BRUCELLA ABORTUS: ANTECEDENTES Y AVANCES EN ASPECTOS
DE PATOGENESIS, DIAGNÓSTICO Y CONTROL
DORIS MARCELA VEGA MEDELLIN
TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial
Para optar al título de
MICROBIOLOGA AGRÍCOLA Y VETERINARIA
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA Y VETERINARIA Bogotá, D.C.
NOTA DE ADEVERTENCIA
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946
BRUCELLA ABORTUS: ANTECEDENTES Y AVANCES EN ASPECTOS DE PATOGÉNESIS, DIAGNÓSTICO Y CONTROL
DORIS MARCELA VEGA MEDELLIN
APROBADO
---Gustavo Arbelaez M.V.Z., MSc, PhD. Director
BRUCELLA ABORTUS: ANTECEDENTES Y AVANCES EN ASPECTOS DE PATOGÉNESIS, DIAGNÓSTICO Y CONTROL
DORIS MARCELA VEGA MEDELLIN
APROBADO
DEDICATORIA
Este trabajo se lo dedico a mis padres Flavio Vega Barrera y Doris Medellín Torres que con todas sus virtudes y valores, con mucho esfuerzo, empeño, amor, paciencia, dedicación y por supuesto de la mano de Dios han guiado mis pasos para hacer de mi una mejor persona. Gracias a ellos ahora empezaré a dar mis primeros pasos como un nuevo profesional dispuesto al servicio de los demás.
De la misma forma se lo dedico a todos aquellos que con sus conocimientos y su voz de aliento me ayudaron a terminarlo y por supuesto a Dios que fue quien puso en mi corazón realizar éste trabajo y me iluminó llenando mi mente y espíritu de fuerza y sabiduría.
“El labrador, para participar de los frutos, debe trabajar primero”
TABLA DE CONTENIDOS
Pag.
1. Introducción. 8
2. Justificación. 9
3. Objetivos. 9
3.1 Objetivo General. 9
3.2 Objetivos Específicos. 10
4. Historia de la Enfermedad. 10
5. Evolución y Taxonomía. 13 6. Anatomía Microscópica y Composición Química. 17
7. Genética. 21
8. Patogenicidad. 25
9. Respuesta Inmune. 31
9.1 Respuesta Inmune Innata. 32
9.2 Respuesta Inmune Específica. 35
10. Resistencia y Supervivencia. 39
11. Brucelosis En el Humano. 40
12. Transmisión de la Brucelosis Bovina. 45
12.1 Infección de un Establecimiento. 46
12.2 Latencia. 47
12.3 Eliminación del Agente al Medio. 47
12.4 Difusión y Permanencia de la enfermedad en el Rebaño. 48
12.5 Patogenia. 48
13. Vacunas Contra la Brucelosis Bovina. 49
14. Diagnóstico de la Enfermedad. 56
15. Estado de la Brucelosis Bovina en Algunos Países del Mundo. 68
15.1 Brucelosis Bovina en Colombia. 68
15.2 Brucelosis Bovina en Estados Unidos. 69
15.3 Brucelosis Bovina en México. 71
15.4 Brucelosis Bovina en América Central. 75
15.5 Brucelosis Bovina en Venezuela. 77
15.6 Brucelosis Bovina en Chile. 79
15.7 Brucelosis Bovina en Brasil. 79
15.8 Brucelosis Bovina en Paraguay. 81
15.9 Brucelosis Bovina en Argentina. 82
15.10 Brucelosis Bovina en la Unión Europea. 83
16. Conclusiones. 84
17. Recomendaciones. 85
RESUMEN
En el presente trabajo, Se realizó una revisión bibliográfica con descripciones detalladas de las características morfológicas y fisiológicas del género Brucella, enfatizando en Brucella abortus. De la misma forma se profundizó sobre los mecanismos de patogenicidad, virulencia, supervivencia en el huésped, aspectos zoonóticos y los diversos síntomas que produce en el animal. También demuestra la situación actual de algunos países que la presentan y los que ya la han erradicado. Se hicieron descripciones detalladas de las dos vacunas utilizadas contra Brucella abortus (cepa 19 y RB51) teniendo en cuenta sus características, efectos que producen en el animal, modos adecuados de uso y las interferencias que se ocasionan con el uso inadecuado de estas vacunas en el diagnóstico de la brucelosis bovina. Por lo que se pudo concluir, de acuerdo al análisis de la revisión bibliográfica, que la vacuna RB51 además de proporcionar un efecto protector similar al que induce la cepa 19, por las características que presenta, no interfiere con los resultados de las pruebas diagnósticas de la enfermedad y no tiene efectos secundarios en el animal, inconveniente que se ha presentado con la vacuna cepa 19.
