Incidencia de la actividad β-xilosidasa en el proceso de maduración del Lulillo (Clon PL)

(1)

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(4)

(5)

(6)

INCIDENCIA DE LA ACTIVIDAD β-xilosidasa EN EL PROCESO DE MADURACIÓN DEL LULILLO (CLON PL)

ZAIRA XIMENA MEDINA ALBA

(7)

(8)

“La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscarla verdad y la justicia".

(9)

AGRADECIMIENTOS

A Dios, por ser mi bastón y compañero en el desarrollo de éste trabajo tan arduo y lleno de dificultades.

A mis padres y hermanos, quienes de una u otra forma están siempre presentes, para colaborándome y brindarme su apoyo y aliento.

A mis compañeros y amigos, los cuales en los momentos difíciles fueron aquella opinión, complemento, mano amiga y voz de aliento, que desinteresadamente brindaron el soporte en el momento requerido, no solo durante el desarrollo de este trabajo sino en el transcurso

de todo el proceso académico.

A mis profesores y orientadores, los cuales con paciencia y empeño me brindaron sus conocimientos y experiencias, complementando día a día mi formación académica para que

ésta fuera integral y solida, haciendo de mí no solo una futura profesional exitosa sino una ciudadana de bien.

(10)

TABLA DE CONTENIDO

Pág.

Resumen 1

Introducción 2

Justificación y planteamiento del problema 4

Marco Teórico

Desarrollo de híbridos en lulo 6

Lulillo (Clon PL) 7

La pared celular 7

M Hemicelulosas 8

- Enzimas y proteínas que modifican la hemicelulosa de la pared celular 9

⋅ Xilanasas: β-D-xilosidasas 10

Proceso de maduración del fruto 11

Objetivos

Objetivo general 13

Objetivos específicos 13

Metodología

Fase I: Extracción de la β-xilosidasa en la corteza de lulillo (clon PL) 14 Fase II: Optimización de los parámetros cinéticos de la actividad β- xilosidasa

en la corteza de Lulillo (clon PL) 15

Fase III: Evaluación del comportamiento de la enzima β-xilosidasa en el

proceso de maduración del Lulillo (clon PL) 16

Resultados y discusión

Fase I: Extracción de la β-xilosidasa en la corteza de lulillo (clon PL) 17 Fase II: Optimización de los parámetros cinéticos de la actividad β-xilosidasa

en la corteza de lulillo (clon PL) 17

Fase III: Evaluación del comportamiento de la enzima β-xilosidasa en el

proceso de maduración del lulillo (clon PL) 23

(11)

RESUMEN

(12)

INTRODUCCÍÓN

Debido a su gran variedad climática, Colombia cuenta con productos agrícolas promisorios para el sector industrial, en especial para el campo de alimentos donde se tiene gran preferencia por los derivados frutales. El lulo, por ser una fruta tropical y gracias a sus propiedades, es catalogado como uno de los frutos más exquisitos, con grandes posibilidades de exportación por su valor nutritivo, la calidad de su jugo y por los múltiples usos que tiene a nivel agroindustrial.

Al ser éste producto derivado de una planta semisilvestre, se han realizado siembras comerciales cambiándola de su hábitat natural, con el propósito de minimizar los múltiples problemas fitosanitarios que presenta y tener cultivos plenamente controlados, para así poder extender plantaciones que puedan ser sembradas a campo abierto y sean más duraderas. Sin embargo, las deficientes prácticas agrícolas de sus cultivadores y los inapropiados métodos de movilización poscosecha del producto, han impedido que esto suceda, propiciando pérdidas económicas considerables.

Además, es importante tener en cuenta que el fruto es de tipo climatérico y aún después de la recolección continúa con su proceso de maduración, haciéndolo más susceptible a las alteraciones poscosecha dadas por la variación en el metabolismo de los azúcares, ablandamientos y rupturas lo que permite no solo la modificación estética del fruto sino la colonización de agentes patógenos, generando pérdidas económicas. Por ello, entidades gubernamentales como CORPOICA (Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria) en convenio con el Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural en el mejoramiento tecnológico de los cultivos, han adelantado estudios de procesos de hibridación que generan frutos más resistentes y con mejores características organolépticas (1), entre los que se encuentra el lulillo (Clon PL) como la variedad hibrida más incipiente con resistencia a nematodos dada por el cruce de dos variedades de lulo:

(13)

(14)

1. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La economía de un país está fundamentada en los procesos de exportación e importación de los productos de consumo, siendo aquellos que se caracterizan por ser propios de esta zona los que toman mayor validez. Con esto, es posible catalogar al lulo como uno de los productos propios del área andina que hace a Colombia un país promisorio para la producción y comercialización del mismo, ya que le proporciona al cultivo las condiciones necesarias para su desarrollo, dándole al fruto gran importancia tanto a nivel nacional como internacional, debido no solo a su valor dentro de la economía sino por las características organolépticas y nutricionales que presenta

Aún cuando éste es cultivado en diferentes países de Sur y Centro América como Chile, Perú, Ecuador, Panamá, Honduras, entre otros (3), en Colombia este producto tiene gran incidencia en la economía de Departamentos como Huila, Cundinamarca, Valle, Magdalena, Santander, Antioquia, Caldas y Tolima (4). Entre los cuales se puede contar con 5.468 hectáreas cultivadas en total, siendo de estas 1.161 hectáreas pertenecientes al departamento del Huila, consolidándolo como el principal productor a nivel nacional. Los informes del DANE indican que más de 490 hectáreas de lulo estuvieron en producción al cierre del año pasado y que en total fueron producidas 2.909 toneladas de lulo al cierre del tercer trimestre del año 2011 (5), sin embargo pese a la política de apertura e internacionalización de la economía colombiana que ha abierto la oportunidad de incrementar la demanda del fruto en Europa y Occidente, -ya que creció la demanda de procesamiento y comercialización en fresco, en el periodo postcosecha (transporte, empaque, embalaje y almacenamiento)- se presentan perdidas del 30-40 % llegando en algunos casos al 80 % (6)

(15)

Sin embargo, debido a los procesos de hibridación realizados y en comparación con el lulo común (variedad Castilla), el lulillo (hibrido incipiente y con potencial promisorio) es de tamaño más pequeño y su proceso de maduración es más rápido y en la mayoría de los casos, se genera agrietamiento de la corteza (10), favoreciendo así los procesos de colonización de agentes patógenos, que se incrementan durante la maduración no controlada favoreciendo la perdida de los frutos durante el periodo poscosecha.

