Aislamiento y caracterizacion de Cyptococcus neoformans var. gattii a partir de muestras de Eucaliptus en la Ciudad de Mexico

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(1)UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MEXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA. “ Aislamiento y caracterización de Cryptococcus neoformans var. gattii a partir de muestras de Eucalyptus en la Ciudad de México ”. T. E. S. I. S. P A R A O B T E N E R E L T I T U L O D E:. B. I. P. R. O E. L S. O E. G N. O. T. A. VERONICA ALEJANDRINA FLORES URBIETA. DIRECTOR: M. en C. BERTHA ARGÜERO LICEA. IZTACALA LOS REYES IZTACALA, EDO. DE MEXICO 2006.

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(3) DEDICATORIAS Hoy quiero junto a todos ustedes dar gracias: ….a la naturaleza, por el maravilloso destino que ha hecho especialmente para mí.. A mi padre, David, quien desde algún lugar me observa y cuida, por ser mi primer maestro, por haberme regalado un cachito de él y por haberme hecho parte de su vida.. A mi madre, por mi existencia, por su comprensión y cariño que siempre me ha brindado y por los sacrificios que realizó durante mi formación académica.. A mis hijos: Eliuth y Jazmín, el regalo más hermoso que la naturaleza me ha dado, que han llegado a mi existencia para llenarla de amor, alegría y motivación. Por que son lo que más amo y respeto en esta vida; GRACIAS mis pequeños.. A mis hermanos, por que sé que con ellos siempre puedo contar, por su cariño y apoyo incondicional.. Al ser maravilloso que llegó a mi existencia para llenarla de amor y motivación; por ser mi pareja, compañero, amigo, que con su sonrisa me llena de vida y me ha permitido compartir nuestras vidas unidas con la esperanza de compartir todo lo bello que es el crecer y madurar, GRACIAS Eliud.. A toda mi familia, porque sé que tengo un pequeñito espacio en su corazón.. …. y a mis amigos por compartir, reír, llorar, escuchar, platicar, confiar, en fin !. por siempre estar conmigo..

(4) AGRADECIMIENTOS A la UNAM por haberme abierto sus puertas, y haber permitido llegar hasta este momento….. orgullosamente UNAM.. A la M. en C. Bertha Argüero Licea por su asesoría y sus conocimientos que fueron parte esencial en la elaboración de este estudio.. A él M. en C. Héctor Barrera Escorcia que siempre me apoyo incondicionalmente, por sus enseñanzas, por su tiempo y por su gran calidad humana.. A la Biol. Magdalena Torres Zuñiga por su gran ayuda, valiosas críticas y por el apoyo para terminar este trabajo.. A él Biol. José Antonio Meyran por sus correcciones y sugerencias que realizó para que este trabajo llegará a su fin.. A él M. en C. Jonathan Franco López por el apoyo recibido para la culminación de este trabajo.. A mis profesores que a lo largo de mi vida, siempre estuvieron llenándome de sus conocimientos.. 3.

(5) INDICE. RESUMEN……………………………………………………………..1. INTRODUCCIÓN………………………………………………………2. ANTECEDENTES…………………………………………………….29. OBJETIVOS…………………………………………………………..32. MATERIAL Y METODOS…………………………………………...33. RESULTADOS……………………………………………………….39. DISCUSIÓN………………………………………………………….53. CONCLUSIONES……………………………………………………57. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………58. ANEXO………………………………………………………………..65.

(6) RESUMEN. Debido a que el hábitat natural de Cryptococcus neoformans var. gattii se conoce poco en México, el objetivo de este trabajo fue investigar la relación ecológica de esta levadura con árboles del género Eucalyptus en tres avenidas de la Delegación Gustavo A. Madero de la Ciudad de México. Se seleccionaron 135 árboles del género Eucalyptus. ubicados en el Eje Central Lázaro Cárdenas,. Avenida Cuitlahuac y Calzada Vallejo de los cuales se tomaron muestras por duplicado de suelo con restos vegetales, corteza, hojas y flores, el aislamiento se efectuó en medio de Guizotia abyssinica, la identificación hasta especie se realizó con pruebas morfológicas y fisiológicas y la determinación de variedad en el medio de canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) y D –prolina.. Se aislaron 87 especies con características de Cryptococcus spp. Y se identificaron 8 cepas de Cryptococcus neoformans var. gattii,. 6 de eucaliptos. ubicados en el Eje Central Lázaro Cárdenas, una de Calzada Vallejo y otra en Avenida Cuitlahuac. Estos hallazgos confirman la estrecha relación entre Cryptococcus neoformans var. gattii y Eucalyptus camaldulensis siendo hasta el momento la primera descripción de aislamiento de esta variedad de Cryptococcus a partir de Eucalyptus camaldulensis en México.. 1.

(7) 1. INTRODUCCIÓN. La criptococosis es una de las principales enfermedades micóticas que se generan cuando hay un debilitamiento del sistema inmune; la frecuencia de la enfermedad ha aumentado enormemente en los últimos años a nivel mundial, concomitantemente con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA); en México su frecuencia se esta incrementando, pocos estudios epidemiológicos y clínicos existen aún cuando entre el 10-15% de los pacientes con SIDA, desarrollan esta enfermedad; por lo que se ha incrementado el interés en profundizar en el conocimiento de su agente causal, la levadura capsulada Cryptococcus neoformans (1,2,3).. La criptococosis (enfermedad de Busse - Buschke, torulosis, blastomicosis europea) es una micosis de curso subagudo o crónico, causada por una levadura oportunista denominada Cryptococcus neoformans, el considera la principal vía. tracto respiratorio se. de entrada de la levadura al organismo. humano,. después de la inhalación se establece en los pulmones, donde por lo general la infección. es transitoria y subclínica; aunque en pacientes con enfermedades. debilitantes. o. inmunocomprometidos,. se. disemina. rápidamente. por. vía. hematógena a otras partes del cuerpo, como piel y vísceras con una clara predilección al sistema nervioso central especialmente al cerebro y las menínges, causando en muchas ocasiones la muerte (4,5).. La criptococosis se ha denominado como una infección oportunista, debido a. su. relación. con. neoplasias,. enfermedades. debilitantes. y. huéspedes. inmunodeficientes. La llegada de la epidemia del Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida. mostró un. aumento. considerable en su frecuencia y en muchas. ocasiones, es la primera manifestación clínica de este síndrome (2,7).. 2.

(8) 1.1 Reseña histórica. Cryptococcus neoformans fué descritó por primera vez en el año de 1894 por Sanfelice, quién lo aisló del jugo de durazno, lo denominó Saccharomyces neoformans. En el mismo año, Busse, un patólogo y Buschke, un cirujano publican separadamente el aislamiento de la levadura a partir de la tibia de una mujer. Se describe y nombra al organismo Saccharomyces hominis, y para la enfermedad sacharomicosis hominis. En 1896, Curtis describe un caso similar al de Busse y Buschke y denomina al organismo como Saccharomyces tumefaciens. En 1901, Vuillemin transfiere a esta levadura al género Cryptococcus; estudió la morfología y características de la cepa, y comprobó que no tenia la capacidad de formar ascosporas, como lo hace el género Saccharomyces y por lo tanto. la llamó. Cryptococcus hominis.. En el mismo año, Klein realiza el aislamiento a partir de leche. Von Hansemann, en 1905, observa por primera vez el microorganismo asociado a un caso de meningitis. En 1914, Verse reconoce pòr primera vez un caso ante mortem con afección al sistema nervioso central. En 1916, Stoddard y Cutler delinean las diferencias clínicas y patológicas entre criptococosis, blastomicosis. y. otras. micosis,. informaron. sobre. la. reclasificación. del. microorganismo como Torula hystolitica, debido a que en preparaciones histológicas observaron espacios claros, que erroneamente fueron atribuidos a la lisis del tejido que rodeaba a la levadura. Actualmente se sabe que estos “ espacios “ son el polisacárido capsular del hongo. En el mismo año Baker y Haugen desacreditan la acción "enzimática" y definen los principales tipos de lesiones patológicas: gelatinosas y granulomatosas. En 1935, Benham aclara la confusión existente entre blastomicosis y criptococosis y demuestra que el tipo cutáneo de criptococosis europea, era causada por el mismo microorganismo que producía la forma meníngitica más comúnmente reportada en América. Evans, en 1949, descubre los serotipos A, B, y C, en base al estudio de los componentes de la cápsula. En 1954, Zimmerman y Rappaport enfatizaron la frecuente asociación de criptococosis con desordenes malignos del sistema linfático. En 1955, Emons. 3.

