Ensayo preliminar de una modificación de la técnica de microdilución propuesta por la CLSI documento M38-A, mediante el uso de 2,3,5- trifenil - tetrazolium como método alterno para la medición de viabilidad de propágulos fúngicos

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Ensayo preliminar de una modificación de la técnica de microdilución propuesta por la CLSI documento M38-A, mediante el uso de 2,3,5- trifenil - tetrazolium como método alterno para la

medición de viabilidad de propágulos fúngicos.

Gina Marcela Bulla Quintero Angie Mayroth Hernández Zorro

Aprobado

______________________________ __________________________

Maria Ximena Rodríguez Bocanegra Melva Yomary Linares Linares Directora Codirectora

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ

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Ensayo preliminar de una modificación de la técnica de microdilución propuesta por la CLSI documento M38-A, mediante el uso de 2,3,5- trifenil - tetrazolium como método alterno para la

medición de viabilidad de propágulos fúngicos.

Gina Marcela Bulla Quintero Angie Mayroth Hernández Zorro

______________________________ __________________________

Maria Ximena Rodríguez Bocanegra Melva Yomary Linares Linares Directora Codirectora

__________________________ Nidia Alexandra Torres

Jurado

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS

PROGRAMA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL BOGOTÁ

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TABLA DE CONTENIDO

PAG

RESUMEN 5

1. INTRODUCCIÓN 6

2. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 7

3. MARCO TEÓRICO 8

4. OBJETIVOS 10

5. METODOLOGIA 10

5.1 Obtención de cepas microbianas 10

5.2 Ensayos preliminares con E.coli para determinar 10

viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium 5.3 Ensayos preliminares con hongos para determinar viabilidad 11

por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium. 5.4 Determinación de la concentración mínima requerida de 12

propágulos viables para detección de viraje de color, por asimilación de 2,3,5-trifenil-tetrazolium y resazurina. 5.5 Determinación de la longitud de onda para cuantificación de viabilidad 12

Por espectrofotometría 5.6 Evaluación de la modificación de la técnica empleando 13

terbinafina como antifúngico 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 14

6.1 Ensayos preliminares con E.coli para determinar 14

viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium 6.2 Ensayos preliminares con hongos para determinar viabilidad 15

por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium. 6.3 Determinación de la concentración mínima requerida de propágulos viables para detección de viraje de color, por asimilación 18

de 2,3,5-trifenil-tetrazolium y resazurina. 6.4 Determinación de la longitud de onda para cuantificación de viabilidad 22

Por espectrofotometría 6.5 Evaluación de la modificación de la técnica empleando terbinafina 24

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7 CONCLUSIONES 31

8 RECOMENDACIONES 32

9 BIBLIOGRAFÍA 32

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1. INTRODUCCIÓN

La creciente incidencia y diversidad de las infecciones fúngicas oportunistas en pacientes inmunosuprimidos, ha favorecido el mejor conocimiento de las micosis invasivas y el desarrollo de nuevos antifúngicos que ofrezcan nuevas alternativas al tratamiento de estas infecciones (1). Dentro del grupo de hongos implicados con mayor frecuencia en estas infecciones micóticas, se encuentran los géneros Candida, Aspergillus, Fusarium y el grupo de los dermatofitos. Estos son hongos patógenos oportunistas que han sido participes de varios estudios, debido a su capacidad de producir micosis superficiales y sistémicas (2).

Obtener un diagnóstico rápido y preciso que permita determinar un tratamiento adecuado no deja de ser una tarea difícil, debido a que muchos de estos hongos patógenos originan cada vez más problemas de resistencia intrínseca a los antifúngicos, que actualmente se emplean a nivel clínico para el tratamiento de las micosis, situación que actualmente conlleva a la evaluación de dichas sustancias mediante el uso de distintas técnicas que tienen como objetivo determinar cuál es la concentración mínima inhibitoria (CMI) de antifúngico necesaria para logar inhibir el crecimiento del hongo (1).

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reproducibilidad. El documento M38-A para hongos filamentosos, presenta limitaciones importantes y una de ellas es la interpretación de los resultados ya que es muy subjetiva y solo personal ampliamente experimentado podría ofrecer datos confiables (6). Para intentar resolver estos inconvenientes, se han desarrollado modificaciones a la técnica de microdilución, que consiste en emplear indicadores de oxido-reducción como la resazurina, el cual ha sido recientemente identificado como el principal componente del Azul de Alamar. Esta sustancia azul es reducida por células del microorganismo metabólicamente activas hasta un color rosa intenso (7). La lectura de las microplacas se realiza teniendo en cuenta el viraje del indicador, así se considera la CMI como la menor dilución de antifúngico, en la que no se observa cambio de color (6). También existen otros métodos colorimétricos como las sales de tetrazol MTT y XTT, que al igual que la resazurina se han utilizado como indicadores de viabilidad en estudios con bacterias, hongos levaduriformes y filamentosos (8).

El objetivo de este proyecto de investigación es llevar a cabo un ensayo preliminar, realizando una modificación de la técnica de microdilución (M38-A) utilizando como reactivo el 2,3,5- trifenil – tetrazolium, el cual será empleado para la medición de viabilidad de propágulos fúngicos.

2. JUSTIFICACIÓN – PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Las infecciones micóticas por hongos oportunistas son cada día más frecuentes. Se ha considerado que hongos como Fusarium spp. (Hongo emergente), Aspergillus spp. y el grupo de los dermatofitos, dentro del grupo de hongos patógenos oportunistas capaces de causar una serie de infecciones micóticas superficiales y sistémicas. Se ha visto que los microorganismos causantes de estas patologías frente a diferentes antifúngicos muestran cada vez mayor resistencia, problema que hoy en día implica la evaluación de estas sustancias mediante el uso técnicas que permitan determinar cuál es la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) que se requiere del antifúngico para lograr inhibir el crecimiento (viabilidad) del hongo patógeno.

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resultados subjetivos, ya que dependen de la experiencia de la persona que está haciendo la evaluación; esto hace que se convierta en una técnica dispendiosa y solo personas con experiencia en la interpretación de los resultados podrían ofrecer datos confiables. Es por ello que el objetivo principal de este estudio es llevar a cabo un ensayo preliminar, realizando una modificación de la técnica de microdilución (M38-A) utilizando como reactivo el 2,3,5- trifenil – tetrazolium, el cual será empleado para la medición de viabilidad de propágulos fúngicos (prueba bioquímica), permitiendo evidenciar de forma más clara el resultado de la técnica a través de un cambio de color, el cual se puede cuantificar por medio de espectrofotometría. Según reportes bibliográficos, la adición de esta sal como revelador de viabilidad se ha llevado a cabo en estudios con bacterias y levaduras pero no con hongos filamentosos, razón por la cual se evaluarán aislamientos de Fusarium spp, Aspergillus spp y el dermatofito Microsporum gypseum, que presentan comportamientos metabólicos diferentes, con el fin de poder establecer la efectividad de las sales de tetrazolium en estudios con hongos filamentosos.