(16)

2. MARCO TÉORICO

2.1 Desarrollo de híbridos en lulo

Diferentes estudios de investigación han reportado cruzamiento interespecífico (cruzamiento entre individuos de dos especies del mismo género) entre diferentes especies de plantas de este grupo, en donde han obtenido especies híbridas con rasgos agronómicos deseables. Híbrido Puyo, es el primer reporte de entrecruzamiento desarrollado en Ecuador por un agricultor local, donde S. quitoense y S. sessiliflorum permitieron obtener híbridos vigorosos de semilla estéril y altamente productivos. Sin embargo, presentaban desventajas frente a S .quitoense en cuanto al tamaño inferior de sus frutos y un periodo de cultivo productivo no inferior a un año. Con esto, en 1989 el INIAP (Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias) desarrolla un nuevo entrecruzamiento

S. quitoense y cocona - S. sessiliflorum, obteniendo un nuevo híbrido llamado “Palora” con alto vigor, éste cultivo fue reconocido en Ecuador y se propagó en el sur de Colombia debido a que presentaba características como: mayor tamaño de la fruta, duración de tres años de la planta en campo, cosecha dos veces al año y una lenta oxidación del jugo, sin embargo entre los consumidores no hubo gran acogida debido al color naranja de su pulpa y su sabor insípido, aún así, actualmente debido a su bajo costo en el mercado sigue siendo importado a Colombia. (12)

(17)

buscaba obtener mejores características de sabor y de cultivo, lo que condujo a la generación de un nuevo híbrido, el Clon PL o “Lulillo”.(10)

2.2 Lulillo (Clon PL)

Las plantas de Lulillo además de presentar resistencia a parásitos nematodos, se caracterizan por poseer espinas en tallos y hojas, ser más ramificadas y producir mayor cantidad de frutos con respecto a las variedades Castilla y la Selva, lo que favorece la reducción en la distancia de siembra; además, factores como la poca o nula oxidación de jugo, buen sabor, agradable aroma, alto rendimiento, alto contenido de azúcares y gran acidez, le confieren propiedades especiales que hacen de éste fruto un importante ejemplar frutícola(10).

En cuanto a las condiciones que debe tener el cultivo para una mejor productividad, es necesario tener en cuenta que la temperatura debe oscilar entre 16 y 24 °C, la altura debe estar ente un rango de 1.600 y 2.400 msnm y el porcentaje de humedad relativa entre 80% y 100% (10)

2.3 La pared celular

La pared celular actúa como un exoesqueleto que controla la forma celular y permite que se desarrolle una alta presión de turgencia, además participa en la adhesión, señalización celular, defensa y numerosos procesos de crecimiento y diferenciación (13).

Puede ser clasificada en pared celular primaria y secundaria; las primarias se forman en las células en crecimiento y se les considera no-especializadas y similares en estructura molecular en todos los tipos celulares, mientras que las paredes celulares secundarias se forman luego que el crecimiento celular ha cesado y pueden ser altamente especializadas en estructura y composición. (14)

(18)

[image:18.595.143.459.121.328.2]

Figura 1. Modelo aceptado de la pared celular, adaptado por Smith,2001. Se aprecian las hemicelulosas (líneas de color rojo) entrecruzando

microfibrillas de celulosa (cilindros de color celeste). Las pectinas (Líneas irregulares de color negro) se disponen ocupando los espacios entre la red

celulosa-hemicelulosa. (Tomado de: Rosli H-2007.)

2.3.1 Hemicelulosas

Las hemicelulosas, comprenden un grupo heterogéneo de polisacáridos flexibles que se unen a la superficie de la celulosa a través de puentes de hidrógeno (Figura. 2), En la pared celular primaria de las dicotiledóneas, la hemicelulosa más abundante es el xiloglucano, constituido por un polímero lineal de (1-4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales cortas conteniendo xilosa, galactosa y frecuentemente una fructosa terminal (14)

(19)

[image:19.595.104.484.130.472.2]

Figura 2. Estructura de las hemicelulosas. (A) El xiloglucano está formado por una cadena lineal de (1-4)-β-D-glucopiranosa con cadenas laterales

conteniendo xilosa “Xil”, galactosa “Gal” y fructosa “Fuc”. (B) Los xilanos están constituidos por una cadena lineal de (1-4)-β-D-xilosa. Pueden tener

también cadenas laterales de arabinosa “Ara”, ácido 4-O-metilglucorónico (4-O-Me-β-GlcA), u otros azúcares. (C) Los glucomananos poseen una

cadena lineal que altera un residuo de β-D-Glucosa “Glc” con dos residuos de β-D-manosa “Man”. (Tomado de: Bustamante C.-2009)

2.3.1.1 Enzimas y proteínas que modifican la hemicelulosa de la pared celular

Los distintos componentes estructurales de la pared celular sufren modificaciones como consecuencia de diversas enzimas y proteínas sobre sí misma, entre las enzimas responsables del metabolismo de las hemicelulosas se pueden mencionar:

(20)

• Xiloglucano endotransglicosidasas: Hidrolizan las uniones internas de las cadenas (1-4)-β-D-glucano del xiloglucano y transfieren el nuevo extremo reductor formado a la posición C-4 de la unidad de glucosa en el extremo no-reductor de otro polímero u oligosacárido de xiloglucano. Son altamente específicas.

• Endo-β-manasas: Hidrolizan los enlaces β-1,4 entre residuos de manosa presentes en la cadena principal de mananos y heteromananos no sustituidos.

• β-galactosidasas: Liberan residuos de galactosa a partir de polímeros pécticos y hemicelulósicos.

• α-Arabinofuranosidasas: Liberan residuos de arabinosa. • Xilanasas y β-xilosidasas.

2.3.1.1.1 Xilanasas: β-D-Xilosidasas

Los xilanos son compuestos de xilosa con uniones β(1-4)-D-xilopiranosídicas, estando éstas presentes en mayor proporción en el heteropolisacárido, con diferentes radicales tanto centrales como laterales, entre los cuales los más comunes son grupos acetil, arabinosil y glucoronosil.

Para que se den los procesos de hidrólisis de estas moléculas se requiere la estructura de la hemicelulosa, ya que es ella la que determina la composición del sistema xilanolítico necesario para su total hidrólisis, por ello este sistema enzimático consta de una mezcla de endo y exo enzimas que actúan así:

• Endo-β-1,4-D-xilanasas: Enzimas que actúan hidrolizando los enlaces glicosídicos de tipo β-(1,4) dentro de la cadena de hemicelulosa y produciendo grandes cantidades de xilooligosacáridos sustituidos y no sustituidos de diferentes tamaños

• Exo-β-1,4-D-xilanasas: Enzimas que actúan removiendo solamente unidades de D-xilosa a partir de extremidades no reductoras de la cadena de xilano

(21)

Figura 3. Representacion grafica deñ xilano y de los posibles sitios de accion de las enzimas más caracterizadas que están involucradas en su

modificación. Tomado de: Rosli H- 2007

De este grupo de enzimas, la β-xilosidasa especialmente, se caracteriza por poseer una alta estabilidad térmica, con una actividad óptima a pH de 4,5 a 5,0 con una temperatura de 37 °C (15), lo que facilita procesos de extracción con sustancias de tipo alcalino entre las que se encuentran el etanol, el acetato de sodio, el cloruro de sodio, entre otras. Además se ha podido identificar que estas enzimas están reguladas genéticamente, siendo la expresión del gen FaXyL1 la responsable de la actividad de la β-xilosidasa, la cual está regulada hormonalmente e influenciada por la presencia de isoenzimas implicadas en el proceso de maduración de los frutos. (16)(17)