(9) describe el aislamiento de la levadura a partir de nidos y materia fecal de pichones. En México, González Ochoa (1955) presentó dos comunicaciones de casos de criptococosis localizados en cerebro. En 1956, Seeliger introduce la prueba de la urea para el monitoreo e identificación de criptococos. En 1962, Staib descubrió que C. neoformans produce colonias cafés cuando crece en un medio conteniendo extracto de Guizotia abyssinica. En nuestro país, González-Mendoza y R. Pérez-Tamayo (1959) presentaron un tercer caso de criptococosis generalizada diagnosticada por necropsia. En 1968, Wilson y Bennet descubren un cuarto serotipo: serotipo D. Lodder y Kreger Van-Rij,en 1970, determinan la prioridad del nombre Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin. En este mismo año, Benham describe cuatro serotipos de C. neoformans: A, B, C y D; estos son reconocidos dentro de dos variedades: C. neoformans var. neoformans (serotipos A y D) y C. neoformans var. gattii (serotipos B y C). En 1975, KwonChung muestra el estado perfecto o estado telemórfico de la levadura. Define como Filobasidiella neoformans representante teleomórfico de Cryptococcus neoformans. En 1982, Ikeda y cols. establecen los patrones antigénicos de los cuatro serotipos de C. neoformans y adiciona un quinto serotipo, A-D.. 1.2 Etiología. Cryptococcus neoformans es considerado el principal agente etiológico de la criptococosis esta es causada por dos variedades: C. neoformans var. neoformans y C. neoformans var. gattii. Cada variedad tiene dos serotipos en la variedad neoformans, los serotipos son A y D; en la variedad gattii los serotipos son B y C (2). Sin embargo, otras especies pueden ocasionalmente ser agentes causales de la enfermedad en el hombre como C. albidus y C. laurentii (18,19).. 1.2.1 Taxonomía. 4.

(10) De acuerdo con Phaff y Fell (20) el género Cryptococcus incluye 17 especies válidas y seis variedades. Así mismo, 39 sinónimos han sido registrados para C. neoformans. Cryptococcus junto con los géneros Candida, Trichosporon, Torulopsis, Malassezia y Rhodotorula forman parte de la familia Cryptococaceae, del orden Cryptococales, dentro de los Blastomycetes(21) (Cuadro 1).. Kreger Van-Rij describe al género Cryptococcus como un grupo compuesto de levaduras con gemación multipolar, con pseudomicelio muy rudimentario o ausente, blastoconidios frecuentemente capsulados, generalmente en medio sólido se observan colonias mucoides, amarillentas, incapaces de fermentar carbohidratos, con una variable capacidad para utilizar nitratos como fuente de nitrógeno y capaces de asimilar inositol (20). Algunas especies de Cryptococcus tienen representantes teleomórficos en la. familia. Filobasidiaceae,. en. el. orden. Ustilaginales. de. la. clase. Heterobasidiomycetes (Cuadro 1). Estas levaduras son la fase haploide en el ciclo de vida, generalmente de basidiomicetos heterotálicos (22). La familia Filobasidiaceae se caracteriza por la formación de basidios no septados, estrechos, con basidiosporas sésiles terminales. Pueden formarse las blastosporas en las hifas, pero no se producen teliosporas. La familia incluye dos géneros Filobasidium (tres especies) y Filobasidiella (una especie representante)(22,23).. Filobasidium floriforme (Olive) es la fase teleomórfica de Cryptococcus albidus. Filobasidium uniguttulatus (Kwon-Chung) pertenece a la fase anamórfica de C. uniguttulatus. La tercera especie del género Filobasidium, F. capsuligenum (Rodrigues de Miranda), no ha sido aislada en su fase levaduriforme haploide; Fell et al. la clasifican dentro del género Leucosporidium. El estado perfecto de C. laurentii es desconocido. Kurtzman descubrió tipos de apareamientos entre las cepas de C. laurentii, las cuales después de la fusión producen un micelio. 5.

(11) dicariótico con conexiones en grapa, con un septo doliporo, pero no esporas sexuales (23).. El. género. Filobasidiella. tiene. una. única. especie. representante. Filobasidiella neoformans con dos variedades: neoformans y bacillispora. Estas son diferenciadas por la forma de las basidiosporas y por algunas características fisiológicas como son la asimilación de ácido málico, glicina y creatinina (26,27,28,29). Filobasidiella neoformans var. neoformans es el estado perfecto de Cryptococcus neoformans var. neoformans y Filobasidiella neoformans var. bacillispora de Cryptococcus neoformans var. gattii (25).. 1.2.2 Morfología. C. neoformans es una levadura de forma redonda u oval, usualmente de 3 a 7 um de diámetro, rodeada de una cápsula de naturaleza polisacárida (polímeros de xilosa, manosa y ácido glucorónico) que varía en diámetro, desde 1 hasta 30 um o más; se reproduce por formación de 1 a 2 gemas conectadas a la célula madre por un cuello estrecho (5).. La capsulación de C. neoformans varía según la cepa y el medio de cultivo, es mínima cuando la levadura es de origen saprofítico, mediana en aislamientos diversos de laboratorio y grande cuando está parasitando los tejidos (5),. C. neoformans crece en medios de cultivos habituales: agar dextrosa Sabouraud (SDA), infusión cerebro-corazón (BHI) y extracto de levadura, en el medio de SDA a temperatura ambiente y a 37 º C, genera colonias con una coloración blanca a amarillenta, lisas, mucoides, limitadas, brillantes, ligeramente convexas y tienden a escurrir sobre el medio de cultivo. Otras especies de Cryptococcus presentan un aspecto similar (30,31). La morfología de la colonia varía según el grado de encapsulación de la cepas las colonias de color blanco tienen un aspecto mucoide y brillante si están formadas de levaduras con cápsula. 6.

(12) grande, el aspecto es seco y mate, si están formadas por levaduras escasamente capsuladas (5). Esta cápsula de naturaleza heteropolisácarida está constituida de una cadena principal de D-manosa en un enlace. (1-3) conformando numerosas. ramificaciones de D-xilosa y ácido D- glucorónico. Dentro de ciertas condiciones de crecimiento la cápsula puede también contener compuestos almidonados, los cuales son liberados al medio de cultivo. Diversas especies del género también producen cápsula.. 1.2.2.1 Serotipos, variedades y estado perfecto.. C. neoformans es una levadura capsulada subdividida en dos variedades y cuatros serotipos en base a su variabilidad antigénica: C. neoformans var. neoformans, serotipos A y D y. C. neoformans var. gattii serotipos B y C.. Recientemente se ha descrito otro serotipo llamado AD, que reacciona con antisuero específico para los sueros A y D (32,33).. Actualmente C. neoformans ha sido clasificado por Kwon-Chung et al (34), en dos variedades: C. neoformans var. neoformans (serotipo A y D). C.. neoformans var. gattii (serotipos B y C).. Existen diferencias morfológicas, metabólicas, ecológicas, epidemiológicas y patológicas entre las dos variedades de C. neoformans. la variedad neoformans morfologicamente sólo presenta células levaduriformes redondas; mientras que la variedad gattii, presenta formas elongadas o baciliformes en adición a las células redondas, además de formación de escaso pseudomicelio (35).. Bennett et al (36), establecieron que la variedad gattii puede usar como única fuente de carbono, algunos ácidos del ciclo de Krebs: ácidos málico, fumárico y succínico; y Dufait et al en 1987. encontraron que utiliza ciertos. aminoácidos, tales como la D-prolina, como única fuente de nitrógeno, lo cuál no hace la variedad neoformans (37).. 7.

(13) Las dos variedades responden diferente ante un agente quelante, tal como el EDTA (100 uM), en el medio urea; en este medio la actividad de la ureasa es inhibida hasta un 86% en. la variedad gattii, mientras. que en la variedad. neoformans sólo en un 30% (38).. El medio más usado para diferenciar las dos variedades , es el medio de L canavanina - glicina - azul de bromotimol (CGB) propuesto por Kwon Chung (34); en el cuál la variedad gattii se desarrolla, debido a su resistencia a la canavanina y capacidad de asimilar la glicina.. Cryptoccus neoformans var. neoformans, se encuentra comúnmente en la naturaleza, se aísla principalmente de excretas de aves, fundamentalmente las de paloma urbana, la variedad gattii se encuentra ecológicamente asociado a árboles del género Eucalyptus (8,11,13).. Los estudios de epidemiología de criptococosis muestran que la variedad gattii prevalece en zonas tropicales y subtropicales y la variedad neoformans tiene una amplia distribución mundial (39).. Existen reportes que indican que la variedad gattii es más resistentes a la terapia antifúngica, mientras que la variedad neoformans es más patógena al ratón (59) Cuadro 2.. C. neoformans era considerado como un hongo imperfecto, hasta que en 1975 Kwon Chung describe el estado teleomorfo (sexual) de la levadura, denominándolo Filobasidiella neoformans, el cual produce basidias fértiles. Cada una de las dos variedades presenta su estado perfecto: C. neoformans var neoformans -. F. neoformans var. neoformans. (Kwon Chung 1975) y C.. neoformans var. gattii - F. neoformans var. bacillispora. (Kwon Chung 1976). (27,40,67). En la variedad neoformans las basidias se producen en unidades de. 8.

