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Estudio bacteriológico del paciente pediátrico
con diagnóstico probable de tuberculosis
García-González Rafael,* Nájera-Garduño María del Consuelo,‡ Arzate-Barbosa Patricia,‡ Reyes Torres Angélica*
RESUMEN
La tuberculosis es una enfermedad infectocontagiosa trans-mitida principalmente a través de vías aéreas considerada un problema de salud pública. La diseminación de Mycobacte-rium tuberculosis a partir de pacientes altamente bacilíferos es determinante en el niño que funge como reservorio de los futuros casos de tuberculosis, por lo que su diagnóstico en estos pacientes es fundamental para su detección con el fi n de establecer el tratamiento correcto y oportuno. Aun cuando se cuenta con técnicas de diagnóstico sencillas y precisas y con tratamientos efi caces, el diagnóstico de tuberculosis en el paciente pediátrico es difícil. La sintomatología y los datos revelados durante la exploración física son inespecífi cos y poco signifi cativos en las formas leves y moderadas de la enfermedad. Ante esta situación, la información disponible del paciente pediátrico es limitada, lo que ocasiona que sea olvidado, que por su naturaleza no infecciosa no se le incluya en los programas o se le considere sin riesgo para la salud pública. El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) en pacientes pediátricos con el fi n de confi rmar el diagnóstico clínico de tuberculosis. La metodología empleada fue la obtención de muestras provenientes del aparato respiratorio, determinación fenotípica de M. tuberculosis (tinción de ZiehlNeelsen, cultivo en medio líquido y sólido e identifi -cación bioquímica), así como la determinación genotípica mediante el empleo de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los resultados obtenidos fueron 13.4% de positividad para la baciloscopia, 43% para el cultivo y 57% para la PCR.
Conclusión: De las tres pruebas aplicadas, la baciloscopia fue la menos sensible y la PCR fue la más alta; sin embargo, la diferencia es mínima con respecto al cultivo.
ABSTRACT
Tuberculosis is an infectious disease transmitted mainly through airways and considered a public health problem. The spread of Mycobacterium tuberculosis from highly smear-positive patients is decisive in children infected considered the reservoir of future cases of tuberculosis, so his diagnosis in these patients, it is essential for detection in order to provide the correct treatment and timely. Although there are simple techniques, accurate diagnosis and eff ective treatment with the diagnosis of tuberculosis in pediatric patients it is diffi cult. The symptoms, the data found during physical examination are nonspecifi c and insignifi cant in the mild and moderate forms of the disease. In this situation, the account information that pediatric patient is limited which makes this be forgotten, for its non-infectious nature, not having been considered or no risk to public health programs. The aim of this work was to determine the presence of BAAR in pediatric patients in orden to confi rm the clinical diagnosis. The methodology used was to obtain samples from respiratory, phenotypic determination of M. tuberculosis (Ziehl-Neelsen, culture in liquid and solid media and biochemical identifi cation) and genotypic determination with the use of chain reaction (PCR). The results obtained were 13.4% for smear positivity, 43% for cultivation and 57% for PCR. Conclusions: Of the three tests applied smear was the least sensitive and PCR was the highest, but there is little diff erence from the crop.
* Laboratorio de la Coordinación de Enseñanza, Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Medicina, UNAM, México.
‡ Departamento de
Análisis Clínicos y Pruebas especiales, Instituto Nacional de Pediatría, Secretaría de Salud, México.
Correspondencia: Rafael García-González Facultad de Medicina. Edificio A, Primer piso, Universidad Núm. 3000, Circuito Interior, 04510, Ciudad de México, México. Tel. 5623 2390 E-mail: rafagargon@ hotmail.com
Palabras clave:
Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, baciloscopia, reacción en cadena de la polimerasa.
Key words: Mycobacterium tuberculosis, tuberculosis, microscopy morphology, polimerasa chain reaction.