2.2.2 Proceso de maduración del fruto

La mayoría de los frutos durante su proceso de maduración generan una serie de cambios morfológicos y estructurales, debido a que en su pared celular se encuentran una serie de macromoléculas conformadas por polisacáridos, proteínas, compuestos aromáticos y alifáticos que rodean y protegen a la célula, lo cual es esencial para la supervivencia frente a condiciones ambientales adversas y a ataques de patógenos y herbívoros (18). Tales modificaciones se caracterizan por la pérdida de firmeza de la pared, el aumento del contenido de carbohidratos sencillos, la disminución de los ácidos, el cambio en el aroma, en el color, en el sabor y la variación en la actividad respiratoria del fruto; siendo este último, un factor indispensable que marca su estado fisiológico y su clasificación. (19)

(22)

lentamente, una vez se alcanza este mínimo, este tipo de frutos tienen la capacidad de incrementar nuevamente la intensidad respiratoria hasta alcanzar un valor máximo llamado pico climatérico, en el cual la fruta alcanza su máximo tamaño, después de esto la intensidad respiratoria disminuye de nuevo hasta la etapa de senescencia del fruto (19) Durante este periodo se presentan las modificaciones características de la maduración organoléptica que le dan al fruto todos sus atributos deseables desde el punto de vista visual y gustativo. (20)

(23)

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo General

Determinar la incidencia de la actividad β-xilosidasa en el proceso de maduración del lulillo (clon PL)

3.2 Objetivos Específicos

• Realizar la extracción y solubilización de la enzima β-xilosidasa a partir de corteza madura de lulillo (clon PL).

• Estandarizar los parámetros cinéticos para la actividad β-xilosidasa extraída de la corteza de lulillo (Clon PL)

(24)

4 METODOLOGÍA

4.1 Fase I: Extracción de la β-xilosidasa en la corteza de lulillo (clon PL).

• Selección y tratamiento de las muestras:

Se trabajó con lulillos (Clon PL) obtenidos de la finca San Antonio, vereda Guacaica perteneciente al Departamento de Caldas, la cual se caracteriza por tener una temperatura de 26 °C y altura de 1.600 msnm.

Al no tener una población de referencia accesible y bien diferenciada, se realizó un muestreo no probabilístico por conveniencia a partir de 100 frutos colectados, en donde se trabajó únicamente con cortezas de lulillos 90% amarillas, las cuales se maceraron con nitrógeno líquido hasta obtener una mezcla homogénea. Posteriormente se lavaron con acetona fría con el fin de eliminar por completo los fenoles presentes.

• Extracción de la enzima:

Un gramo del pellet se resuspendió en 3 mL de buffer acetato de sodio/ácido acético 0,05 M; pH 6.0 que contenía NaCl 1,0 M y Polivinilpolipirrolidona 1,0% (p/v). El tiempo de contacto fue de 2 h a 4°C, para permitir la extracción de la β-xilosidasa; posterior a ello se centrifugaron los tubos a 4 °C por 30 min a 4000 rpm (21), utilizando el sobrenadante para la cuantificación de proteína y de actividad de la enzima.

• Cuantificación de proteínas totales:

A partir del sobrenadante obtenido se utilizó la técnica de Lowry, empleando 400 µL de extracto (22)

• Medición de la actividad enzimática:

(25)

Los resultados de la actividad enzimática (U) se expresaron como moles de p-nitrofenol liberados por minuto. Y bajo la relación de proteínas totales y la actividad enzimática se determinó la actividad específica β-xilosidasa, definido como U/mg proteína.

4.2 Fase II: Optimización de los parámetros cinéticos de la actividad β- xilosidasa en la corteza de Lulillo (clon PL).

Es importante señalar que en adelante se realizaron los mismos procedimientos de extracción, de medida de actividad enzimática y de proteína descritos en la fase anterior. Adicionalmente, para la selección de cada variable que se hizo por triplicado, el diseño fue escalonado

• Modificación de las variables constituyentes del buffer de extracción

En el buffer que contenía ácido acético/acetato de sodio, se variaron las concentraciones y el pH, realizando ensayos de tipo factorial escalonado(Tabla 1) que permitieron tomar como óptima, la variable con la mejor actividad enzimática.

Tabla 1. Factores evaluados en el diseño experimental para la estandarización del Buffer de extracción.

Variables Niveles

PVPP (%)

(Aditivo del Buffer de extracción) 0,0 0,5 1* 1,5 2,0

NaCl (M) 0,0 0,5 1* 1,5 2,0

Concentración del Buffer (M)

“Acetato de sodio- Ácido acético” 0,01 0,05* 0,1 O,15 0,20

pH 3,0 4,0 5,0 6,0* 7,0

* Valor definido como concentración teórica

(26)

Tabla 2. Factores evaluados en el diseño experimental para la determinación de los parámetros cinéticos.

Variables Niveles

Temperatura 20°C 37°C* 40°C 50°C 60°C

Concentración sustrato

ρ-nitrofenil-β-D-xilanopiranosido 3 mM 4mM 5mM* 6mM 7mM

Tiempo de reacción 15 min 30 min* 45 min 60 min 75 min * Valor definido como concentración teórica

Los datos obtenidos se analizaron de manera independiente por ensayo realizado, mediante un análisis estadístico de varianza (ANOVA) realizado en el programa estadístico pastprogram.

4.3 Fase III: Evaluación del comportamiento de la enzima β-xilosidasa en el proceso de maduración del Lulillo (clon PL)

Se utilizaron 100 lulillos completamente sanos donde la tonalidad de las cortezas eran 90% verdes – 10% amarillas, estos se dejaron madurar a temperatura ambiente, en el laboratorio de Química de Alimentos, de la Pontificia Universidad Javeriana, durante 11 días, período en el cual se completó todo el proceso de maduración hasta la senescencia del fruto.

De acuerdo con las mejores respuestas de las variables seleccionadas para la cinética enzimática obtenida en la segunda fase, se utilizaron los protocolos descritos para proteína y cuantificación de β-xilosidasa durante el tiempo que duró la maduración del lulillo. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

(27)

5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

5.1 Fase I: Extracción de la β-xilosidasa en la corteza de lulillo (clon PL).

Tras el proceso de selección y tratamiento de muestras se logró obtener un pellet color amarillo libre de interferentes, dada la acción disolvente y precipitante de la acetona (24), la cual fue retirada tras la eliminación del sobrenadante generado en los lavados; al adicionarle al pellet obtenido el buffer teórico de extracción y solubilización enzimática, acetato de sodio/ácido acético 0,05M; pH 6,0; NaCl 1,0 M; PVPP 1,0 % p/v; (21), buffer empleado en diversos análisis enzimáticos realizados para el estudio de enzimas β-xilosidasa, β-glucosidasa, β-glucanasas en muestras de fresa (21),aguacate (25) y tomate (26).