(14) hifas cortas con conexiones en pinzas; están solitarias o agrupadas (ninguna tabicada), son delgadas con ápices subglobosos o en forma de maso de 20 a 60 um de largo por 2 a 3.5 um de ancho en la base y hasta 8 um en el ápice, produce pequeñas basidiosporas de 1.0 a 1.3 x 3 um, las cuales se agrandan y se convierten en levaduras en gemación, con cápsula. Las basidiosporas de la variedad. bacillispora miden de 1.0 a 1.5 x 3 a 8 um y posteriormente se. convierten en levaduras capsuladas redondas y en gemación al igual que las levaduras de la variedad neoformans (1).. 1.2.3 Fisiología y Bioquímica. Las características que definen al género Cryptococcus son: asimilación de inositol, producción de ureasa y falta de micelio en agar harina de maíz. Para identificación de C. neoformans se requiere el estudio de una combinación de factores que incluyen. características morfológicas, fisiológicas, tolerancia a la. temperatura y patogenicidad al ratón. C. neoformans crece bien a 37º C, mientras que las cepas no patógenas del género no lo hacen.. La capacidad de C. neoformans para crecer a 37º C en SDA es un criterio importante para la identificación, puesto que permite diferenciar a esta especie patógena de las no patógenas que generalmente son incapaces de crecer a ésta temperatura. La temperatura óptima de crecimiento para C. neoformans es de 29 º C y su límite superior de tolerancia al calor es de 39 º C; se obtiene un crecimiento abundante a 37 º C (41).. Las especies de Cryptococcus son sensibles a la cicloheximida (actidiona) por cual en medios que contengan este antibiótico no se desarrollan.. La prueba. de producción de ureasas es útil especialmente. en la. diferenciación de especies de Cryptococcus con otras especies de levaduras incluyendo Candida. Conjuntamente con C. neoformans , las especies saprobias. 9.

(15) de criptococos también. producen ureasas. Las. especies. más comunes del. género Candida excepto C. Krusel son ureasa negativas. Cuadro 3.. La asimilación de nitrógeno es una característica estable de las levaduras, es un medio útil para la diferenciación del género y especie C. neoformans no obtiene nitrógeno de los nitratos, aunque este es asimilado a partir de diversos aminoácidos y de la creatinina. Cuadro 4. (42, 43,44). C. neoformans. es la única especie del género que sintetiza la enzima. fenoloxidasa, que convierte una variedad. de sustratos. hidroxibenzoicos. (incluyendo 3,4 - dihidroxifenilalanina) en compuestos tipo melanina, que brindan una coloración café marrón a las células. y/o. al medio. Esta reacción fué. observada por Staib cuando cultivó el microorganismo en medio preparado con extracto de semillas de Guizotia abyssinica, característica que se ha utilizado para la identificación rápida de la levadura. La actividad de fenoloxidasa se localiza en pared celular (7,45). Los miembros del género como C. laurentii y C. albidus ocasionalmente pueden producir pigmentación a partir de este sustrato (46,47).. Las pruebas de asimilación de fuentes de carbono tienen gran valor taxonómico, especialmente en los casos en que la fermentación es ausente. Las pruebas de asimilación de azúcares como fuentes de carbono son usadas para diferenciar especies, en este caso particular. de Cryptococcus. La prueba de. asimilación de inositol es un criterio importante para diferenciar a las especies de Cryptococcus con especies de Candida y Torulopsis que son inositol negativas (48,49) Tablas 3 y 5. C. neoformans asimila los carbohidratos glucosa, maltosa, trehalosa, ramnosa, celobiosa y rafinosa, pero nunca la lactosa.. La incapacidad de C. neoformans y en general de otras especies para producir micelio o pseudomicelio, en los medios habituales de laboratorio, es una característica importante y una útil prueba comprobatoria en la identificación, con esta prueba podemos diferenciar a las especies de Cryptococcus de las especies. 10.

(16) de Candida (20,30). No obstante, se deben tomar en cuenta que algunos criptocococos producen un pseudomicelio muy rudimentario.. La patogenicidad al ratón ha sido también usada como un procedimiento específico para la identificación de C. neoformans, porque es la única especie del género que causa meningitis e hidrocefalia, después de 1 a 3 semanas de la inoculación (44).. 1.3 Ecología y Epidemiología. 1.3.1 Hábitat natural. C. neoformans var. neoformans ha sido aislado de varias fuentes en la naturaleza y es notable su asociación con la acumulación de guano de ave, especialmente de las excretas de palomas. Otras fuentes reportadas han sido las excretas de canarios, pericos y loros; así como nidos de golondrinas, productos lácteos, vegetales podridos, frutas y aire. (8,26,52).. A pesar de que la ecología de C. neoformans está asociada con las palomas, el hongo no causa infección en ellas; esto se le ha atribuido entre otras cosas a su estado inmune y a su temperatura corporal, de 40 a 42 º C, a la cuál la levadura se puede reproducir pero es poco virulenta. Las excretas de paloma por lo regular son alcalinas, y tienen gran cantidad de productos nitrogenados, que mantienen viable al microorganismo, sin embargo la exposición directa de las excretas a la luz solar, inactiva a la levadura (1,7,8).. C.neoformans var. gattii, el primer aislamiento del ambiente de este organismo, fue hecho por Ellis y Pfeiffer en 1990 (11), en el Valle Barossa en el sur de Australia. Estos investigadores establecieron su asociación ecológica específica con Eucalyptus camaldulensis, una especie de árbol gomífero rojo ampliamente distribuido en Australia. Subsecuentemente se ha confirmado como. 11.

(17) su hábitat natural otra especie de árbol gomífero rojo Eucalyptus tereticornis (13), este eucalipto presenta una distribución global similar a la de E. camaldulensis y ambas especies son muy frecuentemente confundidas. 1.3.2 Prevalencia e Incidencia. La criptococosis en el hombre y otros mamíferos ha sido informada en todas. las. regiones. del. mundo. a. excepción. del. ártico. y. antártico. (29,54,55,56,57,58).. Como se ha mencionado anteriormente, existen cinco serotipos de C. neoformans agrupados en dos variedades, la distribución geográfica de los serotipos es muy importante desde el punto de vista epidemiológico ya que presentan diferencias considerables; Kwon-Chung et al en 1984 (Kwon-Chung, 1984), informaron sobre la distribución mundial de las dos variedades de C. neoformans (aislamientos clínicos y saprofíticos: el 100% de los aislamientos de Austria, Bélgica, Dinamarca, Francia, Alemania, Holanda, Italia, Suiza y Japón, correspondieron a C. neoformans var. neoformans. Hasta un 85% de los aislados de Argentina, Canadá, Reino Unido y los Estados Unidos (excepto sur de California) fueron de la variedad neoformans y el resto de la variedad gattii ; lo que indica una distribución universal para C. neoformans var. neoformans. C. neoformans var. gattii tuvo una alta prevalencia (35a 100%) en Australia, Brasil, Cambodia, Hawaii, sur de California, México, Paraguay, Tailandia, Vietnam, Nepal y ciudades de Africa Central, indicando que esta variedad corresponde principalmente a zonas tropicales y subtropicales.. C. neoformans posee una peculiar distribución geográfica de sus variedades y serotipos, habiéndose encontrado una incidencia muy elevada de C. neoformans var. neoformans tanto en Europa como en el norte de América, mientras que en zonas tropicales y subtropicales, la variedad gatti es la que predomina (39).. 12.

(18) No existe una relación significativa entre la incidencia de la criptococosis y la raza, ni predisposición ocupacional. Entre los factores predisponentes se consideran : º Raza : El 87% de los casos se presentan en individuos de raza blanca (sajona) (42,43). º Sexo y edad : La infección es más frecuente en el sexo masculino, en una relación aproximada de 3:1; y se presenta entre la 3a y 5a década de la vida, habiendo reportes desde recién nacidos hasta ancianos (6,42,43). º Enfermedades : Por lo regular se presenta en pacientes diabéticos, desnutridos o con colagenopatias, con enfermedad de Hodgkin, linfomas, sarcomas, leucemias y cirrosis hepática (42,43,44). º Tratamientos : Tratamiento prolongado con corticoesteroides (42,43,44).. En forma reciente se ha incorporado una nueva categoría de predisposición el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA), presentándose la infección en este tipo de pacientes hasta en más del 10% y en ocasiones como primera manifestación del síndrome (69,70,71).. En México, debido a que no se ha realizado un estudio epidemiológico completo, se desconoce la verdadera frecuencia de la criptococosis así como la distribución de las variedades de C. neoformans, solo se cuenta con algunas comunicaciones al respecto. Cano-Domínguez et al (60) informan sobre casos de criptococosis asociados con el SIDA, en los que la micosis fue la manifestación inicial. El diagnóstico se estableció en 23 (6%) de 380 casos de SIDA, 22 de ellos hombres, atendidos en el Hospital de Infectología, Centro Médico "La Raza" del IMSS, en el período comprendido de enero de 1984 a noviembre de 1988.. Vergara-Takahashi (61) realiza un análisis epidemiológico para conocer la frecuencia de la criptococosis en el Hospital de Especialidades del Centro Médico. 13.