1. Introducción.
La brucelosis es una enfermedad infecciosa aguda de etiología bacteriana producida por microorganismos del género Brucella. Existen seis especies de Brucella que están asociadas a varios huéspedes principales, B. abortus al ganado bovino, B. melitensis al caprino, B. suis a los porcinos, B. canis a los caninos y B. neotomae a roedores salvajes, recientemente Brucella maris asociada a mamíferos marinos. Esta se localiza principalmente en los órganos del tracto genital en el que producen abortos en las hembras y orquitis y epididimitis en los machos, procesos que todos ellos, pueden ser causa de esterilidad permanente, por lo que la repercusión socioeconómica de la brucelosis es grande en los países que no la han erradicado. En el hombre la enfermedad se conoce como fiebre ondulante, enfermedad grave que los incapacita físicamente y puede volverse crónica para producir una invalidez permanente. El hombre la contrae por contacto directo, durante el manejo de animales, o por ingestión de productos lácteos frescos contaminados.
A pesar de los esfuerzos que se están haciendo desde hace mucho tiempo para controlar y erradicar la brucelosis, esta infección sigue siendo una zoonosis importante en el mundo entero. Su persistencia se puede atribuir a la diversidad existente en el género Brucella; a la gran variedad y a la distribución geográfica de los animales sensibles; y a la supervivencia y a los mecanismos de transporte de un hospedador a otro que presentan estas bacterias.
El presente trabajo tiene como objeto recopilar las últimas investigaciones realizadas sobre la patogenicidad, factores de virulencia y en general todos los mecanismos que utiliza Brucella abortus para invadir a su huésped, además, de los avances realizados por distintos investigadores en otras posibles vacunas y en la eficiencia de las ya existentes y en los últimos métodos de diagnóstico utilizados con el fin de capacitar a los ganaderos, técnicos, médicos veterinarios y microbiólogos para reducir progresivamente la existencia de fuentes de infección y mejorar el proyecto de Prevención y Control de la Brucelosis bovina para disminuir de la misma forma la frecuencia de su presentación hasta alcanzar las condiciones adecuadas para su erradicación en los países que todavía se ven afectados por dicha enfermedad.
2. Justificación
Debido a que la brucelosis bovina es una enfermedad zoonótica y que además representa grandes pérdidas económicas por los efectos que esta produce en el sector agropecuario en los países donde no ha sido erradicada, es fundamental conocer los últimos avances científicos sobre el tema, para contribuir a que las autoridades gubernamentales encargadas de la sanidad animal perfeccionen los proyectos de prevención y control de la brucelosis bovina y la utilización de un diagnóstico confiable para la determinación de la situación real, el establecimiento de hatos y áreas libres de la enfermedad y la disminución del riesgo de la enfermedad para el humano.
3. Objetivos 3.1 Objetivo General.
3.2 Objetivos Específicos.
Determinar cual de las cepas utilizadas como vacuna (cepa19 o RB51) es más eficiente sin que interfiera en el diagnóstico de la brucelosis bovina.
Comparar las diferentes técnicas de diagnóstico utilizadas para Brucella abortus con el fin de identificar la más efectiva y confiable para facilitar la certificación de hatos libres.
Identificar los parámetros que interfieren en el buen diagnóstico de la brucelosis bovina para contribuir en el análisis de los resultados para que estos sean confiables.
4. Historia de la Enfermedad
Uno de los primeros registros que existen para llegar a conocer hoy en día la enfermedad conocida como brucelosis, fue una enfermedad que afectó la guerra de Crimea y los marineros a bordo de las naves. La Brucelosis entonces llamada fiebre de malta fue una enfermedad crónica debilitante con la complicación de reumatismo, por lo que muchos marineros fueron invalidados cada año (Wyatt, 1999).