INTRODUCCIÓN
L
a tuberculosis es una enfermedad infec-tocontagiosa transmitida principalmente a través de vías aéreas..1 Se le considera unode los grandes problemas de salud pública, ya que un tercio de la población mundial se encuentra infectada y cada año surgen nueve millones denuevos casos, de los cuales
apro-ximadamente dos millones fallecen por esta enfermedad.2 Desde el año 2000, 22 países
presentan 80% del total de casos de tuber-culosis a nivel mundial. En la diseminación de Mycobacterium tuberculosis, los pacientes altamente bacilíferos (adultos, niños con tuberculosis congénita y niños mayores con tuberculosis semejante a la del adulto) gene-ran expectoraciones con cerca de 100,000
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bacilos ácido alcohol resistentes por mililitro (BAAR/mL), que en ambientes cerrados son determinantes en la transmisión del padecimiento y es del niño infectado con M. tuberculosis considerado el reservorio de quien se originarán los futuros casos de tuberculosis, por lo que el diagnóstico en estos pacientes es fundamental en la detección de la infección con el objeto de establecer el
tratamiento correcto y oportuno.1,3-10
Se ha estimado que 550,000 casos se presentaron en niños, lo que equivale al 6% del total con 80,000
de-cesos,11,12 quienes muestran inicialmente una infección
primaria, casi siempre pulmonar, carente de elementos clínicos y radiológicos en las primeras semanas y sólo la prueba de la tuberculina es positiva entre la segunda y sex-ta semana. En los niños menores de cinco años de edad el comportamiento epidemiológico, la presentación clínica y otros elementos de diagnóstico de tuberculosis son dife-rentes a los del adulto. De ahí el nombre de sintomáticos
respiratorios (SR).7,12,13 Frente a esta situación, la
informa-ción disponible del paciente pediátrico es limitada, por tal motivo estos pacientes son olvidados, por su naturaleza no infecciosa no se les incluye en los programas o se les
considera sin riesgo para la salud pública.14 Aunque se
dispone de técnicas de diagnóstico sencillas y precisas, así como con tratamientos eficaces, el diagnóstico de
tu-berculosis en el paciente pediátrico es difícil.15,16 Por esta
razón durante mucho tiempo estos pacientes quedaron excluidos de toda estadística y por ende de tratamiento, ya que sólo se consideraba como tuberculosis aquella demostrada por baciloscopia positiva, situación que se observa con poca frecuencia en tuberculosis infantil de tipo primaria por ser pacientes paucibacilares. Por otro lado en el diagnóstico microbiológico de tuberculosis se requiere una muestra apropiada cuya obtención se dificul-ta en el paciente pediátrico, lo que propicia disminución en el número de baciloscopias y cultivos positivos, como
lo refiere A Mukherjee y otros autores.4,8,9,17-23 A estas
dificultades se agrega el tiempo prolongado de incuba-ción que requiere el cultivo convencional, aun cuando se
empleen sistemas automatizados.24-26 En consecuencia la
aplicación de la biología molecular es una alternativa para
detectar e identificar M. tuberculosis a partir de muestras
clínicas y de cultivo.15,27-30
El objetivo de este trabajo fue determinar la presencia de BAAR en pacientes pediátricos con el fin de confirmar el diagnóstico clínico de tuberculosis.
MATERIAL Y MÉTODOS
Cepa de referencia y control: Mycobacterium tuberculosis
H37Rv.