(19) Nacional del IMSS en el período comprendido de junio de 1986 a noviembre de 1989. Los resultados de este estudio indican que de 2074 estudios micológicos, 489 (23.5%) correspondieron a pacientes con diagnóstico de meningoencefalitis de etiología a determinar, de los cuales seis casos (1.2%) se observaron levaduras en líquido cefalorraquídeo (L.C.R.) y se cultivo C. neoformans. Un caso correspondió a criptococosis cutánea. Los factores predisponentes asociados a la enfermedad incluyeron; SIDA, enfermedades debilitantes y tratamiento con glucorticoides.. En lo que respecta a la prevalencia de la dos variedades en nuestro país, los estudios realizados comprueban la existencia tanto de la variedad neoformans como de la gattii. Hernández-Gómez (62) realizó un estudio con 28 cepas de C. neoformans. obtenidas. de. casos. humanos;. veinticinco. de. estas. cepas. correspondieron a la var. gattii y sólo tres a la var. neoformans. Por el contrario, Garza G. et al. (63) realizaron un análisis de 31 cepas aisladas de pacientes con SIDA, en el que observaron un predominio de la variedad neoformans (26 cepas) sobre la variedad gattii (5 cepas).. 1.4 Cuadros Clínicos. 1.4.1 Criptococosis pulmonar. Usualmente el 95% de los casos son asintomáticos o subclínicos, o bien, con síntomas inespecíficos que únicamente definen alteraciones de tipo pulmonar, la mayoría tiende a la curación espontánea; los casos sintomáticos se manifiestan desde estados leves a graves. La sintomatología leve simula un cuadro gripal, acompañado de tos, fiebre y discreto dolor pleural; al intensificarse el proceso la. 14.

(20) fiebre es más constante, hay pérdida de peso, astenia, adinamia y tos con esputo mucoso. Después de la ruptura de focos dentro de ramas bronquiales, existe una abundante descarga de esputo mucoide conteniendo numerosas células fúngicas.. 1.4.2 Criptococosis del Sistema Nervioso Central (S.N.C.). Esta es la variedad más frecuentemente diagnosticada. Se origina a partir de un foco pulmonar con posterior diseminación hematógena. La razón por la predilección de Cryptococcus por el sistema nervioso central no ha sido satisfactoriamente explicada; sin embargo se le ha atribuido a diversas razones como: 1) La levadura probablemente encuentra menor respuesta celular (fagocitosis) debido al desarrollo de la cápsula, 2) La presencia de factores selectivos nutricionales para la levadura, es decir, fuentes de nitrógeno como la asparagina y creatinina que se encuentran en el fluido espinal y pueden estimular su crecimiento, y 3) La ausencia de factores de inhibición en suero o en líquido cefalorraquídeo (factor anticriptococósico).. La criptococosis del sistema nervioso central presenta tres formas o variedades clínicas, éstas son : meningitis(97%), meningoencefalitis( 2%) y criptococomas (1%).. Meningitis: Es la forma clínica más frecuente, generalmente se manifiesta en forma crónica y gradual. La sintomatología predominante es cefalea intensa (usualmente frontal), fiebre constante, dolor orbital intermitente, y mal estado en general. En la forma crónica de la enfermedad se presenta rigidez y dolor de nuca, y son positivos los signos de Kerning y Brundzinski, e hipertensión intracraneal. Al intensificarse el padecimiento los pacientes presentan gran pérdida de peso, astenia, adinamia, vómito constante, vértigo, delirio, alucinación, irritabilidad, convulsiones, pérdida temporal de la memoria, síntomas oculares como neuroretinitis, fotofobia, estrabismo, etc. Los pacientes en estado severo generalmente manifiestan coma y mueren por insuficiencia respiratoria.. 15.

(21) Meningoencefalitis : Esta entidad es rara, y se presenta como resultado de la extensión de la infección a los espacios perivasculares del cerebro. Los síntomas y signos presentes en la meningoencefalitis aguda son : naúseas, vómito, hipertensión intracraneal, parálisis, sopor, coma; las manifestaciones oculares son : vértigo, visión borrosa, diplopia, fotofobia, oftalmoplejía; los disturbios mentales son: irritabilidad, agitación, apatía, confusión, alucinaciones, psicosis, epilepsia, etc. Los casos fulminantres de meningoencefalitis son de corta duración, aproximadamente de dos semanas o menos, conduciendo al paciente a la muerte (6).. Criptococomas: es una entidad clínica rara, se forman lesiones cerebrales que conforman masas fúngicas desarrolladas en forma de abscesos. En el inicio se presentan cefaleas, naúseas, vómito, convulsiones jacksonianas, hemiplejía y hemiparesia, el curso de esta entidad es grave y migra fácilmente al coma, paro respiratorio y muerte (42).. 1.4.3 Criptococosis cutánea y mucocutánea. Las variedades clínicas de la enfermedad: cutánea y mococutánea en el hombre son usualmente una manifestación de la diseminación de la enfermedad y ocurre en un 10 al 15 % de los casos.. La forma cutánea primaria es una entidad clínica rara que se caracteriza por una lesión inicial o chancro, que puede involucionar o formar lesiones granulomatosas como pápulas, pústulas acneiformes o abscesos ulcerados. La. 16.

(22) topografía depende del sitio de inoculación que regularmente son las extremidades superiores e inferiores.. La criptococosis cutánea secundaria es más común que la anterior, se origina a partir de la diseminación hematógena o linfática de la criptococosis pulmonar, meníngea y/o ósea, la topografía preferente es la cara, cuello y extremidades, las lesiones son. similares a las de la forma primaria:. pápulas. acneiformes, abscesos, o ulceraciones superficiales con evidente necrosis, pero también ocurren como lesiones trombóticas profundas o con apariencia de una celulitis.. La criptococosis cutánea secundaria a diferencia de la variedad primaria, tiene mal pronóstico.Las criptococosis primaria y secundaria cutánea son manifestaciones. clínicas. regularmente. encontradas. en. pacientes. inmunodeprimidos.. Las lesiones mucocutáneas ocurren con menor frecuencia que las cutáneas. Estas se presentan como nódulos, granulomas o como ulceraciones superficiales o profundas y son secundarias a otros focos de infección. Se localizan principalmente en labio y nariz.. 1.4.4 Criptococosis ósea. Es una entidad relativamente frecuente, aproximadamente cerca del 5 al 10% de los casos de criptococosis tienen compromiso óseo. Se origina por la diseminación hematógena a partir de un foco pulmonar o meníngeo. Como en otras enfermedades causadas por hongos, los criptococos tienen una afinidad por los huesos prominentes, craneales, vertebras y huesos largos. Las lesiones son usualmente múltiples, discretas, diseminadas, destructivas, crónicas y poco cambiantes. Pueden afectar articulaciones y se presenta periostitis, osteofibrosis y osteólisis, en este tipo de lesiones existe diseminación frecuente a piel originando. 17.

(23) fístulas que drenan material seropulento mucoide. Los síntomas más frecuentes son intenso dolor óseo y artralgias.. 1.4.5 Criptococosis visceral. En las formas diseminadas, cualquier órgano o tejido del cuerpo puede tener focos de infección. Invade prácticamente todos los órganos de la economía sobresaliendo hígado, intestinos, bazo, corazón, testículos, próstata, etc. Se producen. lesiones. de. tipo. granulomato-gelatinosas.. Sintomáticamente. e. histológicamente semejan neoplasias particularmente de tipo mixomatoso.. 1.5 Diagnóstico de Laboratorio. La toma de productos va a depender de la variedad clínica de criptococosis, las muestras más utilizadas para efectuar el diagnóstico son : esputo, pus, sangre, exudados, orina, líquido cefalorraquídeo (L.C.R.), costras o escamas de lesiones cutáneas, material de biopsias, etc. (1,31,42).. La criptococosis pulmonar es una forma poco diagnosticada, solo puede ser diferenciada de otras alteraciones pulmonares por la demostración del hongo mediante observación microscópica (Tinta china o mucicarmina de Mayer) y cultivo. Las infecciones asintomáticas sólo se pueden demostrar mediante el estudio radiológico del toráx y las pruebas serológicas positivas.. La forma de criptococosis más frecuente diagnosticada es la meníngea o del sistema nervioso central, mediante el analisis bioquímico y las características del líquido cefalorraquídeo (L.C.R.) y por la prueba de aglutinación de partículas de látex.. 18.

(24) 1.5.1 Exámen microscópico de muestras. El exámen microscópico directo de las muestras es de poca utilidad, debido a que no se evidencia la cápsula; y por lo tanto las levaduras fácilmente se confunden con Candida sp. u otros hongos levaduriformes (5), en cambio las preparaciones en fresco con tinta china o nigrosina permiten que los microorganismos capsulados sean delineados por contraste negativo (64). Esta técnica es útil para observar material de biopsias, sedimento de LCR, líquido cisternal, orina o necropsias. La expectoración o muestras de pus son digeridas con KOH, y el material cerebral es macerado en un portaobjetos, antes de mezclarlos con tinta china para ser observados al microscopio (5). Otra técnica reportada, es la tinción con fucsina básica (de Ziehl-Neelsen) contrastada con tinta china; con la cuál el cuerpo de la levadura se observa de color rojo-rosa, un halo blanco de la cápsula y el fondo de la preparación en negro (65).. Los exámenes histológicos pueden incluir tinciones especiales además de la hematoxilina-eosina acostumbrada. Algunos autores reportan excelentes resultados con la tinción de mucicarmín de Mayer, la cual tiñe la cápsula del hongo en fracciones. El ácido peryódico de Schiff (PAS) y plata metenamina, permiten visualizar la cápsula como una aureola no coloreada que rodea a la levadura (49,44).. 1.5.2 Cultivo. Para efectuar el aislamiento del hongo, los materiales clínicos se siembren en estría en medio agar dextrosa Sabouraud (SDA) y se incuban tanto a temperatura ambiente así como a 37ºC. En el medio de SDA se desarrollan colonias blancas y cremosas, brillantes con una superficie elevada y la periferia lisa. El exámen directo en esta etapa de crecimiento revela por lo general que las cápsulas no están bien desarrolladas, después de cinco a siete días más de. 19.