El capitán David Bruce fue enviado a Malta y condujo una investigación a partir de 1884. El aisló un agente llamado Micrococcus melitensis de bazos humanos de pacientes hospitalizados que habían consumido leche de cabra cruda. En 1905 se formó la Comisión Fiebre del Mediterráneo y varios miembros de esta comisión realizaron pruebas serológicas en cabras y encontraron aglutininas en el 50% de los animales. También se aisló la bacteria de la sangre y de la leche en por lo menos el 10% de las cabras.
alto en bovinos en la primera parte del siglo 20, pues el aborto contagioso fue reconocido junto con la tuberculosis como causa seria de pérdidas económicas. La Oficina de Industria Animal (BAI) jugó un papel importante en la investigación sobre brucelosis en bovinos y porcinos y en el desarrollo de programas de erradicación. La investigación fue activa en pruebas diagnósticas y vacunas. Varios comités y organizaciones consideraron el nombre de la enfermedad, asuntos de investigación, uniformidad de los métodos de prueba y control de metodologías. Antes de 1922, varios estados habían dictado leyes y regulaciones en tentativa de prevenir la introducción de la enfermedad en los bovinos comprados de otros estados.
En 1930, el nombre de la enfermedad fue cambiado de aborto infeccioso de los bóvidos a la enfermedad de Bang. Las preocupaciones crecían sobre la relación entre la enfermedad en animales y los seres humanos. Un comité de la Asociación Medica Veterinaria de América recomendó una vacuna que fue desarrollada a partir de una cepa de baja virulencia llamada B. abortus cepa 19. Esta vacuna se ha utilizado por décadas como el principal agente inmunizante para el control de la brucelosis bovina. Se ha estudiado en una variedad de dosis y de métodos de administración.
En 1934, un programa cooperativo de Erradicación de Brucelosis en Estados Unidos fue lanzado a nivel nacional como parte de un programa de emergencia para la reducción de la enfermedad en bovinos con previo análisis de sangre, el sacrificio de ganados seropositivos, e indemnizaciones federales. Sin embargo se presentaron muchos problemas incluyendo la estandarización de procedimientos para las pruebas. En 1941, la cepa 19 fue introducida y utilizada en más estados y todo el ganado vacunado era correctamente identificado.
En 1952, la prueba de anillo en leche fue introducido en el programa, siendo el principal método de vigilancia en ganados lecheros con posible brucelosis. Sin embargo surgieron muchas dudas acerca del programa, dando como resultado una comisión especial, la cual recomendó muchos cambios en el programa.
Desde ese entonces el género incluye seis especies, cada una de ellas muestra una preferencia por un huésped determinado aunque una especie puede infectar varias especies animales, así se tiene que: B. abortus infecta normalmente al ganado bovino, B. melitensis afecta cabras y ovejas, B. suis a cerdos, B. canis infecta perros, B. ovis causa infección específicamente a ovejas y B. neotomae a roedores. El hombre es susceptible a cualquiera de las cuatro primeras especies, ya que se considera que B. ovis y B. neotomae poseen una baja virulencia que las restringe solo a ciertos huéspedes.
En años recientes, el espectro de huéspedes de Brucella se ha ampliado al incluir los mamíferos marinos. Se han realizado aislamientos de Brucella a partir de una gran variedad de focas, leones marinos, delfines y ballenas, en las costas de diferentes continentes. Estas cepas, claramente forman un grupo separado al que, de modo no oficial, han denominado B. maris. Dentro del grupo se distinguen dos tipos: el formado por cepas provenientes de cetáceos y el de las cepas aisladas provenientes de pinnípedos. Por lo que actualmente se conocen como B. cetaceae y B. pinnipediae (López & Contreras, 2004).
Es importante recordar que la brucelosis es una verdadera zoonosis y el estímulo para su erradicación es primordial para la salud pública. Casi todos los casos de brucelosis en humanos, tienen origen animal y, por lo tanto, el control es sobre todo una responsabilidad veterinaria (Nicoletti, 2002).
Las investigaciones futuras estarán dirigidas al mejoramiento de métodos de diagnóstico, inmunización y tratamientos. Sin embargo, los factores extrínsecos e intrínsecos relacionados con la brucelosis humana y animal y su control seguirán siendo obstáculos en la continua evolución de la historia de la brucelosis (Nicoletti, 2002).