Una vez realizado el proceso de centrifugación, se obtuvo un sobrenadante de color amarillo claro en donde estaba solubilizada la enzima en estudio, por la acción del buffer empleado. Al realizar los análisis respectivos de obtuvo una actividad β-xilosidasa de 7,62 X 10 -4 U/mg proteína (Tabla 7 Anexos)

5.2 Fase II: Optimización de los parámetros cinéticos de la actividad β- xilosidasa en la corteza de lulillo (clon PL).

5.2.1 Modificación de las variables constituyentes del buffer de extracción

Los análisis para optimizar el buffer de extracción para la enzima en este fruto determinaron que no es necesaria la presencia de PVPP en el buffer; A pesar que en el ensayo inicial se determino que el mejor resultado de PVPP era con 2% (p/v) (Figura 7) con una actividad específica de 9,3 x 10-4 U/mg de proteína (Tabla 12 Anexos). Al comparar los resultados de los diferentes ensayos de variación de la concentración del aditivo, se determino que existen diferencias estadísticamente significativas entre ellos con p < 0,05 (Tabla 13 y 14 Anexos) por lo cual para el siguiente ensayo se realizó la variación de NaCl en presencia 2,0 % de PVPP y NaCl en ausencia total de éste (Figuras 8 y 9 ) arrojando valores de actividad específica de 1,46 x 10 -3 U/mg proteína y 1,41 x 10 -3

(28)

Variación Polivinilpolipirrolidona

PVPP (% p/v)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

B

-x

ilo

sidasa

U

/mg de

proteí

na

[image:28.595.148.438.157.367.2]

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025 0,030 0,035

Figura 7. Gráfica comparativa de actividad específica en las diferentes concentraciones de PVPP

Variación NaCl 2% PVPP

B

-xil

o

s

id

a

sa

U/

mg de p

rot

e

ína

[image:28.595.132.452.440.693.2]

(29)

Variación NaCl 0% PVPP

NaCl (M)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

B

-xil

o

s

id

a

sa

U/

mg de p

rot

e

ína

[image:29.595.150.469.179.406.2]

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Figura 9.Gráfica comparativa de actividad específica en las diferentes concentraciones de NaCl 0%PVPP

Debido a que el PVPP es un aditivo tiene la propiedad de promover transformaciones específicas en otras sustancias bioquímicas, como las proteínas grasas, almidones y otros azúcares, y adsorbe selectivamente los compuestos fenólicos no polimerizados y oxidables por formación de puentes de hidrógeno entre el grupo hidroxifenólico y el enlace amida de la PVPP (27). Se determinó experimentalmente que éste no es requerido como aditivo para el buffer de extracción y solubilización, ya que por ser especifico para remover compuestos fenólicos, y ser esta acción suplementada con los lavados previos realizados con la acetona, se hace innecesario el uso de éste detergente.

(30)

Continuando con el ensayo factorial escalonado, la variación de la concentración del buffer fue el siguiente proceso experimental. Se estableció que la mejor concentración era 0,1 M con una actividad específica de 1,4x10-3 U/mg proteína (Tabla 30 Anexos), sin embargo, en la Figura 10 se puede evidenciar que los valores entre los datos obtenidos de las diferentes concentraciones empleadas no es muy marcada aunque son estadísticamente significativos (P<0,05) (Tablas 31 y 32 Anexos)

Variación Buffer Acetato

Buffer Acetato (M)

0,00 0,05 0,10 0,15 0,20

B-x

ilosid

a

sa

U/m

g

d

e

pro

teína

[image:30.595.136.448.283.509.2]

0,000 0,005 0,010 0,015 0,020 0,025

Figura 10. Gráfica comparativa de actividad específica en las diferentes concentraciones de bufferacetato

(31)

Variación pH

pH

3 4 5 6 7

B

-xil

o

s

id

a

sa

U/mg de p

rote

ína

[image:31.595.138.447.127.375.2]

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04

Figura 11. Gráfica comparativa de actividad específica en las diferentes variaciones de pH

(32)

Variación Temperatura

Temperatura (°C)

20 37 40 50 60

B

-xil

o

s

id

a

sa

U/mg de p

rote

ína

[image:32.595.137.448.139.375.2]

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06

Figura 12. Gráfica comparativa de actividad específica en los diferentes tratamientos de temperatura

(33)

Variación Tiempo

Tiempo ( min )

10 20 30 40 50 60 70 80

B

-xil

o

s

id

a

sa

U/mg de p

rote

ína

[image:33.595.136.447.127.372.2]

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05

Figura 13.Gráfica comparativa de actividad específica en los diferentes tratamientos de tiempo.

Por otro lado, diversos autores sugieren que las altas temperaturas durante periodos de tiempo prolongado (más de un día de exposición) retrasan el ablandamiento de los frutos, ya que se reduce la actividad de las enzimas encargadas de la degradación de la pared (30).; Por lo cual, se busco en los análisis realizados someter la enzima a diferentes temperaturas de reacción bajo tiempos determinados y los resultados obtenidos permitieron inferir que es el tiempo de exposición es el que interfiere directamente en el aumento o disminución de la actividad enzimática, pues se determino que a temperatura de 50 °C con un tiempo de exposición corto (15 min), se obtienen mejores resultados de actividad β-xilosidasa, en contraposición a lo determinado en el estudio realizado en fresa, ejemplar de los frutos no climatéricos, en donde las altas temperaturas modifican la expresión genética FaXyL1 encargada de la codificación de la enzima β-xilosidasa y por ende la reducción del catabolismo de la pared celular, generando un retraso normal del reblandecimiento del fruto (21).

(34)

µmoles de ρ-nitrofenol por minuto, con una actividad específica de 3,0 x 10-3 U/mg proteína (Figura 14)(Tabla 54 anexos).

Variación de Sustrato

(p-nitrofenil-B-D-xilanopiranoside)

p-nitrofenil ( mM)

3 4 5 6 7

B-x

ilo

s

id

a

sa

U

/mg

de

pr

ote

ín

a

[image:34.595.156.465.195.437.2]

0,00 0,01 0,02 0,03 0,04

Figura 14.Gráfica comparativa de actividad específica en las diferentes concentraciones de sustrato (ρ-nitrofenil-β-D-xilanopiranosido)

(35)

Aún cuando la medida de las actividades in vitro son de gran utilidad, los resultados deben ser evaluados con precaución, ya que éstas no necesariamente son el reflejo de lo que ocurre in vivo. En primer lugar durante la preparación de los extractos se pueden estar perdiendo cofactores, iones o inhibidores, que in vivo tienen acción en los procesos madurativos del fruto; además las condiciones de cinética tales como pH y temperatura se eligen en base a parámetros óptimos para cierta enzima, los cuales pueden diferir con los encontrados en el apoplasto (paredes celulares, espacios intercelulares, etc.), también es preciso considerar que habitualmente se emplean como sustratos, moléculas o polímeros artificiales, los cuales si bien poseen los mismos tipos de enlaces que son hidrolizados por las correspondientes enzimas, pueden poseer un grado de accesibilidad distinto al que tienen los polímeros in vivo (14)