(25) incubación las colonias se vuelven mucoides, desarrollan una convexidad progresiva y toman un color crema a moreno, y la cápsula aumenta de tamaño (1,24).. C. neoformans tiene un requerimento por la tiamina y la adición de extracto de levadura o el empleo de medios enriquecidos como el agar infusión cerebrocorazón (BHI) estimula el crecimiento y la produccción de cápsulas. Después del aislamiento inicial, las colonias pueden ser sembradas en estría en BHI. Cuando se incuba a 37º C en éste medio se generan colonias cremosas, mucoides, opacas, elevadas y circulares en 48 a 72 horas (1).. También se puede realizar el aislamiento primario de C. neoformans a partir de material clínico muy contaminado utilizando el medio selectivo de Staib (agar creatinina-. Guizotia. abyssinica). (45),. obteniendo. así. colonias. con. una. pigmentación café o incluso utilizar el medio propuesto por Shields y Ajello (30,66) adicionando al extracto de la semilla de niger, difenil y clorafenicol que actuán como inhibidores de mohos y bacterias.. 1.5.3 Análisis del L.C.R.. Debido a que la mayoría de las criptococosis diagnosticadas son meníngeas, el análisis del líquido cefalorraquídeo es de gran utilidad en el diagnóstico. Dicho análisis revela alteraciones características en este fluido. Cuadro 7.. 1.5.4 Pruebas serológicas e inmunológicas. 20.

(26) Las pruebas utilizadas para el diagnóstico son : Aglutinación de partículas de látex (AL), inmunofluorescencia indirecta (IFA) y fijación de complemento (RFC), siendo la más sensible y específica la primera (1,68).. La presencia de antígeno es determinada por la aglutinación de partículas de latex sensibilizadas con anticuerpos anticriptococcus, obtenida de conejos inmunizados, es mezclada con suero o fluido espinal del paciente; la aglutinación de partículas de látex es considerada una reacción positiva.. Las pruebas de inmunofluorescencia indirecta (IFA) y fijación del complemento (RFC) son usadas para determinar la presencia de anticuerpos.. Para evaluar el progreso del paciente durante la terapia, la prueba de AL es de mayor utilidad. Un buen pronóstico es indicado por el decremenrto en los títulos de antígeno y la persistencia de títulos altos durante el curso de la terapia denotan un mal pronóstico y la probabilidad de una recaída. Es importante remarcar que las pruebas serológicas pueden generar tanto resultados falsos- positivos como falsos- negativos por lo que siempre tienen que correlacionarse con otras pruebas diagnósticas.. 1.6 Tratamiento. El tratamiento de elección es la amfotericina B. La dosis administrada es similar a al empleada en otras micosis sistémicas : 0.6 mg/kg/día sin pasar de 3 gr como dosis total, administrada con solución glucosada por vía intravenosa. La importancia de éste fármaco es que atraviesa la barrera meníngea. La 5fluorocitosina (5-FC) es un agente antifúngico que presenta buenos efectos contra C. neoformans. Presenta cierta eficacia en el tratamientode meningitis criptococal: Este fármaco puede ser administrado oralmente, es relativamente no tóxico por lo. 21.

(27) que provoca pocos efectos secundarios. Lamentablemente su efecto terapeútico parece ser inferior al obtenido con la amfotericina B. En pocos casos se desarrolla resistencia durante el tratamiento con 5-FC,lo que no ocurre con la amfotericina B.. Una mayor eficacia en los resultados se obtiene al combinar el tratamiento usando amfotericina B y 5- fluorocitosina, en cuyo caso la dosis sugerida es de 0.35 mg/kg/día de amfotericina B, y 150 mg/kg/día de 5-FC por vía oral (1,58).. Los azoles Ketoconazol e Itraconazol a dosis de 400 y 200 mg/día respectivamente, son útiles en los casos pulmonares o cutáneos, pero no en los del SNC debido a que no atraviesan la barrera meníngea (42). El fluconazol tiene gran efecto contra C. neoformans; además es un fármaco que atraviesa la barrera meníngea y provoca pocos efectos secundarios, la dosis de administración fluctúa entre 50 y 150 mg por día, por vía oral. También se puede administrar combinado con amfotericina B (42).. CUADRO 1. Clasificación de Cryptococcus neoformans ( Filobasidiella neoformans) 22.

(28) TAXONOMIA REINO DIVISION SUBDIVISION CLASE ORDEN FAMILIA GENERO ESPECIE VARIEDAD. ESTADO ASEXUAL (ANAMORFICO) FUNGI EUMYCOTA DEUTEROMYCOTINA BLASTOMYCETES CRYPTOCOCCALES CRYPTOCOCCACEAE. Cryptococcus neoformans • neoformans • gattii. ESTADO SEXUAL (TELEMORFICO) FUNGI EUMYCOTA BASIDIOMYCOTINA HETEROBASIDIOMYCETES. USTILAGINALES FILOBASIDACEAE Filobasidiella Neoformans • neoformans • bacillispora. Clasificación propuesta por Ulloa y Hanlin 1978, la cual se basa en el esquema taxonómico de Ainsworth (1973). (Herrera, T. y Ulloa, H. 1990).. 23.

(29) CUADRO 2 PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE LOS SEROTIPOS DE C. neoformans. SEROTIPOS A Y D. SEROTIPOS B Y C. Forma perfecta o fase Filobasidiella neoformans. Filobasidiella neoformans. sexuada. var. Neoformans. var. bacilliospora. Morfología. Forma redonda. Forma redonda y ovalada. Características. L-Malato negativo en 48 L-Malato positivo en 48. bioquímicas. horas, CGB negativo a la horas, CGB (*) positivo a coloración azul. la coloración azul.. Temperatura de. Se desarrolla bien 30º C y Desarrollo. crecimiento. 37º C. Hábitat natural. Suelo, materia fecal de Eucalyptus camaldulensis aves. moderado. a. 30º C y lento a 37º C. Eucalyptus tereticornis. Repartición geográfica de Estados Unidos, Francia, Africa,China, Asia, Sur de casos clínicos. Europa. California. Patogenicidad en ratón. Fuerte. Débil. Tomado de Drohuet et. al. (54). * CGB:Canavanina-Glicina-Azul de Bromotimol.. 24.

(30) CUADRO 3 CARACTERISTICAS. DIFERENCIALES. DE. ALGUNAS. ESPECIES. DE. LEVADURAS. Especie. Presencia de Presencia. Hidrólisis de Sensibilidad. micelio. úrea. de cápsula. a. la compuestos. cicloheximida Cryptococcus. Presencia de Asimilación de Inositol. carotenoides. 0. +. +. +. 0. +. 0. +. +. +. 0. +. 0. +/0. +. +/0. +. 0. +. 0. +/0. 0. 0. +. 0. 0. 0. +. 0. 0. +. 0. 0. 0. 0. 0. neoformans. Cryptococcus sp.. Rhodotorula sp.. Trichosporon cutaneua. Torulopsis glabrata. Candida albicans. Tomado de Rippon(1); Lodder(20); Campell(30). 25.

(31) CUADRO 4 CARACTERISTICAS. DIFERENCIALES. DE. ALGUNAS. ESPECIES. DEL. GENERO Cryptococcus. Especie. de Pigmento en el Hidrólisis. Cryptococcus. medio Níger. C. neoformans. C.. albidus. urea. de Crecimiento 37 C. a Reducción. de. nitratos. +. +. +. 0. var.. 0. +. +/0. +. var.. 0. +. +/0. +. 0. +. 0. 0. 0. +. 0. +. 0. +. +/0. 0. 0. +. +/0. 0. 0. +. +/0. 0. albidus C.. albidus. difluens. C. uniguttulatus. C. terreus. C. laurentii. C.luteolus. C. lactativorus. Tomado de Lodder (20) y Campell (11). 26.

