0.1 mg/mL. FA R. M. AC. IA. MICROORGANISMOS. Y. BI O. Q UI. MICROORGANISMOS. Escherichia coli. -. -. +. +. +. +. -. -. -. +. +. +. DE. ATCC 25922. CA. Staphylococcus aureus. BI. BL IO. TE. ATCC 25923. Crecimiento (+). Ausencia de crecimiento (-). 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. IV. DISCUSIÓN. La Tabla N° 01 muestra los fitoconstituyentes presentes en el extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca), los cuales son: catequinas, azucares reductores, lactonas, saponinas, compuestos fenólicos,. M IC A. taninos, quinonas, flavonoides, antocianidinas, lo cual coincide con los estudios realizados en Colombia por Gómez y col.27 en el año 2003, los cuales. Q UI. confirmaron la presencia de flavonoides, terpenos, sesquiterpenlactonas,. BI O. quinonas en el extracto etanólico de Rumex crispus L. también encontraron glicósidos y cumarinas en dicho extracto. Asimismo manifiestan que el. Y. extracto etanolico de R. crispus L. no presenta alcaloides lo que coincide con el. AC. IA. presente trabajo de investigación. Se utilizó como solvente el etanol debido a que este ofrece la capacidad de formar enlaces de hidrogeno y de ceder pares de. FA R. M. electrones, debido al grupo que este presenta; así también, como el agua, pero además también poseen un extremo lipófílo que puede ayudar a la solvatación. DE. de sustratos orgánicos, entre ellos muchos metabolitos secundarios con efecto. CA. antibacteriano como los compuestos fenólicos, saponinas, quinonas 28, 29.. TE. La Tabla N° 02 muestra el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico. BL IO. de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca), en el que se comprueba el efecto antibacteriano en cepas de Staphylococcus aureus y Escherichia coli,. BI. posiblemente por alguno de los mecanismos posteriormente mencionados, de alguno o varios metabolitos secundarios que posee el extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. Todos los ensayos realizados con el extracto etanólico en cantidades crecientes han presentado efecto antibacteriano in vitro sobre las cepas en estudio y, alcanzando halos de inhibición de diámetros promedio desde 12.8 mm en su concentración más baja de 5%, hasta 17.2 mm en su 37. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. concentración más alta 30% para Escherichia coli; y halos de inhibición desde 19.7 mm en su concentración más baja de 5%, hasta 25.3 mm en su concentración más alta 30% para Staphylococcus aureus 30, 31,32. La figura 1, muestra los porcentajes de inhibición del extracto etanólico de la. M IC A. raíz de Rumex Crispus L. (lengua de vaca) a las concentraciones 5%, 15% y 30%, observando que el menor porcentaje fue 65% para Staphylococcus aureus. Q UI. y 44% para Escherichia coli a una concentración al 5%; y el mayor porcentaje. BI O. de inhibición fue 83% para Staphylococcus aureus y 59% para Escherichia coli, usando la concentración al 30%, demostrando así que, a medida que. Y. aumentamos la concentración del extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus. AC. IA. L. (lengua de vaca), también aumenta el porcentaje de inhibición sobre el crecimiento de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, debido a que hay una. FA R. M. mayor cantidad de fitoconstituyentes disueltos en el extracto de mayor concentración.. DE. El efecto antibacteriano que presenta la raíz de Rumex crispus L. es debido a la. CA. presencia de metabolitos secundarios como: los flavonoides que contienen en su. TE. estructura química un número variable de grupos hidroxilo fenólicos que. BL IO. penetran fácilmente a través de la membrana celular bacteriana, se combina y precipitan las proteínas protoplasmáticas desnaturalizándolas y actuando como. BI. venenos protoplasmáticos 33, 34. Asimismo estos flavonoides provocan la muerte bacteriana al inhibir la síntesis de ADN o ARN debido a que tienen una estructura plana similar a la de las bases púricas y pirimídicas, por lo tanto se pueden intercalar formando puentes de hidrógeno con las bases de la doble hélice y de esta forma las flavonas alteran la estructura tridimensional de los ácidos nucleicos, impidiendo su adecuada síntesis de novo, además de provocar 38. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. errores de lectura durante la transcripción 35. De igual manera los taninos se cree que la actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción sobre las adhesinas, proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a polisacáridos. Los taninos condensados llamados proantocianidinas. M IC A. son compuestos fenólicos estables que pueden prevenir la expresión de las fimbrias P de E. coli como parte de su actividad antibacteriana, y además tienen. Q UI. actividades antioxidantes36. Asimismo otros investigadores mencionan que la actividad antimicrobiana de los taninos incluyen, la posible inhibición de las. BI O. enzimas microbianas extracelulares, la privación de los sustratos necesarios para. Y. el crecimiento microbiano o la acción directa sobre el metabolismo microbiano. IA. mediante la inhibición de la fosforilación oxidativa, y por último se sabe de un. AC. mecanismo de privación de hierro; pero muchos microorganismos pueden. FA R. M. superar las defensas de las plantas sobre la base de taninos ya a través de la síntesis de complejos tanino- polímeros, oxidación, biodegradación de taninos o. DE. de síntesis de sideróforos 37.. CA. Otro metabolito implicado en el efecto antibacteriano son las quinonas las cuales. TE. presentan un rango amplio, actuando posiblemente sobre las adhesinas expuestas en la superficie de las bacterias, sobre los polipéptidos de la pared celular y sobre las enzimas. BL IO. unidas a membranas 38.. BI. Por otro lado, las saponinas son un grupo de sustancias glicosídicas que se disuelven en agua y poseen la propiedad de formar espuma al agitar la solución. Se cree que la toxicidad de las saponinas es debido a su capacidad de formar complejos con esteroles de las membranas celulares produciendo grandes poros en las mismas que alteran su permeabilidad y la célula se lisa, ocasionando la ruptura de las membranas bacterianas. 39, 40. .. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los controles negativos realizados con etanol 70° nos sirvió para identificar si estos poseen actividad antibacteriana, que puede interferir en los resultados obtenidos, ninguno de los solventes mostraron efecto inhibitorio sobre el crecimiento de las cepas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus 41, 42,43.. M IC A. La Tabla N° 03 muestra la Concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de las raíces de Rumex crispus la cual es 2.5 mg/ml para Escherichia. Q UI. coli (ATCC 25992) y 1 mg/ml para Staphylococcus aureus (ATCC 25923).. BI O. Entendemos por CMI, a la concentración más baja de un antimicrobiano para inhibir el crecimiento visible de un microorganismo después de su incubación,. Y. esto es importante en diagnósticos de laboratorio para confirmar la resistencia. AC. IA. de microorganismos a un agente antimicrobiano y además para monitorizar la. M. actividad de los nuevos agentes antimicrobianos 44.. FA R. La explicación de esto, responde a que las bacterias Gram-negativas como Escherichia coli presentan dos membranas lipídicas una interna y otra externa, entre las que se. DE. localiza una fina pared celular de peptidoglicano. La membrana externa protege a las. CA. bacterias de varios antibióticos, colorantes y detergentes que normalmente dañarían la. TE. membrana interna o la pared celular de peptidoglicano, por ello se necesita una mayor. BL IO. concentración del extracto etanólico de las raíces de Rumex crispus para inhibir a Escherichia. coli, mientras que las bacterias Gram-positivas como Staphylococcus. BI. aureus presentan sólo una membrana lipídica y la pared de peptidoglicano es mucho más gruesa fácilmente destruible por los antimicrobianos, por eso su CMI es menor 45.. Asimismo los resultados encontrados en el presente trabajo sobre el efecto antibacteriano de la especie Rumex Crispus L. (lengua de vaca) frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli, coincide con otros trabajos, como por ejemplo el estudio realizado por Yildirim A, y col.. 45. en Turquía en el año 2001 el cual se tituló determinación de. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. antioxidantes y antimicrobianos en extractos de Rumex crispus L.; de igual modo, Coruha I. y col. 46 en el año 2008 realizaron un estudio referido al contenido total de compuestos fenólicos, antioxidantes, y actividad antibacteriana de Rumex crispus silvestre demostrando que Rumex crispus se puede utilizar como una fuente efectiva y segura de antioxidantes y agentes antibacterianos. Por lo tanto ambos estudios afirman o refuerzan. BI. BL IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. Y. BI O. Q UI. M IC A. los resultados obtenidos en el presente trabajo.. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. V. CONCLUSIONES. a. El extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca), presenta los siguientes fitoconstituyentes: catequinas, azucares reductores, lactonas, saponinas, quinonas, flavonoides, antocianidinas, compuestos fenólicos y. M IC A. taninos.. b. El extracto etanólico de la raíz de Rumex crispus L. (lengua de vaca), a. BI O. Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. Q UI. concentraciones 5%, 15% y 30% posee efecto antibacteriano in vitro frente a. c. La concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico de la raíz de Rumex. Y. crispus L. (lengua de vaca), para Escherichia coli es 2.5 mg/mL, mientras. BI. BL IO. TE. CA. DE. FA R. M. AC. IA. que para Staphylococcus aureus es 1 mg/mL.. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 1.. Quezada A. Las plantas medicinales. [Revista Biocenosis]* 2008 [acceso 23 de noviembre de 2013]**;. vol.. 21:. [Pages. 01. -. 08].. Disponible. en:. http://web.uned.ac.cr/biocenosis/images/stories/articulosVol21/Biocenosis21_06.pf Gutiérrez M. Fitoconstituyentes de las hojas de Psoralea glandulosa y efecto del infuso sobre. M IC A. 2.. la Glicemia en Rattus rattus var. albinus con hiperglicemia experimental. [En Línea]* 2006 [acceso 23 de noviembre de 2013]**; vol. 03: N° 02. [Pages 85-90]. Disponible en:. Siles J. Plantas medicinales. Costa Rica: Unión Mundial para la naturaleza. [En Línea]* 2001.. [acceso:. 25. de. noviembre. BI O. 3.. Q UI. http://revistas.concytec.gob.pe/scielo.php?pid=S1817- 20752006000200002&script=sci_arttext. de. 2013].Disponible. en:. Colquicocha V. y Lozano A. Efecto del extracto acuoso de Gentianella bicolor sobre la. AC. 4.. IA. Y. http://www.generoyambiente.org/arcangel2/documentos/155.pdf. M. glicemia en Rattus rattus var.albinus con prueba de tolerancia a la glucosa. [Tesis para optar. FA R. el título profesional de Químico Farmacéutico] Trujillo: Universidad Nacional de Trujillo; 2001. Calderón J. Caracterización fitoquímica, actividad antibacteriana y antioxidante de extractos. DE. 5.. 2011. [acceso. CA. de plantas medicinales utilizadas en Pereira y Santa Rosa de Cabal (Risaralda). [En Línea]* 23. de. noviembre. de. 2013]**;. [Pages. 85-90].. Disponible. en:. Cabrera D. Tamizaje fitoquímico y actividad antibacteriana de extractos de Bryophyllum. BL IO. 6.. TE. http://repositorio.utp.edu.co/dspace/bitstream/11059/2265/1/54764C146.pdf. pinnata. [Rev. Química Viva]* 2011 [acceso 23 de noviembre de 2013]**; N° 01. [Pages 85-90].. BI. Disponible en: http://www.quimicaviva.qb.fcen.uba.ar/v10n1/cabrera.pdf.. 7.. Pahlow M. Polygonaceae: Rumex crispus L. [En Línea]* 2007 [acceso 20 de diciembre de 2013]*.. [Pages. 1-5].. Disponible. en:. http://www.conabio.gob.mx/malezasdemexico/polygonaceae/rumexcrispus/fichas/ficha.htm. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/.