3. MARCO TEÓRICO

En las últimas décadas, se ha aumentado el número de casos por infecciones micóticas, mostrando una mayor incidencia en hongos de los géneros Fusarium spp., Aspergillus spp. y el grupo de los dermatofitos (9, 10). Estos son hongos patógenos miceliales que han sido participes de varios estudios con el fin de llegar a su control, debido a que son capaces de producir micosis superficiales e invasivas, al ser hongos oportunistas (11, 2). Así mismo, al ser hongos patógenos de mayor incidencia son importantes en el área clínica y por esta razón es conveniente tener en cuenta cuales son los antifúngicos capaces de controlar a estos organismos y las dosis requeridas para llevar a cabo esta acción (12). Todo esto ha generado la necesidad de desarrollar técnicas para el estudio de la susceptibilidad in vitro a los antifúngicos, de las cuales la técnica E-test, la difusión en placa y microdilución en caldo, son las técnicas más utilizadas a nivel clínico (13).

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vitro, permitiendo una fácil reproducibilidad del método y condiciones óptimas de crecimiento para los microorganismos a evaluar; además es una técnica fácil de interpretar en cuanto a resultados se refiere (14). Finalmente la técnica de microdilución en caldo propuesta por la CLSI documento M38-A, es una técnica empleada para la evaluación de susceptibilidad de hongos filamentosos, que surgió de la necesidad de controlar hongos causantes de infecciones invasivas, dentro de los que se encuentran especies de Fusarium, Aspergillus y Rhizopus, entre otros. La técnica de microdilución en caldo está basada en la determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) (11,14), la cual permite establecer la mínima concentración de antifúngico que se necesita para la inhibición de crecimiento. Esta técnica es controversial, puesto que para algunos es fácil de realizar, mientras que para otros la técnica puede convertirse en un procedimiento dispendioso. La limitante de esta técnica es la subjetividad en la evaluación de crecimiento fúngico y solo personas que trabajan constantemente con la técnica han adquirido gran experiencia y son capaces de interpretar con facilidad los resultados (15, 16). A pesar de ello, ya se han realizado modificaciones de la técnica con el fin de obtener un resultado de mayor confiabilidad, empleando métodos colorimétricos. En varios estudios de susceptibilidad se ha utilizado resazurina como indicador de viabilidad. La resazurina, al ser un indicador redox, es reducida por parte de las células vivas dando como resultado final un viraje de color, de azul (indicando no crecimiento) a morado (indicando inhibición parcial) o a rojo – rosa intenso (indicando crecimiento) (8).

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4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general.

Evaluar de forma preliminar una modificación de la técnica de microdilución propuesta por la CLSI documento M38-A, mediante el uso de 2,3,5- trifenil - tetrazolium como método alterno para la medición de viabilidad de propágulos fúngicos.

4.2 Objetivos específicos.

¾ Evaluar la producción de sales de formazán a partir de 2,3,5- trifenil – tetrazolium para hongos filamentosos patógenos oportunistas (Fusarium spp., Aspergillus spp. y el dermatofito Microsporum gypseum).

¾ Determinar la concentración mínima de propágulos viables para detección de viraje de color (producción de sales de formazán).

¾ Determinar un índice de relación entre producción de sales de formazán y número de propágulos fúngicos viables.

¾ Evaluar la modificación de la técnica empleando terbinafina como antifúngico.

5. MATERIALES Y MÉTODOS:

5.1 Obtención de cepas microbianas

La cepa de Escherichia coli ATCC 25922 se obtuvo de la colección de bacterias de la Pontificia Universidad Javeriana. Se trabajó con cepas de Aspergillus (1, 2, 10), Fusarium (8, 108, 121, 203) y Microsporum gypseum, provenientes de muestras de animales y humanos obtenidas de la colección de hongos de Pontificia Universidad Javeriana (Anexo 1 y 2). Las cepas de referencia con las cuales se trabajó fueron: Candida krusei ATCC 6258, Aspergillus niger ATCC 16404 y las cepas de comparación fueron Aspergillus fumigatus y Aspergillus flavus (Anexo 2).

5.2 Ensayos preliminares con E.coli para determinar viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium

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espectrofotometría a 540nm. Las pruebas fueron realizadas en agar nutritivo suplementado con 0,5mL/50mL de glicerol y 50mg/50mL de 2,3,5-trifenil – tetrazolium y en caldo nutritivo suplementado de igual forma (Anexo 3). La suspensión fue sembrada por agotamiento en el agar nutritivo suplementado e inoculando 500µL de la suspensión bacteriana en tubos que contenían 4,5mL de caldo. Se incubó a 37° C durante 24 a 48 horas.

Para realizar esta prueba se realizaron dos ensayos, uno adicionando la sal antes de autoclavar el medio y otro adicionando la sal después de autoclavar el medio de cultivo. Se utilizaron controles de crecimiento, sembrando el microorganismo en agar nutritivo y caldo nutritivo sin suplemento de sales, y como controles de esterilidad los medios sin inóculo. Estas pruebas fueron realizadas por triplicado.

5.3 Ensayos preliminares con hongos filamentosos para determinar viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium.

Se probaron tres medios de cultivo, los cuales fueron: Caldo Mueller Hinton, caldo extracto de malta y caldo Sabouraud (Anexo 3); estos medios de cultivo fueron preparados de acuerdo a la formulación descrita en el anexo 1. Posteriormente, se designaron dos tratamientos para cada medio de cultivo: i) Medio de cultivo + inoculo de microorganismo; ii) Medio de cultivo + 2,3,5- trifenil - tetrazolium (en una concentración de 1mg/mL de medio de cultivo) + inóculo de microorganismo; cabe resaltar que la adición del 2,3,5- trifenil – tetrazolium se llevó a cabo una vez esterilizado el medio de cultivo. Las suspensiones de inóculo de las cepas de Fusarium spp. y Aspergillus spp. empleadas en el ensayo se obtuvieron a partir de cultivos monospóricos crecidos en agar avena (Anexo 2 y 3), los cuales habían cumplido un periodo de incubación de 5 días a 28° C. Las suspensiones de propágulos se prepararon en solución salina al 0.85% y posteriormente se llevó a cabo el recuento de conidios en cámara de Neubauer. La concentración que se manejo en el ensayo fue la establecida por la norma CLSI documento M38-A, la cual hace referencia a 1x104_{conidios/mL. Seguidamente se inoculó 200µL de la} suspensión de conidios en tubos que contenían 1,8mL de cada medio de cultivo antes mencionado, al igual que los tratamientos establecidos en un principio del ensayo. Finalmente, se llevó a incubación a 28° C por 96 horas y durante este periodo de tiempo se llevó a cabo un monitoreo cada 24 horas.