(32) CUADRO 5 ASIMILACION DE FUENTES DE CARBONO POR ALGUNAS ESPECIES DEL GENERO Cryptococcus ESPECIES. ASIMILACION SAC. DEX. GAL. MAL. LAC. RAF. CEL. C. neoformans. +. +. +. +. 0. +/0. +. C. albidus var.. +. +. 0/+. +. +/0. +. +. +. 0/+. +. 0. C. luteolus. +. +. +. +. C. laurentii. +. +. +. C.uniguttulatus. +. +. C. terreus. +/0. +. TRIA. XIL. INO. +. +. +. +. +/0. +. +. +. +. +. +. +. 0. 0/+. +. +. +. +. +. ++. 0/+. +. +. +. +. 0/+. +. 0. +/0. +/0. +/0. +. +. +/0. +/0. +. 0. +. +. +. +. albidus C. albidus var. diffluens. Asimilación : 0 = no se observa crecimiento + = se observa crecimiento ++ = asimilación fuerte. INO = INOSITOL SAC= SACAROSA DEX= DEXTROSA GAL= GALACTOSA MAL= MALTOSA LAC= LACTOSA RAF= RAFINOSA CEL= CELOBIOSA TRIA= TRIALOSA XIL = XILOSA. Tomado de Lodder (20) y Campell (30).. 27.

(33) CUADRO 6 DISTRIBUCION GEOGRAFICA DE LOS SEROTIPOS DE C. neoformans. AREA GEOGRAFICA. SEROTIPOS A-D. SEROTIPOS B-C. No. DE CASOS. No. DE CASOS. Sur de California. 22. 25. Resto de EEUU. 205. 14. Tailandia(Hong-kong,. 17. 13. Africa (Zaire). 20. 6. Japón. 52. 0. Alemania. 17. 0. Suiza. 12. 0. Malasia). TOTAL. 345(85.60%). 58(14.40%). Tomado de Scholer (58).. CUADRO 7 ZONAS GEOGRAFICAS DE DISTRIBUCION DE LA CRIPTOCOCOSIS BAJA INCIDENCIA. ALTA INCIDENCIA. 1-2 Casos/ 1 000 000 de habitantes por 12 casos/ 1 000 000 de habitantes por año. año. Estados Unidos de América. Australia. Gran Bretaña. Sureste asiático (Malasia). Suiza. Japón. Francia. Africa del Norte (Zaire). Tomado de Kaufman y Blumer (56).. 28.

(34) 2. ANTECEDENTES. Ellis y Pfeiffer en 1990 reportan el primer aislamiento del hábitat natural de Cryptococcus neoformans var. gattii (serotipo B) en árboles de Eucalyptus camaldulensis localizados en el Valle de Barossa, Australia, esta levadura se encontró asociado a corteza, hojas, y restos vegetales, debajo de la cobertura de este árbol, los cultivos positivos del hongo coincidieron con el florecimiento de los árboles y negativos en árboles que no estaban floreando o en otras. áreas.. Concluyeron que existe una asociación específica entre C. neoformans var. gattii y el E. camaldulensis y que la dispersión de la variedad gattii, parece ocurrir al final de la primavera concordando con el florecimiento de E. camaldulensis (11).. Pfeiffer y Ellis en 1991, reportan el aislamiento de C. neoformans var. gattii de árboles de E. camaldulensis en un lugar cercano a Fort Point, San Franscisco, este es el primer aislamiento ambiental reportado fuera de Australia y provee la evidencia de que el hongo ha sido exportado de Australia, probablemente por semillas infectadas y/o plantas jóvenes de E. camaldulensis, y concluyeron que la ocurrencia de las infecciones de C. neoformans var. gattii en pacientes con SIDA se incrementará si estos pacientes se exponen a partículas aerotransportadas de la propagación diseminada durante el florecimiento de árboles de E. camaldulensis (12).. Pfeiffer y Ellis en 1991 aislaron a C. neoformans var. gattii a partir de Eucalyptus tereticornis ;este eucalipto presenta una distribución similar a la de E. camaldulensis y ambas especies son frecuentemente confundidas ya que las dos pertenecen al grupo RED GUM, y solo se distinguen por la forma y el tamaño del opérculo. Los aislamientos de E. tereticornis y E. camaldulensis han sido caracterizados como serotipo B; el serotipo C no ha sido aislado aún del ambiente (13). En 1992, Kwon-Chung y colaboradores examinaron cuatro cepas de C.neoformans var. gattii aisladas a partir de E. camaldulensis ( 3 de Australia y 1. 29.

(35) de San Franscisco), 11 cepas obtenidas de muestras clínicas y cepas tipo; encontraron que los cariotipos de 3 cepas de C. neoformans var. gattii aisladas a partir de E. camaldulensis en Australia fueron idénticos y muy similares a la encontrada en San Franscisco, lo cual indica, que están relacionadas y apoyan la hipótesis de un origen común; los cariotipos de esta variedad aisladas de muestras clínicas fueron heterogéneas y diferentes a las muestras aisladas de Eucalyptus (14).. Un hallazgo de C. neoformans var. gattii serotipo B se reportó en Uruguay a partir de un trozo de avispa deshabitado consideran la posibilidad de que la propagación de la var. gattii pudo haber sido llevada por las avispas a la colmena y que algunos estudios podrían ser hechos para determinar el papel potencial de Polybia occidentalis como un vector pasivo de propagación viable de C. neoformans var. gattii o para verificar colmenas como un hábitat posible para esta variedad.(15).. En 1993, Lazera y colaboradores reportan el aislamiento de ambas variedades de C. neoformans de fuentes saprofíticas en la Ciudad de Río de Janeiro, Brasil; se aisló la variedad neoformans de madera y otros restos de plantas dentro de un hueco de un árbol de Syzygum jambulana, un aislamiento de la misma variedad fue identificado en una casa abandonada y un aislamiento de la variedad gattii fue identificada en guano de murcielágo colectado en un ático de una casa vieja (confirmado como serotipo B). (16). En 1996, se reporta el primer aislamiento en México de la variedad gattii a partir de árboles de E. tereticornis, se aislaron e identificaron siete cepas de C. neoformans var. gattiii, cuatro del área de El Rosario, dos de corteza, una de hojas y una de suelo con restos vegetales y el Los Reyes tres a partir de corteza. El aislamiento de estas cepas indica una estrecha relación entre C. neoformans var. gattii y E. tereticornis.(17).. 30.

(36) En 1997, Sorrell y Ellis reportan que en la zona sur oeste de Australia se han aislado altas concentraciones de C. neoformans var. gattii de especimenes de una especie emparentada: Eucalyptus rudis y de una especie no emparentada: E. gomphocephala. Tres de las especies mencionadas ( E. camaldulensis,E. tereticornis, E. gomophocephala) han sido exportadas a varios de los paises donde se ha reportado enfermedades humanas producidas por C. neoformans var. gattii (76). Ellis y Pfeiffer proponen que C. neoformans var. gattii, ha sido exportada de Australia posiblemente de semillas infectadas y/o plantas jóvenes de este eucalipto (11).. Es posible que la especificidad de la asociación entre C. neoformans var. gattii y los árboles en la naturaleza, pueda depender de un vector asociado al eucalipto. Por ejemplo, los criptococos pueden ser transportados a este nicho por animales que viven dentro de un rango restringido( por ejemplo, los koalas los cuales albergan a los organismos entre sus unas y se mueven de noche entre los árboles) o cruzando grandes distancias por el viento o por pájaros que llegan a los eucaliptos( lo que concuerda con un tipo molecular simple de C. neoformans var. gatti que se distribuye ampliamente a lo largo de Australia). Se han encontrado altas concentraciones del organismo en los restos de madera que se encuentran en el interior de agujeros de árboles viejos, donde los organismos están protegidos de los letales efectos de la luz del sol y de secarse. C. neoformans puede utilizar esta madera, la cual es rica en compuestos de polifenol y lignina, como un sustrato para crecer, debido a su actividad fenoloxidasa (76). Los criptococos fueron aislados de flores, hojas y el aire de alrededor de los árboles de E. camaldulensis, durante la época de floración. Las formas fungales consistentes morfológicamente de basidiosporas estuvieron presentes en el material cuando se cultivo un gran número de criptococos. En base a esta información Ellis y Pfeiffer propusieron que el ciclo de vida del hongo involucra formación de basidiosporas (lo que indica presumiblemente que el estado sexual de los hongos existe en la naturaleza) y que la dispersión de este propágulo potencialmente infeccioso ocurre durante la época de floración (53).. 31.

(37) En Apulia, al sur de Italia, fué observado en una mujer VIH positiva un caso autóoctono de meningitis causado por C. neoformans var gattii serotipo B. La paciente nunca había estado en el extranjero y siempre ha vivido en áreas rurales. Su hogar, esta localizado a una distancia aproximadamente 3 Km; de un parque faunístico, cubierto por árboles de eucaliptos. Por otra parte, se llevó a cabo un estudio ambiental para verificar una posible correlación entre este caso clínico y la presencia de C. neoformans var. gattii en el área donde vive la paciente; en conjunto se colectaron y examinaron 255 muestras, 70 del jardín de la paciente y 185 del parque, incluyendo 33 de árboles de E. camaldulensis. C. neoformans se presentó en 11 muestras, 3 de E. camaldulensis, 7 de otras fuentes del parque y una del jardín de la casa de la paciente. C. neoformans serotipo B, fue identificado en 6 muestras, todas provenientes del parque.. 32.

(38) 3. OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GENERAL * Aislar e Identificar a Cryptococcus neoformans var gattii a partir de árboles del género Eucalyptus en 3 áreas de la Delegación Gustavo A. Madero.. 3.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS * Corroborar mediante características morfológicas y bioquímicas el género y la especie de cada una de las cepas aisladas. * Realizar la determinación de la variedad gattii por medio de D- prolina y el medio CGB (Canavanina-glicina-azul de bromotimol).. 32.