5.3 Fase III: Evaluación del comportamiento de la enzima β-xilosidasa en el proceso de maduración del lulillo (clon PL)

Los análisis realizados para cuantificar la actividad específica durante los 11 días de maduración determinaron que la actividad β-xilosidasa no está relacionada con el tiempo de maduración de los frutos. Probablemente sea porque la enzima no tenga la disponibilidad de sustrato necesaria, por tanto, no actúa significativamente en el proceso de hidrólisis de los xilanos de la pared celular y por ende en el catabolismo de la pared celular, el cual es llevado a cabo por numerosas enzimas y proteínas que en conjunto conducen a una serie de modificaciones en los polímeros que la componen, estos cambios incluyen: solubilización y demetilación de pectinas, depolimerización de pectinas y hemicelulosas, etc. (14)

(36)

[image:36.595.166.421.448.666.2]

Tabla 60.Cuantificación de Actividad específica, ensayo incidencia de la actividad β-xilosidasa en procesos de maduración del fruto.

y = 0,3758x - 0,1633

R² = 0,9589 ρ-nitrofenol UNIDAD

ACT. ESPECÍFICA Días de

Maduración

ρ-nitrofenol en

extracto (mM)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min

U/mg proteína

1 0,58 15 0,157 0,00031 0,00116 0,000077 0,00211 2 0,62 15 0,169 0,00034 0,00125 0,000083 0,00232 3 0,68 15 0,185 0,00037 0,00137 0,000091 0,00238 4 0,68 15 0,185 0,00037 0,00137 0,000091 0,00234 5 0,62 15 0,167 0,00033 0,00123 0,000082 0,00241 6 0,68 15 0,185 0,00037 0,00137 0,000091 0,00222 7 0,56 15 0,153 0,00031 0,00113 0,000075 0,00207 8 0,68 15 0,184 0,00037 0,00136 0,000091 0,00232 9 0,53 15 0,144 0,00029 0,00106 0,000071 0,00249 10 0,64 15 0,175 0,00035 0,00129 0,000086 0,00219 11 0,64 15 0,174 0,00035 0,00129 0,000086 0,00188

En la Figura 15 se puede identificar con precisión que la actividad enzimática mantiene un comportamiento estable a través del tiempo (Figura A), Aún cuando al hacer una visión más cercana a la escala se logre identificar un comportamiento no lineal (Figura B) con valores muy cercanos a 2,0 x 10-3 U/mg de proteína como actividad específica.

Actividad B-xilosidasa en maduración de Lulillo (Clon PL)

0 2 4 6 8 10 12

(37)

Días de Maduración

0 2 4 6 8 10 12

B -x ilo sid a sa (U/ m g pro teína ) 0,001 0,002 0,005 0,01 0,02 Actividad B-xilosidasa B.

Figura 15. Gráfica de actividad β-xilosidasa en el proceso de maduración del fruto (A) Esquema del comportamiento a través del tiempo con desviación estándar positiva y negativa (B) esquema del comportamiento a través del tiempo con

desviación estándar positiva.

Este comportamiento se precisa en la Figura 16, donde se puede evidenciar las fluctuaciones de la actividad β-xilosidasa con un máximo en el día 9 de maduración, así las variaciones generadas no sean estadísticamente significativas, lo que hace ver que la enzima no participa activamente en el proceso de hidrólisis de los xilogalacturonanos de las hemicelulosas de la pared celular del lulillo.

Actividad B-xilosidasa en maduración de Lulillo (Clon PL)

Días de Maduración

0 2 4 6 8 10 12

[image:37.595.162.427.135.353.2]

B -x ilo sidasa (U/ m g proteína) 0,0018 0,0019 0,0020 0,0021 0,0022 0,0023 0,0024 0,0025 0,0026 Actividad B-xilosidasa

(38)

Visualmente los frutos presentan cambios considerables durante todo el proceso madurativo, entre los que se encuentran los cambios de color, de textura y de firmeza (Figura 17), los cuales son atribuidos a la actividad de diversas enzimas como celulosas, pectinasas, hemicelulasas, entre otras, que cumplen la función de degradar las moléculas poliméricas de la pared celular.(10)(13)(14)

Tomando el cambio de coloración, como uno de los rasgos más característicos de la maduración de los frutos, en las figuras 17 y 18 también se puede observar que el proceso se cumple a cabalidad, esto puede estar ocasionado por la degradación de clorofilas y una manifestación de otros pigmentos que se hallan en el fruto, en general antocianinas o carotenos, que son los responsables de colores rojos, naranjas y amarillos los cuales forman parte del sistema fotosintético (14), acciones que se hacen evidentes el cambio de coloración y las transformaciones dadas por el fruto en análisis a través del tiempo.

(39)

la molécula, sin embargo en los procesos de maduración del fruto se activan las pectin-metil-esterasas y las celulosas (32), entre otras.

Por otra parte, se ha determinado que en los componentes de la pared celular hay pérdida de celulosa y hemicelulosa durante la maduración en gran cantidad de frutos. Sin embargo, también se reporta que las hemicelulosas son un componente minoritario de la pared celular debido a que no presenta grandes cambios, haciendo improbable una correlación entre el contenido de hemicelulosas con el grado de firmeza del fruto, lo que sugiriere que el contenido de ésta no es uno de los principales determinantes de la firmeza, (13) lo cual tiene relación con los resultados obtenidos experimentalmente (Tabla 60), y la similitud que presentan en su actividad enzimática. Además, según reportes se ha determinado que la actividad β-xilosidada aún cuando se detecta en todos los estadios madurativos, es en frutos más blandos como la fresa donde tiene mayor acción y es poco participante en frutos con cortezas mas fuertes como el lulillo (13).

Por otro lado, para que ocurra una completa degradación durante la maduración de los xilanos constituyentes de las hemicelulosas, probablemente se requiera de la acción coordinada de xilanasas y de β-D-xilosidasas, dado que se ha propuesto que las xilanasas catalizarían la hidrólisis interna de este polímero, mientras que las β-xilosidasas (de actividad exo), liberan residuos de xilosa desde el extremo no reductor a partir de los fragmentos generados por la primera (13), lo que hace probable que en el extracto enzimático no se expresara la acción de las xilanasas y por ello no se tuviese el suficiente sustrato para la expresión de las β-xilosidasas.

(40)

6. CONCLUSIONES

• Es posible realizar los procesos de extracción y solubilización de la enzima β-xilosidasa a partir de corteza madura de lulillo (Clon PL), fruto de tipo climatérico, bajo la presencia del buffer de extracción previamente establecido para frutos de tipo no-climatérico (Acetato de sodio/Ácido acético 0.05M; NaCl 1M; Polivinilpolipirrolidona 1% (p/v); pH 6). Obteniéndose una actividad específica de 7,62 X 10 -4 U/mg proteína; haciendo notable la presencia de ésta enzima en el fruto.