Muestras clínicas: Se emplearon muestras prove-nientes de vías respiratorias, lavado gástrico, aspirado broncoalveolar, expectoración y líquido pleural de 82 pacientes de ambos sexos, 51% del sexo masculino y 49% del femenino, de edad comprendida entre 3 meses y 17 años, con diagnóstico presuntivo de tuberculosis (Figura 1). El número promedio de muestras por pacien-te fue de tres. Éstas se recibieron en frascos de boca ancha con tapón de rosca, estériles de acuerdo con las
especificaciones requeridas.7,10,26,31 Todas ellas fueron
sometidas a descontaminación y concentración con el método de Petroff, se empleó hidróxido de sodio al 4.0% (NaOH 4.0 g, agua destilada c.b.p. 1,000 mL, rojo de fenol 0.04 g) y neutralización con ácido clorhídrico al 1
N (HCl 36.5 mL y agua destilada c.b.p. 1,000 mL).24,26,31
Las muestras descontaminadas se sometieron a cen-trifugación (3,000 rpm) durante 15 minutos. Ya descon-taminadas y concentradas se les practicó frote, tinción de Ziehl-Neelsen y cultivo. En un vial de 1.5 mL se almacenó
aproximadamente 1.0 mL de la muestra a < 20 oC. A
partir de este material se realizó lisis celular para obtener ácido desoxirribonucleico (ADN) y efectuar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Los pasos a seguir fueron los siguientes: el frote fue fijado con calor y se efectuó tinción de Ziehl-Neelsen utilizando fucsina fenicada (fucsina básica 3.0 g, eta-nol 95% 100 mL, feeta-nol acuoso 55 mL y agua destilada hasta completar 1,000 mL). Como solución decolorante (alcohol ácido). Ácido clorhídrico (30 mL) y etanol 95% (970 mL). Como colorante de contraste se usó
azul de metileno (azul de metileno 1.0 g y etanol 95o
100 mL).6,24Posteriormente se procedió a observación
microscópica, para lo cual se empleó microscopio Olympus e inmersión de acuerdo con lo recomendado
por la literatura.6,24
< 1 año 1 a 2 3 a 5 6 a 11 12 a 18 años años años años
Figura 1. Frecuencia de pacientes con tuberculosis estudiados por grupos de edad.
Frecuencia
30 25 20 15 10 5 0
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Para el cultivo de la muestra se usó el medio sólidode Lowenstein-Jensen (LJ) que fue inoculado con 0.15-0.3 mL de la muestra descontaminada y concentra-da.24,26,31 Su incubación se obtuvo a una temperatura de
35-37 oC, colocando los tubos inclinados una vez que
fueron inoculados para asegurar que la muestra cubriera toda la superficie del medio y con los tapones flojos para lograr una concentración adecuada de oxígeno. La revisión de los cultivos se realizó a las 48 horas, a 7, 30 y 63 días, tiempo final para descartar todos aquéllos
que fueron negativos.24,26,31
De manera paralela se empleó el Sistema de MB/BacT (caldo Middlebrook 7H9) con suplemento liofilizado que contenía amfotericina B (0.0180% peso/volumen), azlo-cilina (0.0034% peso/volumen), ácido nalidíxico (0.04% peso/volumen), polimixina B (10,000 unidades) y trimeto-prima (0.0105% peso/volumen). Solución reconstituyente MB/BacT, compuesto de Tween 80 (0.4% peso/volumen), glicerol (5% peso/volumen) y amaranto en agua (0.002% peso/volumen) de Organon Teknika. Una vez inoculados
se incubaron a 37 oC durante 56 días. Su monitoreo fue
continuo (cada 10 minutos), detectándose la producción de dióxido de carbono como producto del desarrollo de Mycobacterium.31
Todos los medios de cultivo, tanto positivos como negativos en LJ y MB/Bact fueron sometidos a tinción de Ziehl-Neelsen al finalizar el periodo de incubación para
su observación microscópica. Se procedió enseguida a
las pruebas bioquímicas a partir de los cultivos positivos;
niacina, catalasa a 68 oC y reducción de nitratos con las
que se evidenció M. tuberculosis,que el caso del medio
de LJ permitió además verificar el tiempo de desarrollo, la morfología rugosa de la colonia incolora y el arreglo en
cordón observado a partir del medio líquido.24,27,31
Previo a la extracción del ADN la muestra fue lavada con amortiguador TE pH 8.0 (Tris Cl 10 mM pH 8.0, EDTA 1 mM pH 8.0).