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solución salina, ii) Medio de cultivo + sal de tetrazolium + solución salina. Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado para cada una de las cepas empleadas.

Después de obtenidos los resultados, se procedió a trabajar el resto de ensayos únicamente con el medio de cultivo caldo Mueller Hinton.

5.4 Determinación de la concentración mínima requerida de propágulos viables para detección de viraje de color, por asimilación de 2,3,5-trifenil-tetrazolium y resazurina. Se llevaron a cabo tres tratamientos: i) Medio de cultivo + inoculo de microorganismo; ii) Medio de cultivo + 2,3,5- trifenil - tetrazolium (manteniendo siempre la misma concentración, que en el numeral 5.3) + inóculo de microorganismo y iii) Medio de cultivo + resazurina (en una concentración de 0,002%) + inóculo de microorganismo. Para cada uno de los tratamientos se evaluaron diferentes concentraciones celulares, las cuales iban de 1x101_{conidios/mL hasta} 1x105_{conidios/mL. Las suspensiones para}

Fusarium spp., Aspergillus spp. y M. gypseum fueron obtenidas de la misma forma como se describió en el numeral 5.3, y en el caso de M. gypseum el periodo de incubación para obtención de propágulos fue de 14 días a 28° C. Una vez obtenida la concentración de propágulos de partida (1x105_{conidios/ml), se realizaron} diluciones seriadas con el fin de obtener cada una de las concentraciones antes mencionadas (1x105_{conidios/ml hasta 1x10}1_{conidios/ml), para cada microorganismo empleado en el ensayo.} Una vez obtenidas las suspensiones celulares, se procedió adicionar 200µL de éstas suspensiones en tubos que contenían 1,8mL de medio de cultivo, de acuerdo a cada tratamiento. A continuación, se llevó a incubar a 28° C por 96 horas, durante este periodo de tiempo se llevó a cabo un monitoreo cada 24 horas.

Para este ensayo se empleó como control de crecimiento: i) Medio de cultivo Mueller Hinton + microorganismo evaluado, y como control de esterilidad de medio: i) Medio de cultivo + solución salina, ii) Medio de cultivo + sal 2,3,5- trifenil – tetrazolium + solución salina y iii) Medio de cultivo + sal de resazurina + solución salina. Cada tratamiento se llevó a cabo por triplicado para cada una de las cepas empleadas.

5.5 Determinación de la longitud de onda para cuantificación de viabilidad por espectrofotometría.

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se diluyó en caldo Mueller-Hinton, posteriormente, se determinó un espectro de absorción en rango de luz visible (400-900nm), con el fin de determinar el pico de absorción para la cuantificación de las sales de formazán. Para resazurina se llevó a cabo el mismo procedimiento con las cepas A. fumigatus y Fusarium 108.

5.6 Evaluación de la modificación de la técnica empleando terbinafina como antifúngico. Se llevaron a cabo tres tratamientos: i) Medio de cultivo + inoculo de microorganismo + concentraciones de terbinafina (320µg/mL; 32µg/mL; 3,2µg/mL; 0.32µg/mL); ii) Medio de cultivo + sal de 2,3,5- trifenil - tetrazolium + inóculo de microorganismo + concentraciones de terbinafina (mencionadas anteriormente); y iii) Medio de cultivo + sal de resazurina + inóculo de microorganismo + concentraciones de terbinafina (mencionadas anteriormente). La preparación de cada concentración de antifúngico se hizo a partir de una tableta que contiene como principio activo 250mg de terbinafina perteneciente a la casa comercial MK del lote 8M3039. Se tomó una tableta y se maceró en mortero estéril, a continuación se pesó 128mg y disolvió a 5mL con dimetilsulfóxido (DMSO), seguidamente se agitó hasta obtener una mezcla homogénea, con el fin de obtener una concentración final de 16mg/mL de terbinafina. Una vez alcanzada esta concentración, se realizaron diluciones seriadas en solución salina al 0,85% para obtener las concentraciones mencionadas a evaluar anteriormente.

Para cada uno de los tratamientos se evaluó una concentración celular de 1x105_conidios/mL; las suspensiones para Fusarium spp., Aspergillus spp. y Microsporum gypseum fueron obtenidas de la misma forma como se describió en el numeral 5.4. Posteriormente de la obtención de las suspensiones celulares, se procedió a agregar 100µL de éstas suspensiones en tubos, los cuales contenían 0.9mL de medio de cultivo, de acuerdo al tratamiento ensayado + 100µL de la respectiva concentración de terbinafina a evaluar. Inmediatamente, se llevó a incubar a 28° C por 96 horas, durante este periodo de tiempo se llevo a cabo un monitoreo cada 24 horas.

(14)

Cada tratamiento se llevó a cabo por cuadriplicado para cada una de las cepas empleadas.

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1 Ensayos preliminares con E. coli para determinar viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium.

(15)

[image:15.612.59.558.101.313.2]

Tabla 1: Control de crecimiento de la cepa E. coli ATCC 25922 en Agar Nutritivo y Caldo Nutritivo,

[image:15.612.61.554.379.577.2]

empleando una concentración de inóculo de 108_UFC/ml.

Tabla 2: Asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium por viraje de color a rojo en Agar nutritivo suplementado y del caldo nutritivo suplementado, por parte de la cepa E. coli ATCC 25922.

