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A s e s o r A r t u r o R o j o D o m í g u e z
D e p a r t a m e n t o
d e
Q u í m i c a A r e a d e
B i o f i s i c o q u í m i c a
ESTUDIO CALORIMÉTRICO DE LA P-LACTOGLOBULINA-B
INTRODUCCION Y ANTECEDENTES
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La P-lactoglobulina, es una de las proteínas más abundantes que componen la leche de especies como cerdo, canguro y algunos m a d e r o s acuáticos como delfines y ballenas. Su concentración varía dependiendo de las edades de éstos.La importancia de su estudio ha aumentado en los últimos años debido a que, además de su ya conocida unión a sustancias hidrofóbicas, sus propiedades termodinámicas nos permiten completar información acerca de la estabilidad y los patrones de plegamiento de la proteína.
A pesar de lo anteriormente mencionado existe poca información que ayude a entender claramente su papel metabólico. Por otro lado, debemos decir que su estructura h e determinada hace pocos años por medio de difiacción de rayos X, obteniendo baja resolución. Otra poca de información estructural se ha establecido por medio de homologías con una proteína similar cuya función es la unión del retinol plasmático. Se sabe también, que esta proteína tiene gran estabilidad a valores bajos de pH resistiendo la desnaturalización aún en valores cercanos e inferiores a dos.
Vanas técnicas se han aplicado al estudio de la f3-lactoglobulina con el afán de eniender su fünción en las especies en las que se ha encontrado. Algunas de estas técnicas han sido eficientes en el estudio de otras proteínas, incluso en la familia de las lipocalinas a la cual pertenece la
p-
lactoglobulina tanto en su variedad "A" como "B". Dentro de las técnicas de mayor utilidad en el estudio de proteínas se encuentran los llamados métodos calorimhicos, estos métodos directos se basan en la detección del calor absorbido durante el desplegamiento de la estructura proteica, midiendo directamente sus variables termodinámicas, o dicho de otra forma, tratan de establecer las bases energéticas de la estabilidad de dicha proteína. Lo anterior es de alguna manera no muy complicado si se somete a la proteína a un factor externo que induzca el desdoblamiento o mejor dicho la desnaturalización de la especie química estudiada, de esta manera se podrá caracterizar el proceso termodinámico.Para tener la descripción completa de lo que implica el fenómeno de desnaturalización térmica es importante poder distinguir cuales son las propiedades de la solución cuando la protema pasa del estado nativo al desnaturalizado inducida por un aumento en la temperatura. La microcaloxhetría diferencial de barrido ayudó a la resolución de la cuestión antes tratada, ya que nos permite determinar con precisión la temperatura media, el calor de desnaturalización y el cambio en la capacidad calorífica de la solución. La transición puede ajustarse al modelo llamado de dos estados que dicho de una manera simple nos permite establecer propiedeades del paso del estado nativo al desnaturalizado considerando que no existe ningún intermediario en concentraciones apreciables.
Como se había mencionado con anterioridad, la f3-lactoglobulina consta de dos variedades que han sido objeto de estudio en este laboratorio y que sus parámetros termodinámicos son ya
bien conocidos para la variedad "A". Por lo tanto el objeto de estudio en el presente trabajo intenta establecerlos para la variedad "B", que sólo sufre cambios estructurales en dos residuos Asp 64 y Val 1 I8 por Gly y Ala respectivamente.
El proceso sucede de manera semejante a una transición de fase con un calor o entalpía de reacción asociada y depeudiente de la temperatura. Alterando las condiciones del medio, pot ejemplo el pH, es posible cambiar la temperatura media (Tm) de la transición y con ella la entalpia medida. De una serie de experimentos realizados a diferentes valores de pH se puede construir una
curva de eutalpía contra temperatura media, cuya pendiente es el cambio en la capacidad calorifica de la solución ( A Cp).
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OBJETIVOS GENERALES Y E S P E C ~ I C O S i'r)
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u Como ya se mencionó, los estudios de desnaturalización térmica nos pe&ten obtener información acerca de la estabilidad de un sistema proteico. También como ya sabemos existe m a dependencia de las variables termodinámicas implicadas en el proceso con el grado de acidez o alcalinidad de la solución de proteína.