• Al realizar el proceso de optimización del buffer especifico para el fruto en análisis, se estableció que el PVPP y el NaCL no influyen en el proceso de extracción de la β-xilosidasa de la corteza del lulillo (Clon PL) definiéndose como buffer óptimo para la extracción y solubilización de la enzima el buffer acetato 0,1 M con pH 6,0

• Al estandarizar los parámetros cinéticos para la actividad β-xilosidasa se identificó que las altas temperaturas (50°C) bajo periodos cortos de tiempo (15 min) permiten una actividad específica adecuada.

• El ensayo experimental realizado durante todo el proceso de maduración del fruto permitió inferir que no hay incidencia de la actividad β-xilosidasa en el proceso de maduración del lulillo (Clon PL), ya que la actividad específica se mantiene estable durante todo el proceso, por lo tanto se le atribuye la acción de maduración del fruto a otras enzimas hidrolíticas.

7. RECOMENDACIONES

• Realizar ensayos sin eliminar los interferentes de las pruebas (fenoles y demás compuestos eliminados con la acetona) con el fin de tener parámetros de comparación

• Evaluar en conjunto la actividad xilanasa y β-xilosidasa ya que su acción es interdependiente.

(41)

8. REFERENCIAS

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departamento. http://www.lanacion.com.co/2012/02/29/repunto-produccion-de-lulo-en-el-departamento/Consultado el 16 de julio de 2012

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11. Rosli H, Bustamante C, Civello P, Martínez G. Caracterización de la actividad β-xilosidasa durante

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s&congr_id=211236# Consultado el 27 de Diciembre de 2011

12. Cárdenas Z. Identificación de híbridos en lulo (Solanum quitoense Lam.) y tomate de árbol (Solanum betaceum Cav.) mediante el uso de marcadores COSII. Tesis Doctoral. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá 2009, 101p.

(42)

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(43)

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(44)

[image:44.595.159.425.432.658.2]

ANEXOS

Tabla 3. Datos obtenidos para curva patrón técnica de Lowry

Absorbancia 500 nm Albumina

ug/mL Rep.1 Rep. 2 Rep. 3 Promedio

Desviación Estándar

% Coeficiente Variación

75,000 0,140 0,150 0,140 0,143 0,006 4,028

125,000 0,281 0,267 0,252 0,267 0,015 5,439

250,000 0,511 0,597 0,508 0,539 0,051 9,383

500,000 1,188 1,057 0,987 1,077 0,102 9,471

Tabla 4. Datos obtenidos para curva patrón técnica de ρ-nitrofenol

Absorbancia 410 nm

ρ-nitrofenol mM Rep.1 Rep. 2 Rep. 3 Promedio

Desviación Estándar

% Coeficiente

Variación

0,500 0,103 0,086 0,086 0,092 0,010 10,707

1,000 0,198 0,133 0,184 0,172 0,034 19,928

1,500 0,370 0,324 0,345 0,346 0,023 6,649

2,000 0,486 0,527 0,635 0,549 0,077 14,011

2,500 0,861 0,864 0,803 0,843 0,034 4,081

Curva Patrón Técnica de Lowry

Albúmina (ug/mL)

0 100 200 300 400 500 600

ABS. 50

0 nm

0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4

(45)

Curva Patrón Técnica de p-nitrofenol

p-nitrofenol (mM)

0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0

ABS. 41 0 nm 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 p-nitrofenol Linea de Regresión

Coefficients: b[0] -0,1635666667 b[1] 0,3759333333 r ² 0,9592097444

Figura 5. Regresión lineal datos curva patrón técnica de ρ-nitrofenol

Extracción de β-xilosidasa en corteza de lulillo (Clon PL)

Tabla 5. Datos para cuantificación de actividad enzimática- Buffer Teórico- ensayo de extracción y solubilización β-xilosidasa

ABS. 410 nm

Lulillo 1 Lulillo 2 Lulillo 3

R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación Buffer

[image:45.595.154.428.148.387.2]

Teórico 0,254 0,249 0,242 0,231 0,207 0,2 6 0,231 0,022 0,002 9,719

Tabla 6. Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo de extracción y solubilización β-xilosidasa

ABS. 500 nm

R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación Buffer

(46)

[image:46.595.130.445.440.653.2]

Tabla 7. Cuantificación de Actividad específica, ensayo de extracción y solubilización β-xilosidasa

y = 0,3758x - 0,1633

R² = 0,9589 ρ-nitrofenol UNIDAD ACT ESPECÍFICA

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min U/mg proteína

Buffer

teórico 0,665 30 0,180 0,000360 0,00133 0,0000443 0,000762

Tabla 8. Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo de extracción y solubilización β-xilosidasa

y = 0,0022x - 0,0124

R² = 0,9997

Proteínas total del extracto

(µg/mL) mg proteína

Buffer Teórico 145,33 0,0581

Extracción de B-xilosidasa de la corteza de lulillo (Clon PL)

B

-x

ilo

s

idasa

U

/m

g

de p

roteí

n

a

(47)

Variación de PVPP

Tabla 9. Datos para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de concentración de PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 410 nm

Lulillo 1 Lulillo 2 Lulillo 3

PVPP

(% p/v) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación 0,0 0,272 0,3 0,27 0,237 0,222 0,25 6 0,259 0,028 0,003 10,809 0,5 0,237 0,262 0,212 0,229 0,221 0,218 6 0,230 0,018 0,002 7,839 1,0 0,254 0,249 0,242 0,231 0,207 0,2 6 0,231 0,022 0,002 9,719 1,5 0,237 0,194 0,294 0,241 0,236 0,217 6 0,237 0,033 0,003 14,041 2,0 0,202 0,206 0,188 0,205 0,21 0,202 6 0,202 0,008 0,001 3,733

Tabla 10. Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo “Variación de concentración de PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

Tabla 11.Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo “Variación de concentración de PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

y = 0,0022x - 0,0124 R² = 0,9997

Proteínas total del extracto (ug/mL) mg proteína 153,89 0,061 142,15 0,056 145,33 0,058 141,92 0,056 113,74 0,045

ABS. 500 nm

Lulillo 1 Lulillo 2 Lulillo 3

PVPP

(% p/v) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación

0 0,305 0,329 0,352 0,326 0,296 0,349 6 0,326 0,023 0,002 6,930

0,5 0,259 0,31 0,304 0,316 0,31 0,303 6 0,300 0,021 0,002 6,923

1 0,249 0,322 0,331 0,315 0,322 0,305 6 0,307 0,030 0,003 9,715

1,5 0,276 0,243 0,333 0,32 0,368 0,259 6 0,300 0,048 0,005 16,077

(48)

Tabla 12. Cuantificación de Actividad específica, ensayo “Variación de concentración de PVPP para

estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”.

y = 0,3758x - 0,1633

R² = 0,9589 ρ-nitrofenol UNIDAD ACT. ESPECÍFICA

PVPP (% p/v)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min U/mg proteína