6.2 Ensayos preliminares con hongos para determinar viabilidad por asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium

En las pruebas de susceptibilidad el uso de medios de cultivo adecuados para llevar a cabo los ensayos juega un papel importante a la hora de obtener resultados precisos y reproducibles. Según lo reportado (20), existen ciertos medios de cultivo que en comparación con otros,

Agar nutritivo + microorganismo Caldo nutritivo + microorganismo

Cepa Concentración de _inóculo 108 UFC/ml

Control negativo

(agar nutritivo) Cepa

Concentración de inóculo 108 UFC/ml

Control negativo (Caldo nutritivo) E. coli ATCC 25922 Crecimiento de

colonias No crecimiento

E. coli

ATCC 25922

Crecimiento

positivo (turbidez) No crecimiento

Agar nutritivo suplementado + microorganismo Caldo nutritivo suplementado + microorganismo

Cepa Concentración de inóculo 108 UFC/ml

Control de esterilidad (agar nutritivo suplementado)

Cepa Concentración de inóculo 108 UFC/ml

Control de esterilidad (Caldo nutritivo suplementado) E. coli ATCC 25922

Colonias rojas No crecimiento

E. coli

ATCC 25922

Medio de cultivo

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permiten un mejor desarrollo de los microorganismos, razón por la cual son ampliamente utilizados. Con base en esto, los medios de cultivo que se emplearon en el ensayo de asimilación de la sal de terazolium por parte de las cepas de hongos corresponden a los caldos Sabouraud, caldo extracto de malta y caldo Mueller Hinton (tabla 3), los cuales por ser medios enriquecidos le proporcionan a los hongos los macro y micronutrientes necesarios para su óptimo desarrollo y crecimiento. Los hongos son organismos quimioheterótrofos, que en su hábitat natural se encuentran asociados a la materia orgánica en descomposición y su nutrición es llevada a cabo por absorción (26, 31). Por otra parte, en pruebas in vitro, crecen en medios de cultivo en donde se les proporciona fuente de carbono orgánico y fuente de nitrógeno orgánica o inorgánica, de forma que el hongo las asimile para su crecimiento y producción de propágulos (26) como se puede observar en la figura 1. Estos medios de cultivo tienen dentro de su composición los nutrientes necesarios para que el microorganismo pueda crecer, tal como se puede observar en la figura 1, donde el hongo mostró un crecimiento tanto micelial (figura 1-b y 1-e) como por tur1-bidez (figura 1-h), lo cual es un comportamiento normal de los géneros evaluados Fusarium spp. y Aspergillus spp.(26), indicando ser medios de cultivo viables de crecimiento para llevar a cabo el ensayo. Sin embargo, para el objetivo del estudio, el caldo Mueller Hinton demostró presentar un mejor comportamiento (Figura 1-a, 1-b y 1-c) debido a la modificación que se realizó en la formulación del medio de cultivo. El caldo Muller Hinton contiene peptona, extracto de carne y almidón (27), y la modificación realizada fue adicionarle glucosa al 2% (Anexo 3), el cual es un factor nutricional que le brinda una mayor concentración de fuente de carbono induciendo un mayor crecimiento frente a los demás medios de cultivo. Esto ha sido verificado en ensayos experimentales de estudios de susceptibilidad, no solo para hongos filamentosos, sino también ha sido empleado para estudios en microorganismos levaduriformes y en microorganismos procariotas como bacterias (3, 4, 20).

(17)

[image:17.612.75.535.202.677.2]

del micelio y no del caldo de cultivo (figura 1- f y 1-i). Para la modificación de la técnica de microdilución con la adición de sales de tetrazolium para detección de viabilidad, se espera que el cambio de color se presente de forma homogénea en el medio de cultivo (Anexo 4), lo que es más evidente y por lo tanto facilita la determinación de viabilidad (17, 19, 21).

Tabla 3: Crecimiento en Caldo Mueller-Hinton, Caldo Extracto de Malta y Caldo Sabouraud; y asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium, por parte de las cepas de Aspergillus spp. y Fusarium spp.

Medio de

Cultivo Tratamiento Microorganismo

Concentración inóculo 1x104_conidios/ml

Control de esterilidad

CN

Caldo Mueller Hinton

Mueller Hinton + microorganismo

Aspergillus

spp.

A1 Cto ---

A2 Cto ---

A10 Cto ---

Fusarium

spp.

F108 Cto ---

F121 Cto ---

F203 Cto ---

Mueller Hinton + 2,3,5- trifenil –

tetrazolium + microorganismo

Aspergillus

spp.

A1 V ---

A2 V ---

A10 V ---

Fusarium

spp.

F108 V ---

F121 V ---

F203 V ---

Caldo Extracto de

Malta

Extracto de Malta +

microorganismo

Aspergillus

spp.

A1 Cto ---

A2 Cto ---

A10 Cto ---

Fusarium

spp.

F108 Cto ---

F121 Cto ---

F203 Cto ---

Extracto de Malta + 2,3,5- trifenil –

Aspergillus

spp.

A1 V ---

A2 V ---

A10 V ---

Fusarium

spp.

F108 V ---

F121 V ---

F203 V ---

Caldo Sabouraud Sabouraud + microorganismo Aspergillus spp.

A1 Cto ---

A2 Cto ---

A10 Cto ---

Fusarium

spp.

F108 Cto ---

F121 Cto ---

F203 Cto ---

Sabouraud + 2,3,5- trifenil –

Aspergillus

spp.

A1 V ---

A2 V ---

A10 V ---

Fusarium

spp.

F108 V ---

F121 V ---

F203 V ---

CN: Control de esterilidad (caldo Mueller Hinton + solución salina)

Cto: Hubo crecimiento.

(18)

a b c d e f g h i

[image:18.612.77.538.70.257.2]

CN Cto V CN Cto V CN Cto V

Figura 1: Detección de crecimiento y reducción de sales de tetrazolium en tres medios de cultivo a) Control de esterilidad .b) Crecimiento en caldo Mueller-Hinton. c) Asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium. d) Control de esterilidad de caldo Extracto de Malta + solución salina al 0,85%. e) Crecimiento en caldo Extracto de Malta. f) Asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium. g) Control de esterilidad de caldo Sabouraud + solución salina al 0,85%. h) Crecimiento en caldo Sabouraud. i) Asimilación de 2,3,5- trifenil – tetrazolium.

6.3 Determinación de la concentración mínima requerida de propágulos viables para detección de viraje de color.

(19)

El uso de sales de tetrazolium provee de métodos alternos indirectos para medir actividad respiratoria asociada a una cadena de transporte de electrones. Dichas sales son conocidas desde hace tiempo por la capacidad que tienen al teñir las bacterias; hoy en día su uso se ha extendido a pruebas de viabilidad de semilla, pruebas de motilidad bacteriana en agar semisólido, presencia y enumeración de bacterias y detección de sistemas enzimáticos de deshidrogenasas (17,19). Actualmente, no existen estudios con hongos donde se demuestre el uso de 2,3,5-trifenil-tetrazolium como indicador de viabilidad de propágulos fúngicos; sin embargo, en algunos estudios de susceptibilidad antifúngica con levaduras (Candida spp., Candida neoformans) y hongos (Aspergillus o Fusarium spp.) se ha observado que el uso de MTT (bromuro de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio]) y XTT (2,3-bis-(2-methoxi-4-nitro-5- sulfofenil)-5-(fenilamin-carbonil-2H-tetrazol hidróxido)) como indicador colorimétrico de oxido-reducción, ha sido efectivo (7, 21).