La lisis celular se realizó con el amortiguador TE pH 8.0, lisozima al 3.3% en TE, pH 8.0, duodecilsulfato de sodio al 20% y perclorato de sodio 5 M. La extracción final se efectuó con fenol cloroformo alcohol isoamílico (24:23:1), cloroformo alcohol isoamílico (1:1) y precipitación con acetato de sodio 3M, pH 5.2, etanol absoluto y etanol al 75%.31,32 La concentración del producto fue calculada por espectrofotometría a 260 nm (DU-65 Spectrophotometer Beckman).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ob-tuvo mediante los iniciadores IS1 e IS2 que permitieron amplificar un fragmento de 123 pares de bases (pb) de ADN de la secuencia de inserción 6110 (IS 6110) del
Complejo M. tuberculosis.33 El procedimiento seguido
de manera breve fue el siguiente: la mezcla con la que se trabajó se preparó empleando el amortiguador de
reacción 10X que contenía MgCl2 25 mM/L,
trifosfa-tos de desoxinucleótidos 1.25 mM/L, iniciadores IS1 5’CCTGCGAGCGTAGGCGTCGG 3’ e IS2 5’ CTCGTC
CAGCGCCGCTTCGGG 3’ (Lakaside) 10 pmoL/μL de
cada uno, Taq polimerasa 5 U/mL (Fermentans), ADN
blanco 10 pmoL y agua libre de nucleasa.31,32
El volumen final fue de 50 μL y la reacción se efectuó
en un termociclador Axygen Maxygene, Therm-1001.
Iniciando la desnaturalización a 95 oC durante cinco
minutos. Seguido de 32 ciclos de desnaturalización a
95 oC, alineación a 68 oC y extensión a 72 oC por un
minuto cada paso. La extensión se prolongó por dos segundos cada ciclo y al final se incluyó una extensión
de ocho minutos.31,32
La detección del producto se realizó con electrofo-resis en geles de Agarosa ultrapura (GIBCO/BRL) al 2%. Teñido con bromuro de etidio (Sigma) y visualizado
usan-do un Gel Doc XR. Bio Rad, Hércules, CA, USA.31,32,34-36
RESULTADOS
Se estudiaron muestras clínicas provenientes de un total de 82 pacientes, 40 del sexo femenino y 42 del sexo masculino, con un rango de edad entre 3 meses y 17
años y con diagnóstico probable de tuberculosis (figura
1). El número de muestras por cada paciente fue de tres.
Desde el punto de vista bacteriológico (figura 2) se
detectaron 11/82 pacientes con baciloscopias positivas a BAAR a través de los frotes teñidos con la técnica de Ziehl-Neelsen, lo que corresponde al 13.4% del total
de los pacientes estudiados (figura 3). En tanto que
35/82, 43% de los pacientes fueron positivos al cultivo,
confirmándose la especie M. tuberculosis mediante la
identificación bioquímica.
La amplificación del ADN de los lisados obtenidos directamente de las muestras clínicas empleando la
Baciloscopia Cultivo PCR
Figura 2. Resultados positivos de las pruebas bacteriológicas realizadas.
60 50 40 30 20 10 0
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Figura 3. Tinción de Ziehl-Neelsen de frote realizado a partir de cultivo líquido empleado en el desarrollo de Mycobacterium
tu-berculosis.
w
w
w
w
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g
g
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa de productos de 123 pares de bases (pb), obtenidos por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), teñidos con bromuro de etidio, con empleo de IS6110.
1. M. tuberculosis H37Rv. 2. 1LG. 3. 2LG. 4. 3 LG. 5. LG, 6. Control negativo, 7. Marcador de peso molecular.
Segmento 123 pb
1 2 3 4 5 6 7
IS6110 puso de manifiesto la presencia de un fragmento de 123 pares de bases (pb) en 47/82 de las muestras que
corresponde al 57% del total de éstas (figura 3).
Proce-dimiento que también fue empleado en la confirmación en los cultivos puros obtenidos, poniendo en evidencia
la presencia del Complejo Mycobacterium tuberculosis
(figura 4).