5. Evolución y Taxonomía
Existe una controversia acerca de la taxonomía interna del género Brucella y se ha propuesto que el concepto genómico de especies, basado en la hibridación DNA-DNA pueda ser aplicado para este género. De acuerdo con este concepto, solo es reconocida una especie, Brucella melitensis y las especies clásicas son consideradas como biovares (B. melitensis biovar melitensis; B. melitensis biovar abortus; etc.). Sin embargo, una nueva estimación crítica del concepto de especie, una revisión de la estructura de la bacteria y el análisis de la diversidad genética de Brucella por otros métodos, con excepción de hibridación DNA-DNA, demuestran que no hay argumentos científicos para aplicar el concepto genómico de especies a este género (Moreno, Cloeckaert & Moriyón, 2002). Por otra parte un concepto biológico amplio de especie, permite la definición de las especies de Brucella, siendo consistentes con análisis moleculares y apoyando la situación taxonómica de la mayoría de las especies clásicas. El rango de hospederos como criterio biológico ampliamente reconocido y la presencia de los marcadores específicos de la especie en genes externos de la proteína de la membrana y en otros genes, demuestran que B. melitensis, B. abortus, B. ovis, B. canis y B. neotomae no son solo patovares sino
especies biológicamente significativas (Moreno, Cloeckaert & Moriyón, 2002).
estableció satisfactoriamente en los años 20, mucho antes de que la filogenia y la posición taxonómica verdadera del grupo fuera conocida (Meyer, 1990). En esta misma línea de ideas, una característica de muchas brucelas es que ellas exhiben una marcada pero no absolutamente estricta gama de hospederos. Esto se demuestra no solamente como preferencia por una especie animal dada sino también por la observación de que cuando ocurren infecciones cruzadas entre diferentes especies animales, la bacteria es rara vez perpetuada en los huéspedes secundarios una vez el huésped primario es removido (Alton, 1990; Blasco 1990; Carmichael, 1990; Crawford et al., 1990; Meyer, 1990). Así, las especies clásicas de Brucella exhiben una marcada gama de hospederos (B. melitensis para ovejas y cabras; B. abortus para bovinos, B. canis para perros y por lo que se sabe B. neotomae para ratas de madera del desierto). Estas bacterias constituyen un grupo evolutivo genéticamente ligado a sus huéspedes preferidos; sin embargo, una excepción notable es B. suis, puesto que el rango de hospederos parece ser una característica de los biovares (1 y 2 para cerdos; 2 para cerdos y liebres; 4 para renos; 5 para roedores salvajes) más que de la especie (Alton et al., 1988).
Los resultados descritos anteriormente apoyan la validez de la gama del hospedero como criterio taxonómico para definir las especies de Brucella y, por lo tanto, confirman la situación taxonómica verdadera de B. melitensis, B. abortus, B. neotomae, B. ovis y B. canis. Sin embargo, parece que la situación no está tan clara
de fingerprinting IS711 para los biovares de algunas especies clásicas, y no es tan claro si este criterio molecular es útil para la separación de las especies. De hecho, puede ser que exista un rango más estrecho de hospederos que el sugerido por los estudios del locus omp2. Parece que este punto no puede ser solucionado actualmente sin un mejor conocimiento de la biología de las brucelas de mamíferos marinos y por lo menos su epidemiología y modo de transmisión para determinar en qué medida los grupos definidos por los análisis moleculares constituyen grupos evolutivos comprometidos genéticamente similares a los definidos para las brucelas de mamíferos terrestres.
Por todo lo anterior, el criterio clásico del rango de hospederos para definir las especies de Brucella es válido siendo respaldado por los resultados moleculares y evolutivos y se requiere de más información genética y evolutiva antes de adoptar cambios en la nomenclatura clásica de Brucella. Probablemente estas herramientas y conceptos también serán útiles para definir especie y para entender la biología de las brucelas aisladas de mamíferos marinos.
6. Anatomía Microscópica y Composición Química
Brucella es un cocobacilo Gram negativo, sin motilidad, sin esporulación y no
fermentador.