En la prueba con resazurina, los resultados obtenidos (tabla 6), muestran de igual manera que todas las cepas evaluadas la asimilaron, debido a que se observó un cambio de color de azul hasta rosa intenso y en ciertos casos alcanza a volverse incoloro (figura 4). El fundamento de la reacción se basa en que la resazurina (azul) (figura 4-a) en su primer estado de reducción es reducida a resorufina (rojo intenso) (figura 4-f) por oxido-reductasas que se encuentran principalmente en la mitocondria de células vivas; posteriormente se reduce a hidroresorufina que es incolora (figura 4-g). El método de reducción de la resazurina se ha descrito como un indicador de oxido-reducción que tiene propiedades de fluorescencia y responde a la actividad metabólica tanto de células humanas como de bacterias (22). En la actualidad es utilizado como un método de detección de células viables en pruebas de susceptibilidad antifúngica tanto en levaduras como en hongos filamentosos, dentro de los que se incluye al grupo de los dermatofitos (7, 23, 24); además de ser un método sensible y altamente reproducible.

(20)

estabilidad de la resazurina puede verse alterada por factores como la luz directa o la luz artificial fuerte, ya que es fotosensible (25). Finalmente, en lo referente al tiempo incubación se manejó un tiempo de 96 horas. La razón de esta evaluación se debe al hecho de que se trabajó con diferentes géneros de hongos y por ejemplo, en el caso de Microsporum gypseum, se necesita de un periodo de incubación de 72 a 96 horas para que se dé la asimilación de la sal de tetrazolium y de la resazurina, debido a que es un microorganismo de crecimiento lento (24). En el caso de Aspergillus spp. y Fusarium spp. se necesita un periodo de incubación de aproximadamente 48 horas, sin embargo las expresión de los resultados de asimilación para ambos géneros se evidenció de forma más clara una vez cumplidas las 72 horas de incubación (27).

Para el presente ensayo, se utilizó como control positivo de crecimiento el medio de cultivo Mueller Hinton + las diferentes concentraciones de inóculo de cada una de las cepas evaluadas (tabla 4), donde se evidenció un óptimo crecimiento (figura 2), confirmando una vez más que el caldo Mueller Hinton es el medio de cultivo más viable para llevar a cabo los ensayos.

[image:20.612.74.506.401.548.2]

Tabla 4: Crecimiento en caldo Mueller-Hinton por parte de las cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp. y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones de inóculo (conidios/ml).

Caldo Mueller-Hinton + microorganismo

Microorganismo

Concentración de inóculo (conidios/ml) Control de esterilidad

CN 1x105 1x104 1x103 1x102 1x101

Aspergillus

spp.

A1 Cto 72h Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h --- A2 Cto 72h Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h --- A10 Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h Cto 96h ---

Fusarium

spp.

F8 Cto 48h Cto 48h Cto 48h Cto 48h Cto 72h --- F108 Cto 72h Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h --- F121 Cto 72h Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h --- F203 Cto 72h Cto 72h Cto 72h Cto 96h Cto 96h ---

M. gypseum Mg Cto 96h Cto 96h Cto 96h Ncto Ncto ---

CN: Control de esterilidad (caldo Mueller Hinton + solución salina)

Ncto: No hubo crecimiento

(21)

a b

[image:21.612.202.410.68.240.2]

CN Ct

[image:21.612.88.518.333.482.2]

Figura 2: Caldo Mueller-Hinton: a) Control de esterilidad de b) Crecimiento en caldo Mueller Hinton.

Tabla 5: Asimilación de 2,3,5-trifenil-tetrazolium por viraje de color del caldo Mueller-Hinton, por parte de la cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp. y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones

de inóculo (conidios/ml).

Caldo Mueller-Hinton + 2,3,5-trifenil-tetrazolium + microorganismo

Microorganismo

Concentración de inóculo (conidios/ml) Control de esterilidad

CN 1x105 1x104 1x103 1x102 1x101

Aspergillus

spp.

A1 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h --- A2 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h --- A10 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h ---

Fusarium

spp.

F8 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h --- F108 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h --- F121 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h --- F203 V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h ---

M. gypseum Mg V 72h V 72h V 72h V 72h V 72h ---

CN: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + 2,3,5- trifenil – tetrazolium + solución salina)

V: Hubo viabilidad.

Nv: No hubo viabilidad.

a b

CN V

[image:21.612.199.416.528.689.2]

(22)

[image:22.612.81.534.110.256.2]

Tabla 6: Asimilación de la resazurina por viraje de color del caldo Mueller-Hinton, por parte de la cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp. y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones de

inóculo (conidios/ml).

Caldo Mueller-Hinton + Resazurina + microorganismo

Microorganismo Concentración de inóculo (conidios/ml) Control de esterilidad CN 1x105 1x104 1x103 1x102 1x101

Aspergillus

spp.

A1 V-R5 72h V-R4 72h V-R4 72h V-R4 72h V-R4 72h --- A2 V-R6 72h V-R1 72h V-R3 72h V-R4 72h V-R4 72h --- A10 V-R6 72h V-R2 72h V-R2 72h V-R2 72h V-R4 72h ---

Fusarium

spp.

F8 V-R4 72h V-R4 72h V-R4 72h V-R6 72h V-R6 72h --- F108 V-R5 72h Ncto V-R3 72h V-R4 72h V-R4 72h --- F121 V-R2 72h V-R2 72h V-R2 72h V-R3 72h V-R3 72h --- F203 V-R3 72h V-R6 72h V-R2 72h V-R2 72h V-R2 72h ---

M. gypseum Mg V-R33 96h V-R3 96h V-R2 96h V-R3 96h V-R4 96h ---

CN: Control de esterilidad (caldo Mueller Hinton + resazurina + solución salina).

V: Hubo viabilidad.

Ncto: No hubo crecimiento.

a b c d e f g

CN V-R1 V-R2 V-R3 V-R4 V-R5 V-R6

Figura 4: Caldo Mueller-Hinton + resazurina: a) Control esterilidad. b – g) Asimilación de resazurina mostrando diferentes intensidades de color.