DISCUSIÓN
La tuberculosis es una enfermedad altamente contagiosa cuya principal vía de transmisión es la aérea, se adquie-re a partir de la expectoración de pacientes altamente
bacilíferos con lesiones abiertas.3,7,37-39 Su localización
más frecuente es la pulmonar (80-85%)7 y el niño es
considerado «el centinela de esta enfermedad» al estar
en contacto con este tipo de enfermos.3,21,37
La tuberculosis es un problema que lejos de tener una solución se encuentra presente sobre todo en paí-ses de escasos recursos económicos, ya que «el ritmo con el que se avanza para su eliminación es demasiado
lento».21,36,40-43 Alrededor de un tercio de la población
mundial, equivalente a cerca de dos mil millones de
personas, están infectadas con M. tuberculosis. De
acuerdo con reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS) en 2013 se estimó que 9.4 millones de personas desarrollaron tuberculosis, con un rango de 8.6 a 9.4 millones, lo que equivale a 126 casos/100,000 ha-bitantes. De los cuales 1.5 millones murieron y 360,000 eran VIH positivos. En 2014 se calcularon 9.6 millones de nuevos casos de tuberculosis, de los que 5.4 millones eran hombres, 3.2 millones eran mujeres y un millón, niños. Se le considera la segunda causa de muerte por
procesos infecciosos después del VIH.11,40-43 Desde el
punto de vista geográfico de los 9.4 millones que de-sarrollaron tuberculosis en 2013, los continentes con las cifras más altas fueron Asia (56%) y África (29%), el
sobrante 15% está distribuido en el resto del planeta11
con mayor incidencia en el área urbana con respecto a la rural. La sintomatología de la tuberculosis primaria presente en niños pequeños se considera inespecífica, sus síntomas característicos son tos seca, irritativa y ex-pectoración persistentes por más de dos semanas, a estas personas se les refiere como sintomáticos respiratorios
(SR).7 Los datos encontrados durante la exploración física
son igualmente inespecíficos y poco significativos en las formas leves y moderadas y no existen en estadios de
exposición y en tuberculosis latente.12 La literatura
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Este documento es elaborado por Medigraphic
Programmes on the Management of Tuberculosis in
Chil-dren).7,13 Ante tal situación la información disponible del
paciente pediátrico es limitada, por tal motivo éste es olvidado, por su naturaleza no infecciosa se le excluye de los programas o se le considera sin riesgo para la salud
pública.14 En Estocolmo, Suecia se reconoció en 2011
la ausencia de prioridad en los programas nacionales de
control de tuberculosis en niños.44
Aun cuando se cuenta con técnicas de diagnóstico y tratamiento, es difícil en el niño, en pacientes
pauciba-cilares y asintomáticos,8,14-16,31 si se compara con el de
cualquier otra infección de etiología bacteriana, incluso
en pacientes altamente bacilíferos (50-80%).42
La baciloscopia es la técnica de elección para el diag-nóstico rápido y el control de tuberculosis pulmonar en adultos. Es simple, económica y eficiente para detectar casos infecciosos altamente bacilíferos. Se le considera herramienta fundamental en programas de control de tuberculosis. Las normas de los Programas Nacionales de Control de Tuberculosis (PNCT) recomiendan la obtención de dos o tres muestras por SR para que la probabilidad de detección de BAAR sea máxima. Determinada en aquellos pacientes que no saben expectorar el lavado gástrico como técnica de elección en casos de sospecha
de tuberculosis.3,45-49
En el caso de la baciloscopia de muestras provenien-tes del aparato respiratorio de pacienprovenien-tes pediátricos, la
positividad va de 0 a 42%.3,45-49 En nuestro estudio, el
porcentaje de positividad fue el más bajo de los proce-dimientos empleados (13.4%), dato que nos confirma lo que en otros países se reveló con anterioridad, menos de
15% en niños con TB.12
En la literatura se documenta que el diagnóstico definitivo de tuberculosis se hace con base en cultivo
positivo, considerado el estándar de oro,50 siendo junto
con la baciloscopia y la radiografía de tórax la piedra
angular en el diagnóstico de tuberculosis pediátrica.8,50