(39) 4. MATERIAL Y METODO. 4.1 AISLAMIENTO DE LAS CEPAS. 4.1.1 Procedencia. La población objeto de estudio fue constituida por árboles adultos del género Eucalyptus distribuidos en 3 avenidas ubicadas al poniente de la Delegación Gustavo A. Madero: Eje Central Lázaro Cárdenas, Avenida Cuitláhuac y Calzada Vallejo. El criterio de selección de las avenidas fue la presencia de 300 árboles; por cada avenida se determinó el 15% de la población a muestrear, y con período de floración.. 4. 1. 2. Colecta. Se colectaron por duplicado de cada uno de los árboles: flores, hojas, corteza y suelo con restos vegetales, este material se colocó en bolsas plásticas debidamente etiquetadas. La colecta se realizó manualmente, con la ayuda de tijeras para podar. Las muestras de corteza se tomaron a 1.5 metros de distancia a partir del suelo contando con la ayuda de un cuchillo de campo. Las muestras se transportaron al laboratorio para ser procesadas inmediatamente.. 4. 1. 3 Identificación de especies del género Eucalyptus. Uno de los duplicados de las muestras de hojas, flores, frutos de cada árbol se preparó mediante el método botánico tradicional de prensado y secado (74). Para la identificación taxonómica del material botánico colectado se tomaron como base las claves existentes (72, 73, 74). Para la revisión y verificación de especies de eucaliptos se compararon en el herbario de la E.N.E.P. Iztacala y herbario del Instituto Nacional de Investigaciones Forestales y Agropecuarias (INIFAP) con la asesoría de algunos investigadores de dichas instituciones.. 33.

(40) 4.1.4 Procesamiento de las muestras. Cinco gramos del material colectado de cada árbol (flores, hojas, corteza y suelo con restos vegetales) estos se cortaron en trozos pequeños y se suspendieron bajo condiciones de esterilidad en 20 ml de agua destilada estéril, se agitaron fuertemente por dos minutos y se dejaron 15 minutos en reposo. Del sobrenadante se tomaron 0.5 ml y se sembraron en placas con medio de agar Guizotia abyssinica ( Paliwal DK,1978), se incubaron a 26 C por siete días, los cultivos se revisaron cada 24 horas hasta detectar colonias de color café brillantes.. 4.2 PURIFICACION DE LAS CEPAS. Todas las cepas sospechosas de corresponder a Cryptococcus sp. previa identificación macroscópica y microscópica de las colonias se sembraron por estría cruzada, en el medio de agar dextrosa Sabouraud (SDA) para su purificación. La pureza de cada una de las cepas se verificó mediante una preparación en fresco con agua destilada estéril y tinción de Gram para detectar contaminación bacteriana.. Las cepas contaminadas fueron purificadas nuevamente por estría cruzada en placas de SDA; las cepas puras fueron resembradas en tubos con medio inclinado SDA, para realizar pruebas de identificación.. 34.

(41) 4.3 IDENTIFICACION. A partir de las cepas aisladas se realizaron las siguientes pruebas de identificación:. 4.3.1 IDENTIFICACION MACROSCOPICA Y MICROSCOPICA. 4.3.1.1 Presencia de pigmento café en el medio agar Guizotia abyssinica (Medio niger). Se procedió a la observación macroscópica de las colonias levaduriformes para su identificación. Las colonias con pigmento café se consideraron como C. neoformans. las colonias con escaso pigmento o nula pigmentación y cápsula se consideraron como Cryptococcus sp. Se consideró el aspecto de la colonia (mucoide, brillante, lisa, convexa, etc. Tanto las colonias que presentaron una pigmentación café así como las colonias con escasa o nula pigmentación fueron purificadas, para efectuar su posterior identificación mediante pruebas bioquímicas y crecimiento a 37ºC.. 4.3.1.2 Presencia de cápsula (Tinción negativa con tinta china). La identificación microscópica de las colonias se efectuó bajo la prueba micológica consistente en realizar examen en fresco con tinta china.. El examen en fresco consistió en tomar una gota de tinta china diluida en dos gotas de agua destilada (proporción 1:2) y agregar una pequeña asada de cada una de las colonias levaduriformes identificadas anteriormente en el medio de niger. Posteriormente se observó al microscopio para demostrar la presencia de levaduras redondas o ligeramente ovaladas, rodeadas por una gran o a veces muy poco conspicua cápsula polisacárida; las levaduras pueden observarse uni o multigemando.. 35.

(42) 4.3.2 PRUEBAS BIOQUIMICAS Y FISIOLOGICAS. 4.3.2.1 Hidrólisis de urea (Producción de ureasas). Para la realización de está prueba se utilizó el medio de agar urea de Christensen.. A partir de colonias jóvenes con 48 ó 72 horas de cultivo en el medio de SDA, se tomó una muestra abundante del cultivo, se sembró directamente en el medio de urea en tubos por duplicado; se incubaron los tubos inoculandos a 37ºC junto con un testigo positivo y uno negativo.. El medio de urea contienen rojo fenol el cual es indicador de la reacción alcalina en presencia de ureasas. Como consecuencia de la hidrólisis de la urea se produce amoníaco. La prueba se da como positiva si el medio vira de un anaranjado pálido a rosa magenta.. 4.3.2.3 Crecimiento a 37º C. Esta prueba se realizó para determinar si las cepas aisladas eran capaces de presentar termotolerancia y por lo tanto crecer a 37º C y ser patógenas.. A partir de colonias de 48 ó 72 hrs de cultivó, se tomó una asada, la cual fué sembrada en medio inclinado de SDA. Posteriormente se colocaron en una estufa sometiendo a cada una de las cepas aisladas a crecer a 37º C. Después de un período de 3 a 7 días se observó si la cepas presentaron o no crecimiento. El crecimiento se registró en escaso (+), moderado (++), y abundante (+++).. 36.

(43) 4.3.2.4 Asimilación de fuentes de carbono ( API 20 C). Todas las cepas que presentaron positividad en las pruebas de hidrólisis de urea, presencia de cápsula, crecimiento a 37º C, presencia de pigmento café o escasa pigmentación en medio niger (cepas caracterizadas como C. neoformans o como probables especies de Cryptococcus. de importancia médica), se. sometieron a las pruebas de asimilación de azúcares mediante API 20 C. *** Preparación del inóculo. A partir de colonias puras de 48 ó 72 horas de crecimiento se preparó una suspensión con una turbidez igual al tubo no. 2 del nefelómetro de Mc Farland de la siguiente manera: usando una pipeta se removió una porción de la colonia y se agitó en 2 ml de agua destilada estéril.. Posteriormente se transfieren 100 ul de la suspensión previa a una ampolleta de C Medium. Se homogenizan gentilmente evitando la formación de burbuja.. *** Inoculación en las galerías. Con una pipeta Pasteur, se inoculó cada tubo, colocando la pipeta a un lado de la cúpula, evitando la formación de burbujas. Los primeros ocho tubos(Glucosa, Galactosa, Maltosa, Sacarosa, Lactosa, Rafinosa, Trealosa, Melibiosa) se llenaron con la suspensión, la cúpula se llenó con aceite mineral. Los tubos restantes (control, glucosa, galactosa, maltosa, sacarosa, rafinosa, trealosa, melibiosa, celobiosa, lactosa y actidione) se llenaron completamente tubos y cúpulas con la suspensión. Se incubaron a 30º C o a 37º C.. 37.

(44) ***. Lectura de las galerías Después de 24 horas de incubación se registro una primera lectura en la. hoja de trabajo. Los resultados para ACT fueron leídos después de 24 horas.. Si las otras pruebas no son claras , la glucosa en particular, se reincubaron por un segundo periodo de 24 horas. Se tomó una lectura final y se registraron los resultados.. La prueba se consideró como positiva si se observaba un cambio de color, en los primeros ocho tubos de púrpura a amarillo. En los tubos restantes si se observaba una turbidez mayor a la del tubo control.. 4.4 DETERMINACION DE LA VARIEDAD. 4.4.1 Medio de Canavanina Glicina-azul de bromotimol (CGB). Se tomó una muestra abundante de cultivo y se extendió sobre la superficie del agar CGB en una área aproximada de 1 cm de diámetro. Posteriormente las cajas inoculadas a 37º C, junto con un testigo positivo y uno negativo. Se leyeron los resultados de la prueba a las 24, 48 y 72 horas de incubación.. Una prueba positiva se da por el cambio en la coloración del medio verde amarillento a azul cobalto alrededor de la colonia (34). 4.4.2 Asimilación de D- prolina. Esta prueba se llevó a cabo colocando un disco de papel impregnado con D- prolina (20%) en la superficie de una placa conteniendo base carbonada de levadura en la que se había sembrado 48 horas antes la cepa a determinar (37).. 38.