6.4 Determinación de la longitud de onda para cuantificación de viabilidad por espectrofotometría

[image:22.612.84.539.312.460.2]

(23)

comportamiento de los microorganismo mediante virajes de color, sino también una medida cuantitativa, lo cual implica la utilización de métodos espectrofotométricos, específicamente aplicado a la evaluación de antifúngicos para determinar concentraciones mínimas inhibitorias.

A partir de los ensayos que se llevaron a cabo previamente, donde se observó cambio de color del indicador de viabilidad, se corrió un espectro de absorción, en un rango de luz visible entre 400–900nm, para determinar el pico de absorción de la reacción. La determinación del pico de absorción de la reacción permite definir la longitud de onda para cuantificar la producción de sales de formazán (en el caso de 2,3,5- trifenil – tetrazolium) y la producción de resorufina (en el caso de resazurina). Según los resultados arrojados, para la cuantificación de sales de formazán se determinó una longitud de onda de 580nm (figura 5), puesto que fue donde se presentó el pico de mayor absorción. En cuanto a la cuantificación de resorufina, se determinó una la longitud de onda de 560nm (figura 5).

En los resultados de la prueba de producción de sales de formazán partiendo de diferentes concentraciones de inóculo no se observó diferencia en la intensidad de color (Anexo 4 y 5). Este resultado no justificaría la cuantificación espectrofotométrica, pues se asume que la intensidad de color es directamente proporcional al número de propágulos viables. Por otro lado, en la prueba con resazurina si se observaron diferentes intensidades de color en relación a la inoculación de diferentes concentraciones de propágulos viables (figura 4), pero la escala de intensidad de color no corresponde exactamente a la escala del azul-violeta a rosa intenso, pues se observan coloraciones amarillo-naranja, lo cual no permite la correcta cuantificación de la intensidad del color en una misma longitud de onda. Otro punto a tener en cuenta en relación a la determinación de propágulos viables por intensidad de color para resazurina, es la no concordancia de aumento de intensidad de color en función del aumento de la concentración del inóculo, pues no se observó en todos las cepas y réplicas evaluadas una relación directamente proporcional, entre intensidad de color y número de propágulos (Anexo 4).

(24)

generalizar un tiempo determinado de lectura de viabilidad, teniendo en cuenta diferencias de velocidad de germinación de propágulos y desarrollo de micelio entre diferentes especies. Por ejemplo, los dermatofitos son más lentos en su desarrollo comparado con Fusarium y Aspergillus, por lo que para este estudio se tendrían que establecer tiempos diferentes de lectura para cada género, lo que hace más dispendioso el manejo de los ensayos.

E.coli ATCC 25922 Aspergillus 1

Fusarium 108 M. gypseum

A. fumigatus Fusarium 108

[image:24.612.67.530.171.490.2]

Figura 5: Longitudes de onda para producción de sales de formazán y resorufina.

6.5 Evaluación de la modificación de la técnica empleando terbinafina como antifúngico.

Durante muchos años se han llevado a cabo estudios de susceptibilidad, con el fin de encontrar la concentración mínima inhibitoria de los antifúngicos capaces de llevar a cabo la eliminación parcial y/o total de aquellos microorganismos oportunistas filamentosos, causantes de enfermedades a nivel clínico, los cuales han llevado hasta la muerte a los pacientes que las padecen. Este hecho, ha llevado al desarrollo de antifúngicos de base tanto biológica como sintética. Sin embargo, se ha observando que los hongos, han ido desarrollado resistencia contra la mayoría de los principios activos que contienen los fungicidas y/o fungistáticos, lo cual ha hecho más difícil la tarea de encontrar el blanco de acción que permita la inhibición total del

Sales de formazán 580 nm

Resorufina 560 nm Sales de formazán

(25)

hongo. De acuerdo a esto, estudios previos (1, 10, 11, 30, 33) han demostrado que la terbinafina es un micótico ampliamente usado para tratamientos de onicomicosis y dermatofitosis, debido a la sensibilidad que han mostrado tener cepas tales como Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum gypseum, Scopulariopsis brevicaulis y Epidermophyton floccosum, entre otros. La terbinafina es una alilamina de amplio espectro, que por su mecanismo de acción actúa como fungicida. El blanco de acción de la terbinafina es el ergosterol que se encuentra en la membrana del hongo, el cual se encarga de la integridad y el desarrollo de ésta. El mecanismo de acción está dado en la inhibición de la biosíntesis del ergosterol, que en sí consiste en inhibir la conversión del escualeno a epóxido de escualeno, el cual se une selectivamente a la epoxidasa de escualeno de las células del hongo, está enzima que no es perteneciente al citocromo P-450, permite una acumulación del precursor (escualeno) el cual se vuelve tóxico para las células y conlleva a su lisis (muerte celular) (32). Además de ello, la terbinafina por su fácil asequibilidad y su amplio espectro, también ha sido estudiada en la eliminación de hongos filamentosos como Aspergillus spp. y Fusarium spp., los cuales han demostrado sensibilidad y resistencia, respectivamente. Posiblemente esto pudo haber pasado en los tubos que se muestran en las figuras 9 y 11, donde no se evidenció viabilidad ni por turbidez ni por viraje de color, lo cual se asume que la terbinafina haya inhibido en las cuatro concentraciones evaluadas las tres cepas de Aspergillus spp. y la cepa de Microsporum gypseum, resultados que no se pueden sustentar con veracidad debido a que actualmente no existen estudios con hongos filamentosos donde se hayan estandarizado los puntos de corte que permitan determinar a una cepa como sensible o resistente. No obstante, es importante resaltar que los alcances de los objetivos no abarcan la verificación de la sensibilidad de las cepas evaluadas a antifúngicos comerciales, sino que se centran en determinar si realmente es posible llevar a cabo la modificación de la técnica de microdilución para detección colorimétrica de viabilidad. Con base en esto y en los resultados obtenidos en el presente ensayo (tablas 8 y 9, figuras 8 y 10), donde se evaluó la asimilación de la sal de tetrazolium y de la resazurina frente a diferentes concentraciones de terbinafina, se puede decir que el empleo de indicadores de oxido-reducción, es un procedimiento factible para pruebas de susceptibilidad antifúngica, empleando en este caso terbinafina como antifúngico, debido a que la evidencia de viabilidad de las células no se ve afectado en el momento de enfrentar ya sea la sal de tetrazolium o la resazurina, con diferentes concentraciones de antifúngico (Anexo 9 y 10).