0,0 _{0,69 30}_0,19_0,00038_0,0014_0,000046_0,00075

0,5 _{0,66 30}_0,18_0,00036_0,0013_0,000044_0,00078

1,0 _{0,67 30}_0,18_0,00036_0,0013_0,000044_0,00076

1,5 _{0,67 30}_0,18_0,00036_0,0013_0,000045_0,00079

2,0 _{0,64 30}_0,17_0,00035_0,0013_0,000042_0,00093

Estadística

Tabla 13. Datos de análisis estadístico para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de

concentración de PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

Grupos Cuenta Suma Promedio Varianza

PVPP 0,0

(%p/v) 6 1,55 0,259 0,00078

PVPP 0,5

(%p/v) 6 1,38 0,230 0,00032

PVPP 1,0

(%p/v) 6 1,38 0,231 0,00050

PVPP 1,5

(%p/v) 6 1,42 0,237 0,00110

PVPP 2,0

(%p/v) 6 1,21 0,202 0,00006

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de

los cuadrados F Probabilidad

Valor crítico para F

Entre grupos 0,010 4 0,00243 4,39 0,0080 2,76

Dentro de los

grupos 0,014 25 0,00055

(49)

Tabla 14. Datos de análisis estadístico para cuantificación de proteínas, ensayo “Variación de concentración de

PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

PVPP 0,0

(%p/v) 6 1,957 0,326 0,000511

PVPP 0,5

(%p/v) 6 1,802 0,300 0,000432

PVPP 1,0

(%p/v) 6 1,844 0,307 0,000891

PVPP 1,5

(%p/v) 6 1,799 0,300 0,002323

PVPP 2,0

(%p/v) 6 1,427 0,238 0,000557

Valor crítico para

F

Entre grupos 0,0266 4 0,00666 7,062 0,0005998 2,759 Dentro de los

grupos 0,0236 25 0,00094

Total 0,0502 29

Variación NaCl

Tabla 15. Datos para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de concentración de NaCl 2% PVPP

para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 410 nm

NaCl

(%p/v) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

(50)

Tabla 16.Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo “Variación de concentración de NaCl 2%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 500 nm

NaCl

(M) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

[image:50.595.214.387.331.479.2]

0,0 0,153 0,148 0,123 0,136 0,13 0,155 6 0,141 0,013 0,001 9,306 0,5 0,208 0,161 0,197 0,224 0,198 0,225 6 0,202 0,024 0,002 11,644 1,0 0,22 0,21 0,191 0,213 0,273 0,281 6 0,231 0,037 0,004 15,882 1,5 0,304 0,327 0,281 0,314 0,271 0,35 6 0,308 0,029 0,003 9,499 2,0 0,297 0,258 0,32 0,309 0,285 0,252 6 0,287 0,027 0,003 9,539

Tabla 17. Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo “Variación de concentración de

NaCl 2%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

y = 0,0022x - 0,0124 R² = 0,9997 Proteínas total del

extracto (µg/mL) mg proteína 69,65 0,028 97,53 0,039 110,79 0,044 145,56 0,058 136,02 0,054

Tabla 18.Cuantificación de Actividad específica, ensayo “Variación de concentración de NaCl 2%PVPP para

y = 0,3758x - 0,1633

ACT ESPECÍFICA NaCl

(M) ρ

-nitrofenol en extracto

(mM)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min

U/mg proteína

(51)

Estadística

Tabla 19.Datos de análisis estadístico para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de

concentración de NaCl 2%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

NaCl 0,0 (M) 6 1,05 0,176 0,00010

NaCl 0,5 (M) 6 1,35 0,225 0,00116

NaCl 1,0 (M) 6 1,35 0,225 0,00042

NaCl 1,5 (M) 6 1,30 0,216 0,00064

NaCl 2,0 (M) 6 1,32 0,219 0,00065

Origen de las variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los

cuadrados F Probabilidad

Entre grupos 0,0103 4 0,0026 4,33 0,0085 2,76

Dentro de los

grupos 0,0148 25 0,0006

Total 0,0251 29

Tabla 20.Datos de análisis estadístico para cuantificación de proteínas, ensayo “Variación de concentración de

NaCl 2% PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

NaCl 0,0 (M) 6 0,85 0,14 0,00017

NaCl 0,5 (M) 6 1,21 0,20 0,00055

NaCl 1,0 (M) 6 1,39 0,23 0,00135

NaCl 1,5 (M) 6 1,85 0,31 0,00085

NaCl 2,0 (M) 6 1,72 0,29 0,00075

Promedio de los

F

Entre grupos 0,108 4 0,02691 36,58 4,16E-10 2,76

Dentro de los

grupos 0,018 25 0,00074

(52)

[image:52.595.202.395.510.625.2]

Tabla 21.Datos para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de concentración de NaCl 0% PVPP

ABS. 410 nm

NaCl

0,0 0,214 0,188 0,177 0,168 0,141 0,177 6 0,17 0,024 0,002 13,48 0,5 0,282 0,229 0,262 0,254 0,255 0,253 6 0,25 0,017 0,002 6,66 1,0 0,262 0,284 0,251 0,19 0,264 0,246 6 0,25 0,032 0,003 12,81 1,5 0,266 0,224 0,376 0,24 0,298 0,289 6 0,28 0,054 0,005 19,10 2,0 0,308 0,311 0,302 0,279 0,262 0,264 6 0,28 0,022 0,002 7,70

Tabla 22.Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo “Variación de concentración de NaCl 0%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 500 nm

NaCl

(M) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

0,0 0,159 0,181 0,142 0,138 0,123 0,136 6 0,147 0,021 0,002 13,994 0,5 0,23 0,205 0,195 0,209 0,219 0,244 6 0,217 0,018 0,002 8,228 1,0 0,262 0,236 0,234 0,235 0,294 0,239 6 0,250 0,024 0,002 9,597 1,5 0,294 0,266 0,361 0,272 0,277 0,338 6 0,301 0,039 0,004 12,989 2,0 0,325 0,349 0,302 0,281 0,31 0,453 6 0,337 0,061 0,006 18,230

Tabla 23.Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo “Variación de concentración de

NaCl 0%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

y = 0,0022x - 0,0124 R² = 0,9997

(53)

Tabla 24. Cuantificación de Actividad específica, ensayo “Variación de concentración de NaCl 0%PVPP para

y = 0,3758x - 0,1633

ACT . ESPECÍFICA NaCl

(M) ρ

-nitrofenol en extracto

(mM)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min

U/mg proteína 0,0 0,61 30 0,17 0,00033 0,0012 0,000041 0,0014 0,5 0,69 30 0,19 0,00037 0,0014 0,000046 0,0011 1,0 0,68 30 0,19 0,00037 0,0014 0,000046 0,0010 1,5 0,72 30 0,19 0,00039 0,0014 0,000048 0,0008 2,0 0,72 30 0,20 0,00039 0,0014 0,000048 0,0008