Es por ello que el objetivo del siguiente trabajo, es tratar de caracterizar el proceso de desnaturalización térmica de la P-lactoglobulina-B y comparar los resultados especícos obtenidos con la variedad "A" estudiada previamente en este laboratorio.
METODOLOGIA UTILIZADA
La proteína en estudio se obtuvo de la empresa Sigma. Su dilución se realizó en una solución amortiguadora de glicina a un pH de 2.56 unidades. La muestra se preparó desaereando con vacío y agitación la solución amortiguadora durante 15 m i n , transcurrido este tiempo se diluyeron 2.5 mg de muestra en 2 ml de la solución amortiguadora filtrando para evitar que cualquier sólido no visible pudiera interferir en las mediciones obtenidas por el equipo. Una vez preparada la solución con proteína, esta se desaereó por un lapso de 1 min para evitar la formación de burbujas dentro de las celdas del calorímetro, lo cual traería como consecuencia distorsión en las lecturas obtenidas. Las pruebas calorimétricas heron realizadas en un microcalorímetro diferencial de barrido marca Microcal MC-2. Para cada una de estas pruebas experimentales se selecionó un pH en el intervalo de 0.65 a 3.16 unidades.
Una vez preparada la muestra, ésta y el b a e r fueron colocados con utl volumen de 1.261 1 ml dentro de las celdas del calorímetro. Para evitar al máximo la formación de burbujas h e necesario mantener presión alta (1.5 kg/cm2 ) utilizando para ello un tanque de nitrógeno conectado al equipo.
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aquellos ea los cuales se probó la re\rersibilidad del proceso de desuaturalización para la
p-
lactoglobulina B. Para proteínas cuyos transiciones son reversibles, los estudios calorimétricos permiten probar la reversibilidad, barriendo de la manera ya explicada sólo que al terminar el experimento las celdas se e&an rapidamente y vuelve a intentarse bajo las mismas condiciones y teniendo como imico cambio a la proteína con el tratamiento anterior.2 2 2 5 1 5
Los datos obtenidos fieron colectados automáticamente por un sistema de cómputo que se encuentra conectado al calorímetro.Puesto que el cuidado y limpieza del calorímetro son especiales y parte importante de la precisión en los resultados, es deseable hablar de ello. Las celdas son enfriadas para hacer que la temperatura se encuentre entre 20 y 25 grados aproximadamente, en este mometo y no antes podemos abrir las celdas debido que la presión dentro del calorímentro disminuye gracias a la pérdida de calor. Abiertas las celdas pasamos por cada una de ellas 500 ml de agua jabonosa J'
caliente y de igual forma 500 ml de agua caliente para enjuagar. Como es de esperarse, se requiere secar y para ello pasamos también por cada celda 50 ml de metanol, dejándolo secar con vacío por
15 ó 20 min. I
Debido a que el análisis de resultado es muy dependiente de la concentración, se utilizó un; .. ,~ ,;
espectrofotómetro de U.V. a una longitud de onda de 278 nm y que permaneció constante durante;-;;: .
todas las mediciones que involucren a la concentración. , * : " I . -8
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, . . _ Esta medición se realizó usando como blanco 1200 pl de el buffer de gllcina, ya antes : - .;- mencionado contra una diluci6n de 1200 p l de buffer y 50 pl de solución de protema sobrante de la i.
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que se colocó en el calorímetro., . ("
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Las lecturas resultantes heron transformadas a concentraciones rnolares utilizando un
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:-coeficiente de extinción de A( 1%278m) =0.96 (4). u. * .