(26)

Aspergillus flavus como cepas de comparación, junto con una cepa de Candida krusei ATCC 6258 y Aspergillus niger ATCC 16404, como cepas de referencia reportadas en test de susceptibilidad para levaduras y hongos filamentosos, motivo por el cual fue relevante evaluar el comportamiento de estas cepas frente a la asimilación de la sal 2,3,5- trifenil – tetrazolium y de la resazurina, esto con el fin de obtener resultados comparables y significativos para dar validez y reproducibilidad a la modificación planteada en el presente estudio. Los resultados obtenidos se pueden observar en el anexo x, el cual permitió evidenciar asimilación de las sales evaluadas por parte de estos microorganismos (Anexo 6 y 7), infiriendo de esta manera, que el objetivo del estudio se cumplió pues los microorganismos de referencia también reducen estos compuestos mostrando el cambio de color en el medio de cultivo, indicando viabilidad.

[image:26.612.99.518.567.718.2]

Para el presente ensayo, se utilizó como control positivo de crecimiento el medio de cultivo Mueller Hinton + inóculo de cada una de las cepas evaluadas (tabla 7), donde se evidenció un óptimo crecimiento (figura 6; Anexo 8).

Tabla 7: Crecimiento en caldo Mueller-Hinton por parte de las cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp.

y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones de terbinafina (µg/ml).

Caldo Mueller Hinton + microorganismo Microorganismo

1x104 conidios/ml

Concentración

Terbinafina (µg/ml) Control de esterilidad CN 1

CN 2 320 32 3,2 0,32

Aspergillus

spp.

A1 Ncto Ncto Ncto Ncto --- --- A2 Ncto Ncto Ncto Ncto --- --- A10 Ncto Ncto Ncto Ncto --- ---

Fusarium

spp

F8 Cto Cto Cto Cto --- --- F108 Ncto Ncto Ncto Ncto --- --- F121 Cto Cto Cto Cto --- --- F203 Cto Cto Cto Cto --- --- M.

gypseum Mg Ncto Ncto Ncto Ncto --- ---

CN 1: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + Solución salina)

CN 2: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + Terbinafina + Solución salina)

Cto: Hubo crecimiento

Ncto: No hubo crecimiento.

320µg/ml 32µg/ml

MH MH+Tb MH+Tb+ MH MH+Tb MH+Tb+

(27)

3,2 µg/ml 32 µg/ml

MH MH + Tb MH + Tb+ MH MH + Tb MH + Tb

[image:27.612.94.518.75.249.2]

Fusarium spp. Fusarium spp.

Figura 6: Crecimiento en Caldo Mueller-Hinton + diferentes concentraciones de terbinafina.

MH MH + Tb MH + Tb + MH MH + Tb MH + Tb + Aspergillus spp. Aspergillus spp.

3,2µg/ml 0,32µg/ml

MH MH + Tb MH + Tb + MH MH + Tb MH + Tb+ Aspergillus spp. Aspergillus spp.

[image:27.612.97.521.295.658.2]

(28)

[image:28.612.115.498.110.258.2]

Tabla 8: Viabilidad o no viabilidad en Caldo Mueller-Hinton + 2,3,5-trifenil-tetrazolium, por parte de la cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp. y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones

de terbinafina (µg/ml).

Caldo Mueller Hinton + 2,3,5- trifenil – tetrazolium + microorganismo Microorganismo

1X104 _conidios/ml

Concentración Terbinafina

(µg/ml) Control de esterilidad CN 1

CN 2 320 32 3,2 0,32

Aspergillus

spp.

A1 Nv Nv Nv Nv --- --- A2 Nv Nv Nv Nv --- --- A10 Nv Nv Nv Nv --- ---

Fusarium

spp

F8 V V V V --- --- F108 Nv Nv Nv Nv --- --- F121 V V V V --- --- F203 V V V V --- ---

M. gypseum Mg Nv Nv Nv Nv --- ---

CN 1: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + 2,3,5- trifenil – tetrzaolium + solución salina)

CN 2: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + 2,3,5- trifenil – tetrzaolium + terbinafina + solución salina).

V: Viabilidad.

MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ Fusarium spp. Fusarium spp.

3,2µg/ml 0,32µg/ml

MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ Fusarium spp. Fusarium spp.

[image:28.612.108.507.319.656.2]

(29)

MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ Aspergillus spp. Aspergillus spp.

3,2µg/ml 0,32µg/ml

[image:29.612.96.520.71.458.2]

MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ MH + T MH+T+Tb MH+T+Tb+ Aspergillus spp. Aspergillus spp.

Figura 9: No viabilidad en Caldo Mueller Hinton + 2,3,5- trfineil – tetrazolium + diferentes concentraciones de terbinafina.

Tabla 9: Viabilidad o no viabilidad en Caldo Mueller-Hinton + Resazurina, por parte de la cepas de

Aspergillus spp., Fusarium spp. y Microsporum gypseum frente a diferentes concentraciones de

terbinafina (µg/ml).

Caldo Mueller Hinton + resazurina + microorganismo

Microorganismo 1x104 conidios/ml

Concentración Terbinafina

(µg/ml) Control de esterilidad CN 1

CN 2 320 32 3,2 0,32

Aspergillus

spp.

A1 Nv Nv Nv Nv --- --- A2 Nv Nv Nv Nv --- --- A10 Nv Nv Nv Nv --- ---

Fusarium

spp

F8 V V V V --- ---

F108 Nv Nv Nv Nv --- --- F121 V V V V --- --- F203 V V V V --- ---

[image:29.612.112.500.564.706.2]

(30)

CN 1: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + resazurina + solución salina)

CN 2: Control de esterilidad (Caldo Mueller Hinton + resazurina + terbinafina + solución salina)

V: Viabilidad.

MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+

Fusarium spp. Fusarium spp.

3,2µg/ml 0,32µg/ml

[image:30.612.83.533.131.532.2]

MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ Fusarium spp. Fusarium spp.

(31)

MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ Aspergillus spp. Aspergillus spp.

3,2µg/ml 0,32µg/ml

[image:31.612.85.526.69.480.2]

MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ MH + R MH+R+Tb MH+R+Tb+ Aspergillus spp. Aspergillus spp.

Figura 11: No viabilidad en Caldo Mueller Hinton + resazurina + diferentes concentraciones de terbinafina)

7. CONCLUSIONES

¾ El 2,3,5- trifenil – tetrazolium si puede ser utilizado como indicador de viabilidad en hongos filamentosos como Fusarium spp., Aspergillus spp. y Microsporum gypseum y no filamentosos como Candida krusei ATCC 6258, debido a la reducción de la sal de tetrazolium a formazán, evidenciada por la producción de color rojo en el micelio, en el caso de hongos filamentosos, y el medio de cultivo.