La anatomía microscópica de Brucella es sustancialmente semejante a la estructura clásica de las bacterias Gram negativas. Al microscopio electrónico se distinguen, de fuera hacia dentro: la envoltura celular, integrada por la membrana externa, el espacio periplásmico y la membrana citoplasmática que rodea al citoplasma.
ligadura covalente, esto le proporciona una mayor estabilidad. La lipoproteína de Brucella es estructuralmente semejante a la lipoproteína de Braun de E. coli y existe cruce serológico entre ellas. Existen otras proteínas asociadas al peptidoglicano en forma no covalente. Las proteínas llamadas porinas funcionan como canales transmembranales, que permiten la difusión de compuestos entre ciertos límites de peso molecular (límite de exclusión).
La membrana externa, constituye la barrera física y funcional entre el interior de la célula bacteriana y su medio, además de ser, la primera estructura que entra en contacto con las células del sistema inmunológico del huésped, durante los estadios tempranos de la enfermedad, ya que no se han descrito componentes capsulares en Brucella. Por otro lado, la supervivencia de la bacteria ya sea en el medio ambiente o
en el huésped, depende de la integridad de su membrana externa ya que si ésta sufriera algún daño, la bacteria no sobreviviría por mucho tiempo.
De los constituyentes de la membrana externa (ME) de Brucella, el mas estudiado ha sido el lipopolisacárido (LPS) por ser el mas externo, abundante y antigénico, se le conoce también como endotoxina. Sus propiedades bioquímicas y biológicas son diferentes a las del resto de bacterias Gram negativas, especialmente en cuanto al contenido de ácidos grasos del lípido A. La endotoxina de Brucella presenta baja actividad endotóxica aunque conserva sus propiedades inmunogénicas.
Las cepas de B. melitensis, B. abortus, B. suis y las brucelas marinas en fase lisa (S), poseen el S-LPS que está constituido de un lípido A, formado de diferentes ácidos grasos; una región central (núcleo) que contiene el ácido 2-ceto 3-desoxioctulosónico, glucosa, manosa y quinovosamina; y una cadena O, proyectada hacia el exterior de la ME, constituida de un homopolímero de alrededor de 100 unidades de 4-formamido-4,6-didesoximanosa (perosamina). Las cepas con epitopo A dominante (B. abortus bv. 1) contienen un polímero de cinco perosaminas unidas por ligadura a-1,2 y con
epitopo del LPS, así el tipo A dominante tiene forma de barra mientras que el tipo M dominante es retorcido (rizado).
Esta semejanza estructural tiene gran importancia práctica, ya que, al inocular una cepa de B. abortus en un animal de experimentación, el antisuero obtenido, reaccionará principalmente con cepas A dominante, con A/M y en menor grado con M dominante, lo que significa que, reaccionará en diferente magnitud, con todas las especies de Brucella en fase lisa (B. abortus, B. suis y B. melitensis), a menos que el antisuero sea adsorbido con suspensiones de B. melitensis para eliminar los epitopos M y obtener un suero A monoespecífico. En consecuencia, lo mismo sucedería al inocular cualquier cepa de Brucella.
La presencia de moléculas de perosamina en el LPS de algunas bacterias Gram negativas, es responsable de la actividad antigénica cruzada que se observa con: Escherichia hermanni y E. coli O:157, Salmonella O:30, Stenotrophomonas maltophilia, Francisella tularensis y Vibrio cholerae O:1. Yersinia enterocolitica O:9, contiene una cadena O casi idéntica a la de B. abortus así como algún determinante M. Este hecho debe tomarse muy en cuenta al realizar el diagnóstico por métodos serológicos, ya que con frecuencia se cometen errores y no se llega a establecer un buen diagnóstico diferencial, se trate de animales o de humanos.
La estructura del LPS de cepas rugosas (R-LPS), es básicamente similar al S-LPS, excepto por la cadena O, que está ausente o reducida a unos pocos residuos. Por lo que, la especificidad del R-LPS estará determinada por el polisacárido del núcleo. La falta de cadena O modifica la superficie bacteriana de tal modo que las brucelas no forman suspensiones estables y autoaglutinan.