(45) 5. RESULTADOS. De los 135 árboles evaluados se identificaron 85 como Eucalyptus camaldulensis y 50 como Eucalyptus tereriticornis, se recuperaron 540 levaduras de muestras de flores, hojas,. corteza y suelo con restos vegetales, con un. promedio de 3 levaduras por árbol, árboles,. fueron. purificadas. e. 87 (16.11%) de ellas procedentes de 55. identificadas. como. especies. del. género. Cryptococcus, de las cuales el 1.48% corresponde a Cryptococcus neoformans, 4.25% a Criyptococcus albidus, 2.77% a Cryptococcus laurentii, 1.85% a Cryptococcus uniguttulatus, 0.92% a Criyptococcus terreus, y el restante 4.81% a Cryptococcus sp.(Cuadro 8 ). Tomando en cuenta las zonas estudiadas y la especie de Eucalyptus camaldulensis, se tomaron muestras de cada uno de los sustratos (flores, hojas, corteza y suelo con restos vegetales); 29 muestras del Eje. Central Lázaro. Cárdenas, 35 de Calzada Vallejo y 21 de Avenida Cuitlahuac, con un total de muestras de 116, 140 y 84 respectivamente, por lo que respecta a Eucalyptus tereriticornis , se tomaron en cuenta 16 muestras del Eje Central Lázaro Cárdenas, 14 de Calzada Vallejo y 20 de Avenida Cuitlahuac con un total de 64, 56 y 80 respectivamente.. El mayor porcentaje de aislamientos de Cryptococcus neoformans var. gattii. se obtuvo en muestras de Eucalyptus camaldulensis. ( 8 cepas) , 6 de. árboles localizados en el Eje Central Lázaro Cárdenas, siendo una de corteza, 3 de hojas y dos de flores, de la Calzada Vallejo se obtuvo 1 cepa de suelo con restos vegetales y de la Avenida Cuitlahuac 1 de corteza (Cuadro 9).. Cryptococcus albidus se aisló un 4.25 % a partir de árboles de Eucalyptus (Cuadro 8) del cual 2.40 % se aisló de Eucalyptus camaldulensis (13 cepas) 6 de árboles localizados en el Eje Central Lázaro Cárdenas, siendo 4 de hojas y 2 de flores, de la Calzada Vallejo se obtuvieron 7 cepas : una de suelo con restos. 39.

(46) vegetales,2 de corteza y 4 de flores (Cuadro 10). C. albidus se aisló en un 1.85% de Eucalyptus tereriticornis (10 cepas) 4 de árboles localizados en la Calzada Vallejo: 1 de suelo con restos vegetales y 3 de flores, de Avenida Cuitlahuac se aislaron 6 cepas: 1 de suelo con restos vegetales, 1 de corteza, 1 de hojas y 3 de flores (Cuadro 11).. Cryptococcus laurentii se aisló un 2.77 % de árboles de Eucalyptus (Cuadro 8) del cual 1.11 % se aisló de Eucalyptus camaldulensis (6 cepas) 2 de Calzada Vallejo siendo 1 de hojas y de flores, 4 de Avenida Cuitlahuac: 1 de suelo con restos vegetales, 1 de hojas y 2 de flores (Cuadro 12 ). Esta misma especie se aisló en 1.66 % de Eucalyptus tereriticornis (9 cepas) 5 de Calzada Vallejo siendo 2 de hojas y 3 de flores, en Avenida Cuitlahuac se recuperaron 4 cepas : 1 de suelo con restos vegetales y 3 de flores.(Cuadro 13).. Cryiptococcus uniguttulatus se aisló un 1.85 % de árboles de Eucalyptus del cual 1.29 % se recuperó Eucalyptus camaldulensis (7 cepas) 5 de Calzada Vallejo siendo 1 de hojas y 4 de flores, de Avenida Cuitlahuac se aislaron 2:1 de suelo con restos vegetales y 1 de flores(Cuadro 14). C. uniguttulatus se aisló en 0.56% de Eucalyptus tereriticornis (3 cepas) 2 de Calzada Vallejo siendo 1 de corteza y 1 de hojas, 1 de suello con restos vegetales en Avenida Cuitlahuac (Cuadro 15).. Cryiptococcus terreus se aisló en 0.92 % de árboles de Eucalyptus del cual 0.37 % se aisló a partir de Eucalyptus camaldulensis: 2 cepas de Calzada Vallejo, 1 de suelo con restos vegetales y 1 de corteza ( Cuadro 16).Esta especie se aisló en un 0.55%. de Eucalyptus tereriticornis (3 cepas) 2 correspondieron al Eje. Central Lázaro Cárdenas: 1 de hojas y 1 de flores y en Avenida Cuitlahuac se aisló una de hojas. ( Cuadro 17).. Otras especies de Cryptococcus se aislaron en un 4.81 % de árboles de Eucalyptus del cual 2.03 % fue a partir de Eucalyptus camaldulensis (12 cepas) 7. 40.

(47) de Calzada Vallejo siendo 2 de corteza, 3 de hojas y 2 de flores, 5 de Avenida Cuitlahuac: 1 de corteza,1 de hojas y 3 de flores (Cuadro 18). Cryptococcus sp. se aisló en 2.59 % de Eucalyptus tereriticornis (14 cepas) 7 de Calzada Vallejo siendo 2 de suelo con restos vegetales, 1 de hojas y 4 de flores, en Avenida Cuitlahuac 7 cepas : 1 de corteza, 4 de hojas y 2 de flores (Cuadro 19).. El proceso para separar en las placas de cultivo las colonias levaduriformes sospechosas de corresponder a especies de Cryptococcus de hongos y bacterias contaminantes fue efectivo en 87 cepas, la persistencia de contaminantes y el pequeño tamaño de algunas colonias levaduriformes impidieron la purificación de algunas de estas cepas. Se encontró la persistencia de hongos contaminantes en mayor proporción mucorales deuteromicetes como Penicillium sp., Aspergillius sp., Fusarium sp.,Cladosporium sp., Alternaria sp., así como levaduras blancas y Rhodotorula sp.. En el cultivo, una pigmentación típica marrón y la presencia de levaduras capsuladas indicó que pertenecían. muy probablemente a Cryptococcus. neoformans, sin embargo en 3 cepas no se llegó a su identificación hasta especie en la cual solo se hicieron pruebas presuntivas.. Las cepas de Cryptococcus neoformans, así como de otras especies de Cryptococcus fueron resembradas en SDA e incubadas por 7 días. a 280 C,. después de este período mostraron dos tipos de morfología colonial: la primera denominada típica, por ser blancas y mucoides o semimucoide con escurrimiento hacia el fondo del tubo; y la segunda atípica, con colonias blancas y cremosas que al pasar el tiempo se tornaban amarillentas.. La observación de la morfología microscópica de las 87 cepas estudiadas, mostró células levaduriforme de tamaño variable, redondas en su mayoría y en ocasiones ovaladas, monogemantes y multigemantes, caracteristicas del género Cryptococcus.. 41.

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 PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE LOS SEROTIPOS DE CUADRO  2 C. neoformans
PRINCIPALES DIFERENCIAS ENTRE LOS SEROTIPOS DE CUADRO 2 C. neoformans p.29
CUADRO 5 ASIMILACION DE FUENTES DE CARBONO POR ALGUNAS ESPECIES DEL

CUADRO 5

ASIMILACION DE FUENTES DE CARBONO POR ALGUNAS ESPECIES DEL p.32
CUADRO  6 DISTRIBUCION GEOGRAFICA DE LOS SEROTIPOS DE C. neoformans.

CUADRO 6

DISTRIBUCION GEOGRAFICA DE LOS SEROTIPOS DE C. neoformans. p.33
Cuadro 8 : Frecuencia relativa de aislamientos de Crytococcus sp.  en 540 muestras de árboles de Eucalyptus

Cuadro 8 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Crytococcus sp. en 540 muestras de árboles de Eucalyptus p.51
Cuadro 9 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus neoformans gattii  var

Cuadro 9 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus neoformans gattii var p.52
Cuadro 11 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus albidus en

Cuadro 11 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus albidus en p.53
Cuadro 10 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus albidus en

Cuadro 10 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus albidus en p.53
Cuadro 12  : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus laurentii en

Cuadro 12 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus laurentii en p.54
Cuadro 13  : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus laurentii en

Cuadro 13 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus laurentii en p.54
Cuadro 15 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus uniguttulatus en

Cuadro 15 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus uniguttulatus en p.55
Cuadro 16 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus terreus en

Cuadro 16 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus terreus en p.56
Cuadro 17 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus terreus en

Cuadro 17 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus terreus en p.56
Cuadro 18  : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus sp. en

Cuadro 18 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus sp. en p.57
Cuadro 19 : Frecuencia  relativa de aislamientos de Cryptococcus sp.  en

Cuadro 19 :

Frecuencia relativa de aislamientos de Cryptococcus sp. en p.57
CUADRO 20  :  PRUEBAS MORFOLOGICAS Y FISIOLOGICAS DETERMINANTES EN LA IDENTIFICACION DE ESPECIES DE Cryptococcus

CUADRO 20 :

PRUEBAS MORFOLOGICAS Y FISIOLOGICAS DETERMINANTES EN LA IDENTIFICACION DE ESPECIES DE Cryptococcus p.58

Referencias

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