(32)

¾ La modificación de la técnica de microdilución para pruebas de susceptibilidad a antifúngicos en hongos filamentosos es factible, puesto que la reducción de 2,3,5- trifenil – tetrazolium no se afecta en presencia de antifúngicos como terbinafina.

¾ La reducción de 2,3,5- trifenil – tetrazolium por parte de las cepas de Aspergillus spp., Fusarium spp, Mycrosporum gypseum y Candida krusei ATCC 6258 evaluadas y la estabilidad del color de la reacción de reducción, sugieren que el uso de sales de tetrazolium como indicador de viabilidad de propágulos fúngicos es una alternativa factible para la modificación de la técnica de microdilución propuesta por la CLSI documento M38-A.

8. RECOMENDACIONES

¾ Para evitar falsos positivos y errores al momento de llevar a cabo el montaje de la modificación de la técnica de microdilución, se recomienda en estudios futuros conocer la vida útil de las sales evaluadas: 2,3,5- trifenil – tetrazolium y resazurina.

¾ Para estudios futuros, se recomienda llevar a cabo la modificación de la técnica de microdilución, enfrentando las cepas evaluadas en el presente estudio contra nuevos antifúngicos de interés clínico.

¾ Antes de llevar a cabo la preparación de las diferentes concentraciones, se recomienda filtrar la solución stock del antifúngico, en este caso un comprimido de terbinafina, con el fin de disminuir la turbidez que se presenta en el momento de disolver la terbinafina en Dimetilsulfóxido (DMSO).

¾ En el momento de llevar a cabo los ensayos con cada una de las cepas a evaluar, se recomienda hacer primero el montaje con las cepas de Fusarium y Microsporum gypseum y de últimas hacer el montaje con las cepas de Aspergillus

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(36)

(37)

ANEXO 1

HOJAS DE VIDA DE LAS CEPAS EVALUADAS

COLECCIÓN DE MICROORGANISMOS DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA – PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

Responsable: Melba Linares Linares

Número CMDM-PUJ 11 ( 1)

Microorganismo Aspergillus sp

Fuente Donado Dra

Mery Santaella Origen HUMANO Aislado de muestra de esputo

Almacenamiento Agua destilada

en discos de agar

Nivel de seguridad 2 Conservación Agua destilada

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura 25°C durante 4 días.

Pruebas biológicas Características morfológicas

Características Macroscópicas: crecimiento rápido (3-4 días), Anverso: colonias con pigmento difusible de amarillo a verde Reverso: colonias color verde

Textura: pulverulenta Aspecto: radiado

Características Microscópicas: se caracteriza por presentar la “cabeza aspergilar” constituida por el conidióforo, vesícula, fiálides. Hifas hialinas

Reacciones atípicas No presenta

Identificación de peligros Forma de transmisión

Período de incubación

Enfermedade s que produce

Inhalación de esporas Persona-Persona

3-4 días

Enfermedad pulmonar alérgica o invasora, aspergiloma, lesiones en piel, invasión cerebral, micetoma.

Medidas de protección/Manipulación

‐ EL personal debe usar equipo de protección normal

(Uso apropiado de bata, guantes, tapabocas, gorro)

‐ Eliminación y tratamiento apropiado de desechos

‐ Higiene personal: Lavado de manos

‐ Intervención solo por personal capacitado

Conservación del microorganismo

Conservación en agua

Objetivos a conseguir en todo proceso de conservación de microorganismos son el mantenimiento de:

‐ Viabilidad: Debe de ser posible recuperar el microorganismo conservado cuando sea necesario.

‐ Estabilidad: Los microorganismos recuperados deben

presentar las mismas características genotípicas y fenotípicas de aquellos de los que provienen.

‐ Pureza: Los cultivos en conservación no deben

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Número CMDM-PUJ 12 (2)

Microorganismo Aspergillus sp

Fuente Donado Dra

Mery Santaella Origen HUMANO Aislado de muestra de esputo

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura 25°C durante 4 días.

Características Macroscópicas: crecimiento rápido (3-4 días), Anverso: colonias con pigmento difusible de amarillo a verde Reverso: colonias color verde

Textura: pulverulenta Aspecto: radiado

Características Microscópicas: se caracteriza por presentar la “cabeza aspergilar” constituida por el conidióforo, vesícula, fiálides. Hifas hialinas

Inhalación de esporas Persona-Persona

3-4 días

Enfermedad pulmonar alérgica o invasora, aspergiloma, lesiones en piel, invasión cerebral, micetoma.

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Número CMDM-PUJ 7

Microorganismo Microsporum gypseum

Fuente Donado Dra

Mery Santaella Origen Humano Aislado de Uña de pie

Condiciones de crecimiento Aerobio estricto. Temperatura 25°C durante 7-10 días.

Características Macroscópicas: crecimiento moderado (6-10 dias)

Anverso: color amarillo a blanco Reverso: color amarillo a crema Textura: pulverulenta, aspecto plano Aspecto: radial

Características Microscópicas: hifas con macroconidias en huso, paredes delgadas y con menos de 6 lóbulos lo que la

diferencia de M canis (mas de 6 lóbulos); microconidias

ocasionales.

Animales domésticos (gatos, perros)- Humanos Persona-Persona

Fómites/ Geofísico

7-10 días

Tinea capitis, Onicomicosis

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Microorganismo Fusarium sp

Fuente Origen

Humano Aislado de Uña de pie

Características Macroscópicas: crecimiento rápido (3-5 dias) Anverso: color morado

Reverso: color morado y blanco Textura: algodonosa, micelio aéreo Aspecto: radial

Características Microscópicas: las células conidiógenas están aisladas o agrupadas en esporodoquios. Macroconidios curvados, pluriseptados. Microconidios unicelulares, elipsoidales, fusiformes. hialino

Período de incubación Enfermedade s que produce Persona-Persona Lesiones, traumatismos

3-5 días

Onicomicosis, Queratitis, lesión cutánea localizada, Micetoma, Endocarditis.

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Microorganismo Fusarium sp

Fuente Origen

Animal animal

Características Macroscópicas: crecimiento rápido (3-5 dias) Anverso: color rojo oscuro

Reverso: color amarillo verdoso a rojo claro Textura: algodonosa

Aspecto: radial

Características Microscópicas: las células conidiógenas están aisladas o agrupadas en esporodoquios. Macroconidios curvados, pluriseptados. Microconidios unicelulares, elipsoidales, fusiformes. hialino

Período de incubación Enfermedade s que produce Persona-Persona Lesiones, traumatismos

3-5 días

Onicomicosis, Queratitis, lesión cutánea localizada, Micetoma, Endocarditis.