El análisis de de datos se realizó con un programa de cómputo de nombre Origin que nos :c;
-permite conocer el valor del ACp a partir de la temperatura media y la concentración de la .
proteína en moled. Para conseguir estos valores Origin necesita además de conocer la información antes mencionada, que el usuario le proporcione otros parámetros como son el ajuste de una linea base y la pérdida de los extremos de cada lado del pico, aislando finalmente el area bajo la curva de la cual obtenemos la verdadera información acerca del Cex (calor de exceso), que no es otra cosa m á s que la traducción del flujo de energía producido por cada aumento de temperatura en la fase de desnaturalización. La segunda parte de el análisis consiste en la obtención del AH (entalpía de transición), como ya se mencionó anteriormente, el proceso ocurre como una transición de fase, por lo tanto el AH se obtiene de una fimción dependiente de la temperatura. La calorhetría diferencial de barrido nos ayuda a evaluar directamente esta función, pensando que la entalpía consumida durante toda la transición es el área bajo la curva del termograma a una temperatura dada, que para efectos del análisis fue la Tm (temperatura media del proceso), la cual es otorgada directa y cualitativamente por el termograma pero que realmente es el resultado de formalismos matemáticos aplicados a las variables termodinámicas.
introductoria, para conocer el cambio en la capacidad calorífica tuvimos que incluir variaciones en el pH, lo cual nos permitió construir una curva cuya pendiente es el ACp.
Como último punto de este apartado, tenemos la precipitación de la proteína. Estos estudios nos permiten conocer los valores extremos de pH en los cuales nuestra proteína puede conservar estabilidad estructural. Como estamos hablando de una proteína cuya función se lleva a cabo en el tracto digestivo (estómago) del becerro es de esperarse una tolerancia a valores menores a 2 unidades de pH. Para corroborar este hecho se tituló a la P-Iactoglobulina-B con HCI
1N hasta que la solución de proteína se enturbiara.
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ACTIVIDADES REALIZADAS
Dentro de las actividades realizadas, se encuentra como primer paso una serie de seminarios que me permitieron entender la naturaleza del trabajo, el hcionamiento de los equipos que utilicé y la importancia y uso de la calorimetría diferencial de barrido en el estudio de proteínas.
A continuación tuvo lugar el periodo experimental que consistió principalmente de los estudios calorimétricos, que incluyeron: preparación de soluciones, obtención de las concentraciones para cada experimento con espectrofotometría de U.V., obtención de termogramas con el calorímetro diferencial de barrido, lavado del calorímetro en cada experimento, estudios de reversibilidad, cambio en la velocidad de barrido y análisis de resultados.
La precipitación ácida de la proteína, puede conducimos a un estado de agregación de la proteína o a la formación de estados parcialmente desnaturalizados. Tomando en cuenta lo anterior, la P-lactoglobulina-B file sometida a dicho experimento.
Finalmente, las actividades concluyeron con el analisis global de resultados, obteniendo con esto los paramétros termodinámicos ya mencionados en la metodología. Con éstos se construyeron curvas de AH vs. Tm, AH vs. pH y pH vs. Tm resultantes de los datos obtenidos en los experimentos y que no nos permitió cacular el ACp como se planteó inicialmente, pero sí corroborar la dependencia del Tm con el pH de la proteína.
OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS
RESULTADOS Y CONCEITSlONES
Resultados 1’ discusidn. Tal y como se ha planteado en en el objetivo se caracterizó la desnaturalización térmica de la P-lactoglobuha-B. En algunos caso nos referiremos a la variedad
“A” de modo que podamos esclarecer mas facilmente el proceso.
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Estado de agregacidn. Aunque ya desde hace treinta años, se habían realizado estudios para determinar el estado de agregación de la P-lactoglobdina tanto en su variedad “A” como”B”,
110 se conocían datos experimentales que pudieran corroborar el hecho de que ambas se
comportaban como un dímero a valores de pH entre 2.0 y 3.5 unidades (4). Gracias a los estudios realizados en este laboratorio para ambas variedades se demostró que la proteína en el caso de la variedad
“A”
deja de ser estable y presenta precipitación cuado se utilizan valores de pH por debajo de la 0.6 unidades. Sin embargo, no así para la variedad ‘73” en la cual no se presentó este efecto aun llevándola a valores de pH por debajo de 0.3 unidades. Esto es interesante si recordamos que la d&rencia estructural entre ambas proteínas es sólo de dos aminoácidos.Interdependencia de los parámetros pH,
AH
yTm.