Sin embargo, su recuperación no sólo depende de la calidad de la muestra, sino también de la calidad de la técnica de digestión y descontaminación que se apli-que.10,50 Los reportes de diferentes investigadores sobre el cultivo refieren una sensibilidad que fluctúa entre 80 y 90% en muestras de adultos altamente bacilíferos, en tanto que en el paciente pediátrico con escasos BAAR
la variable es de < 12-50%.3,45,47,51,52 En un intento
por incrementar la sensibilidad del cultivo y reducir el
tiempo de incubación de M. tuberculosis se ha
reco-mendado el empleo simultáneo de cultivos en medios líquidos y sólidos. Los resultados obtenidos fueron de 44% empleando ambos tipos de medios (Lowenstein
Jensen y Middlebrock).30,31,47,53-57
Ante el vertiginoso desarrollo de la biotecnología se ha introducido una serie de herramientas en la identificación de especies y complejos para determinar la sensibilidad a antimicrobianos y hacer los estudios epidemiológicos de
tuberculosis,15,19,27,33,42,46-50 entre los cuales la reacción
en cadena de la polimerasa (PCR) ha propiciado el
desa-rrollo de nuevas metodologías.15,23,29-32,36,45
Los métodos de amplificación de ácidos nucleicos de tipo comercial tienen en general menor sensibilidad en las muestras provenientes de pacientes con procesos
clínicos y radiológicamente menos graves,así como en las
muestras extrapulmonaresy paucibacilares.29
El uso de la PCR junto con la tinción de Ziehl-Neelsen en muestras de esputo o lavado broncoalveolar (LBA) de pacientes con TB pulmonar ha permitido hacer un
diagnóstico rápido en 90% de los casos.7 Se ha
documen-tado que la aplicación de la PCR en muestras del tracto respiratorio, esputo, lavado broncoalveolar, aspirado de moco en jugo gástrico y aspirado traqueal con examen directo negativo (baciloscopia) tiene una sensibilidad de 76%, especificidad de 97%, valor predictivo positivo (VPP) de 96% y valor predictivo negativo (VPN) de sólo 80%. La seguridad diagnóstica ha sido mayor en las pruebas hechas a partir de secreciones bronquiales y menor en las de jugo gástrico; no obstante, se observaron amplias variaciones entre los diferentes estudios analizados. Razón por la que se ha sugerido no utilizar las pruebas de PCR como método único de diagnóstico en pacientes con TB
pulmonar y baciloscopia negativa.13 Los resultados
obte-nidos con el empleo de la PCR y el uso de la IS6110 fue de 47/82, o sea de 57% a partir de las muestras clínicas a las que simultáneamente se les practicó tinción de Ziehl-Neelsen y cultivo.
El estudio retrospectivo de los 82 pacientes a través
de sus datos clínicos y de gabinete (figura 5) reveló una
relación en 49 de ellos con personas con tuberculosis, lo que equivale a 60% con combe positivo. La aplicación de la reacción intradermo a la tuberculina fue positiva en 24/82 (29%). Esta falta de respuesta ha sido puesta de manifiesto por diferentes investigadores, lo que explica la definición de tuberculosis como un fenómeno com-plejo entre la relación del hospedero por medio de su
respuesta inmunitaria y el agente causal (M. tuberculosis).
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CONCLUSIÓN
En el presente trabajo concluimos que de las tres
prue-bas aplicadas en bacteriología en la detección de M.
tuberculosis, la baciloscopia fue la menos sensible como ha sido referido ampliamente en la literatura. El empleo de los dos medios de cultivo favoreció la detección de esta bacteria en un porcentaje ligeramente superior al reportado por otros autores. En tanto que la PCR apli-cada tanto a muestras clínicas como a los productos del cultivo nos permitió obtener el resultado más alto y con mayor rapidez que el observado en las dos pruebas realizadas anteriormente. Sin embargo, el diagnóstico de tuberculosis se llevó a cabo con la ayuda de otros pará-metros obtenidos por la clínica y estudios de gabinete.
Agradecimientos
Agradecemos a los Doctores Yolanda López Vidal y Gonzalo Castillo Rojas, del Laboratorio de Inmunología de Patógenos, Departamento de Microbiología y Parasi-tología, Facultad de Medicina, UNAM el apoyo brindado en la realización de este trabajo.
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Figura 5. Datos de laboratorio y gabinete encontrados en los pacien-tes estudiados.
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
Porcentaje
COMBE IDR Vacu- Histopa- Radiografía
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