Estadística

Tabla 25. Datos de análisis estadístico para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de

concentración de NaCl 2%PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

NaCl 0,0 (M) 6 1,07 0,18 0,00057

NaCl 0,5 (M) 6 1,54 0,26 0,00029

NaCl 1,0 (M) 6 1,50 0,25 0,00102

NaCl 1,5 (M) 6 1,69 0,28 0,00290

NaCl 2,0 (M) 6 1,73 0,29 0,00049

Valor crítico para F

Entre grupos 0,046 4 0,0116 10,99 2,78E-05 2,76

Dentro de los

grupos 0,026 25 0,0011

(54)

Tabla 26.Datos de análisis estadístico para cuantificación de proteínas, ensayo “Variación de concentración de NaCl 0% PVPP para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

NaCl 0,0 (M) 6 0,88 0,15 0,00042

NaCl 0,5 (M) 6 1,30 0,22 0,00032

NaCl 1,0 (M) 6 1,50 0,25 0,00058

NaCl 1,5 (M) 6 1,81 0,30 0,00153

NaCl 2,0 (M) 6 2,02 0,34 0,00377

Promedio de los

F

Entre grupos 0,132 4 0,0329 24,89 2,104E-08 2,76

Dentro de los

grupos 0,033 25 0,0013

Total 0,165 29

Variación Buffer

Tabla 27. Datos para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de concentración de buffer acetato

ABS. 410 nm

Buffer

Desv. Estándar

Error estándar

%Coef. Variación

0,01 0,12 0,165 0,129 0,162 0,115 0,155 6 0,141 0,022 0,002 15,776

0,05 0,206 0,174 0,203 0,192 0,18 0,182 6 0,190 0,013 0,001 6,870

0,10 0,179 0,175 0,18 0,144 0,171 0,161 6 0,168 0,014 0,001 8,177

0,15 0,212 0,202 0,186 0,179 0,169 0,179 6 0,188 0,016 0,002 8,581

(55)

[image:55.595.203.392.332.470.2]

Tabla 28. Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo “Variación de concentración de buffer

acetato para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 500 nm

[Buffer]

(M) R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación

0,010 0,146 0,159 0,121 0,142 0,109 0,149 6 0,138 0,019 0,002 13,672 0,050 0,161 0,152 0,156 0,168 0,163 0,164 6 0,161 0,006 0,001 3,601 0,100 0,164 0,136 0,153 0,128 0,155 0,137 6 0,146 0,014 0,001 9,511 0,150 0,211 0,17 0,165 0,17 0,154 0,166 6 0,173 0,020 0,002 11,394 0,200 0,179 0,197 0,173 0,17 0,166 0,147 6 0,172 0,016 0,002 9,518

Tabla 29. Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo “Variación de concentración de

buffer acetato para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

y = 0,0022x - 0,0124 R² = 0,9997

Proteínas total del extracto (µg/mL) mg proteína 68,21 0,027 78,67 0,031 71,77 0,029 84,12 0,034 83,82 0,034

Tabla 30. Cuantificación de Actividad específica, ensayo “Variación de concentración de buffer acetato para

y = 0,3758x - 0,1633

ACT ESPECÍFICA Buffer

Acetato (M)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min U/mg proteína

[image:55.595.91.507.546.678.2]

(56)

[image:56.595.82.373.189.264.2]

Estadística

Tabla 31. Datos de análisis estadístico para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de

concentración de buffer acetato para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

Buffer 0,01 M 6 0,85 0,14 0,00049

Buffer 0,05 M 6 1,14 0,19 0,00017

Buffer 0,10 M 6 1,01 0,17 0,00019

Buffer 0,15 M 6 1,13 0,19 0,00026

Buffer 0,20 M 6 1,09 0,18 0,00035

Promedio de los

Entre grupos 0,0097 4 0,00243 8,29 0,00021 2,76

Dentro de los

grupos 0,0073 25 0,00029

[image:56.595.81.381.449.532.2]

Total 0,0171 29

Tabla 32. Datos de análisis estadístico para cuantificación de proteínas, ensayo “Variación de concentración de

buffer acetato para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

RESUMEN

Buffer 0,01 M 6 0,83 0,138 0,00035

Buffer 0,05 M 6 0,96 0,161 0,00003

Buffer 0,10 M 6 0,87 0,146 0,00019

Buffer 0,15 M 6 1,04 0,173 0,00039

Buffer 0,20 M 6 1,03 0,172 0,00027

Promedio de los

Entre grupos 0,0059 4 0,00148 6,000162 0,0016 2,76

Dentro de los

(57)

[image:57.595.83.508.369.488.2]

Variación pH

Tabla 33. Datos para cuantificación de actividad enzimática, ensayo “Variación de pH para estandarización de

buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 410 nm

pH R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación 3,0 0,089 0,092 0,088 0,098 0,077 0,096 6 0,090 0,007 0,001 8,285 4,0 0,084 0,087 0,083 0,096 0,087 0,086 6 0,087 0,005 0,000 5,303 5,0 0,162 0,17 0,152 0,171 0,188 0,176 6 0,170 0,012 0,001 7,206 6,0 0,213 0,224 0,218 0,208 0,21 0,221 6 0,216 0,006 0,001 2,942 7,0 0,143 0,216 0,237 0,225 0,231 0,22 6 0,212 0,035 0,003 16,335

Tabla 34. Datos para cuantificación de proteínas-Técnica de Lowry-, ensayo “Variación de pH para estandarización

de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

ABS. 500 nm

pH R1 R2 R1 R2 R1 R2 n Promedio

Desv. Estándar Error estándar %Coef. Variación 3,0 0,151 0,163 0,147 0,157 0,139 0,157 6 0,152 0,009 0,001 5,611 4,0 0,145 0,138 0,137 0,16 0,145 0,15 6 0,146 0,008 0,001 5,809 5,0 0,19 0,175 0,159 0,164 0,181 0,184 6 0,176 0,012 0,001 6,826 6,0 0,187 0,201 0,175 0,163 0,169 0,196 6 0,182 0,015 0,002 8,380 7,0 0,189 0,189 0,192 0,142 0,188 0,178 6 0,180 0,019 0,002 10,611

Tabla 35. Cuantificación proteínas totales mediante la técnica de Lowry, ensayo “Variación de pH para

estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”

y = 0,0022x - 0,0124 R² = 0,9997 Proteínas total del

[image:57.595.206.390.548.675.2]

(58)

[image:58.595.86.511.151.290.2]

Tabla 36. Cuantificación de Actividad específica, ensayo “Variación de pH para estandarización de buffer de extracción y solubilización de β-xilosidasa”.

y = 0,3758x - 0,1633

ACT. ESPECÍFICA

pH

ρ-nitrofenol en extracto

(mM)

Tiempo

(min) µg/mL mg µmoles µmoles/min

U/mg proteína 3,0 _{0,525 30}_0,142_0,000284 _0,00105_0,0000350_0,00117 4,0 _{0,522 30}_0,141_0,000283 _0,00104_0,0000348_0,00121 5,0 0,604 30 0,164 0,000328 0,00121 0,0000403 0,00118 6,0 0,650 30 0,176 0,000352 0,00130 0,0000433 0,00123 7,0 _{0,647 30}_0,175_0,000350 _0,00129_0,0000431_0,00123