Los valores de las determinaciones calorímetricas para los distintos valores de pH se encuentran concentrados en la tabla 1.PH O. 65 0.85 1.29 1.40 1.60 1.79 2.04 2.33 2.40 2.56 2.8 1 3.01 3.04 3.16
Tm(“C) AH (caYmol) Desviación
80.0 90390 16965
80.1 86285 249009
80.0 95510 34467 1
78.7 77330 76700
79.1 87946 95000
78.9 88660 7044 1
81.2 9 1749 213847
83.9 8305 1 499000
83.8 84488 5 5 8968
84.2 83969 436508
86.5 92290 39530
88.3 85595 215946
89.8 8875 1 354176
89.8 75205 738759
Tabla 1. Interdependencia de los parámetros pH, Tm y
AH
A diferencia de los resultados obtenidos para la P-lactoglobulina-A, la variedad “33” presentó un patrón de comportamiento en< relación a los parametros AH vs Tm y AH IS pH diferente al esperado. No así para la interrelación Tm vs pH en los cuales el comportamiento de ambas proteínas fue muy semejante.
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Discutiremos en primer lugar la relación AH 1’s ~ r n , que como ya anteriormente se había
mencionado nos ayuda it obtener de manera directa el ACp de la proteína.
La P-lactogiobulina a diferencia de otras pertenece a un gIup0 de protehas llamadas lipocalinas, con características estructurales diferentes a las de otras proteínas globulares. En éstas encontramos una zona hueca en el interior de la proteína además de un empaquetamiento compacto. Esto podria implicar una baja densidad de puentes hidrógeno en esta región por gramo de proteína en comparación con otras con estructura más compacta (4).
Cuando se intenta caracterizar el proceso de desuaturalizacibu térmica de una proteha debetnos tomar en cuenta dos factores, uno es la contribución positiva del nimero de contactos hidrofóbicos y una negativa debida al área polar (4). Lo anterior nos ayuda a determinar el 4Cp de la proteína. Sin embargo, al parecer existe una alguna contribución generada por la densidad de puentes hidrógeno antes explicada.
El ACp derivado de la desnaturalización térmica de una proteína globular con un núcleo hidrofóbico siempre es positivo. Entonces como es de esperarse la variación ocurrida en AH sea en el mismo sentido que el de la Tm, comportamiento observado en las dos variedades de nuestro objeto de estudio.
En el caso de la P-lactoglobulina-B, el ACp fue positivo tal y como se muestra en la gráfica 1, obteniendo una pendiente de 949 cal / mol K, concidente con el rango obtenido para proteínas semejantes.
Si observamos la gráfica 3 , nos percataremos que no existe una clara dependencia entre los valores de pH y A€& esto puede deberse a que los dos aminoácidos que se sustituyen en la variedad
“B” se encuentren aportando un factor adicional a la establidad ya que se sustituye en el caso de la Asp por Gly un residuo ácid0 por uno neutro.
Con respecto a la Tm debemos mencionar que su valor es un reflejo de la estabilidad estructural de la proteína y que además es afectada por los cambios en el pH. Esto lo podemos observar con claridad en tabla 1 y gráfica 2. En la primera se hace notar que para valores por encima de 1.79 unidades existe un incremento de la Tm, que es directamente proporcinal al incremento del p H Es interesante señalar que esto Privalov sólo lo había observado para regiones
alta-has
pero no se ha reportado para regiones ácidas (2).Por otro lado, en la gráfica 2 debemos notar que existe m a región por debajo de 1.79 y hasta 0.65 unidades, al parecer en esta región según la hyótesis de Goto todos los grupos suseptibles de ser protonados ya lo han sido y que por lo tanto la adición de un mayor número de protones al medio no afecta ostensiblemente la estabilidad de la estructura proteica (4).
A diferencia de lo encontrado en la f3-lactoglobulina-A, la variedad
‘?3”
no presenta precipitación ácida que por debajo de 0.6, esto signigica que no existe un protonación aparente de grupos por lo que en este caso no podemos decir que la P-lactoglobulina-B se asocia a otras moléculas de proteína a valores bajos de pH.ReversibilidUd La forma en que se evalúa la reversibilidad es observando el área bajo la curva de un termograma (fig 1). Si las áreas de dos termogramas son iguales, entonces se dice que el proceso es reversible.
A pesar de las diferencias encontradas en el análisis anterior entre ambas proteíuas, existe otro punto en común dentro del proceso de desnaturalización térmica, y es el hecho de que ambas resultaron ser reversibles en un 50% en las concentraciones estudiadas, que para ambos casos heron inferiores a 5 mg/ml.
Conclusiones. Durante el desarrollo de este trabajo, se ha logrado corroborar la importancia de los estudios termoquímicos para ayudar a la resolución de interrogantes biológicas, como son los diferentes patrones de plegamiento y desnaturalización que siguen las proteínas, lo cual determina la b c i ó n que la m i s m a realiza dentro de las entidades biológicas en las cuales se localizan. En este estudio l i m o s capaces de establecer diferencias y semejanzas entre dos variedades distintas de la misma especie proteica. Si pensamos que muchas de las proteínas
necesitan modificar parcial o totalmente su estructura cuando de trata de cumplir con su objetivo biólogico podemos concluir lo siguiente:
a) La P-lactoglobulina posee dos variedades principales que sólo divergen estructuralmente en dos aminoácidos con propiedades electroquímicamente distintas, que al parecer modifican el comportamiento energético de la proteína durante el proceso de desplegamiento térmico, cosa que es visible observando las gráficas 1 y 3.
b) Existe una relación creciente y directamente proporcional entre los paramétros Tm y pH.
Ést0 trae como consecuencia la estabilidad estructural de la proteína cuando los valores de pH se encuentran entre 1.7 y 3.2 unidades para la P-lactoglobulina-B. En la variedad
“A”
cuando se encuentra entre 1.6 y 3.0 unidades el comportamiento es semejante al de la varidad ‘B”, lo que sugiere, que el cambio en las cargas de los aminoácidos de la variedad ‘B” es el responsables del ligero aumento y ampliación del intervalo.c ) En cuanto a la reversibilidad, es notable que ambas sean reversibles en un 50%, de ello podemos de’cir que una vez que la proteína ha sido totalmente desnaturalizada no vuelve a adquirir
su conformación nativa, lo cual es significativo tomando en cuenta su función en el tract0 digestivo de los organismos que la poseen.
Finalmente es importante mencionar que la diversidad obtenida en los resultados con ambas variedades nos obligan a investigar mas a fondo estos mecanismos, no sólo utilizando los criterios termodinámicos, sino otras formas experimentales que nos ayuden a resolver la interrogante sobre el comportamiento de esta protema.
RECOMENDACIONES
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Gráfica 1. Tendencias para delta de H y Tm con la variedades
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LlTERATlTKA CITADA
I ) Rraden T.C. and Toozen J., (199 I), Introduction to protein structure, ed. 2nd, Ed. Garland Publishing Inc. N . Y . and London, p.p. 302.
2 ) Azuaga A.1. et al, ( 1992), Heat and cold denaturation of P-lactoglobulin B, FEBS, Vol 309, No 3. 258-260.
3) Casal L.H., Kohler U.and Mantsch H.H.; (1988). Structural and conformational changes of 13- lactoglobuliu B and itlfrared spectroscopic study of the effect of pH and temperature, Biochemica et Biophysica, Acta, 957, 1 1-20.
4) Garcia Hernández E., Estabilidad estructural de la B-lactodobuha, - Tesis de maestría. Biología
Experimental ( I994), UAM-Iztapalapa.
g g
5) Lapanje S. and Poklar N, (1 989), Calorimetric and circular dichroic studies of the thermal Q
c
denaturation of D-lactoqlobul&., Biophysical Chemistry, 34, 155-162. 5; 2.
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6) Perez M.D., et al, (1991), Effect of B-lactodobulin on the activity of prepastric lipase. A b! c.^Wsible role for the protein in rumiant milk., Biochimica et Biophysica Acta, 1
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