Las proteínas de membrana externa (OMPs) son de gran interés porque las han relacionado con la protección. Las que primero se describieron fueron las proteínas mayores de 25-27, de 31-34 y de 36-38 kDa. Las que, posteriormente, formaron los grupos 3 (25-27) y 2 (36-38). Las proteínas del grupo 2 fueron identificadas como porinas; a las del grupo 3, se les consideró equivalentes a las OmpA de E.coli, con base en su similitud en la composición de aminoácidos y a su relación antigénica. El grupo 1 lo formaron proteínas con pesos moleculares de 88 a 94 kDa, cuya concentración fue menor a la de los otros grupos. En la actualidad, como resultado de la clonación y secuenciación de los genes que codifican para estas Omps, se les ha ido asignando otra nomenclatura: Omp25 , Omp31 y Omp2b. Otras Omps han sido, posteriormente identificadas por medio de anticuerpos monoclonales, por ser menos abundantes, se denominan proteínas menores y presentan masas moleculares de 10,16.5, 19 y 89 kDa. Con base en estudios genéticos y de su secuencia de aminoácidos, las de 10, 16.5 y 19 kDa, se han identificado como lipoproteínas de membrana externa, denominándolas: Omp10, Omp16 y Omp19, respectivamente. La Omp 16, pertenece a la familia de lipoproteínas asociadas al peptidoglicano presentes en bacterias Gram negativas.
Aparentemente existen proteínas homólogas a las Omp10 y Omp19 en Ochrobactrum anthropi y otras bacterias relacionadas genéticamente a Brucella. La Omp1 de 89 kDa se encuentra expuesta en la superficie de la célula. Finalmente, se ha puesto de manifiesto la existencia de acuaporinas en la ME, que son proteínas transmembranales con canales para agua y que pertenecen a la familia de las proteínas intrínsecas mayores.
(Zygmunt et al., 1994) por lo que las principales Omp no son candidatas interesantes para el serodiagnóstico de brucelosis causada por cepas lisas de Brucella (Cloeckaert et al., 2002).
Otras proteínas han sido descritas: la periplásmica BP26 ; entre las internas se tiene: el componente A2, que es una glicoproteína resistente al calor, empleada en el diagnóstico de bovinos; las de 16 a 18 kDa usadas como antígenos en reacciones intradérmicas; la proteína citoplásmica de 18 kDa, con secuencia descrita.
Numerosas proteínas de membrana externa, interna, periplásmicas y citoplásmicas han sido caracterizadas. Algunas son reconocidas por el sistema inmune, durante la infección y solo se han reportado en Brucella, por lo que serían de gran utilidad en futuras pruebas diagnósticas o para ser consideradas en las nuevas vacunas.
7. Genética.
El género Brucella está constituido de un grupo muy homogéneo de bacterias, puesto de manifiesto por su relación antigénica y por estudios de hibridación DNA-DNA (> 90% de homología para todas las especies). Con base en estos estudios Verger y cols. propusieron que el género estaba constituido por una sola especie, B. melitensis y las otras especies restantes corresponderían a biovares. Sin embargo, la organización clásica del género en seis especies se mantiene por las características de patogenicidad y de preferencia de huésped de cada una de las especies. El análisis de las secuencias del RNA ribosomal 16S permitió ubicar a Brucella en el grupo alfa, subgrupo 2 de las Proteobacterias dentro de la familia Rhizobiaceae. Esta familia incluye bacterias patógenas de plantas y animales como: Agrobacterium, Bartonella y Brucella, bacterias con capacidad para interactuar con células eucarióticas en forma
Hasta hoy no existen evidencias de sistemas de intercambio genético natural entre los miembros del género Brucella. La conjugación no ha sido demostrada, ni tampoco se han encontrado las estructuras asociadas con ella como son los pilis. La transducción se puede llevar a cabo, la resistencia hacia algunos antibióticos se transfiere después de una infección fágica. No se han encontrado plásmidos nativos en Brucella ni a la fecha hay evidencia indirecta de su existencia. Las cepas de Brucella se pueden transformar empleando plásmidos de amplia especificidad derivados de Escherichia coli. Así, la resistencia a tetraciclina ha sido transferida a B. abortus por medio de un
plásmido. La eficacia de transformación fue baja, sin embargo, este antecedente evidencia la posibilidad de que dicho proceso ocurra bajo condiciones naturales. La falta de intercambio de genes a través de bacteriófagos contribuiría a explicar la homogeneidad genética del género.
Bacteriófagos.- Desde 1950, se sabe de la existencia de bacteriófagos de Brucella, el primero que se aisló por ser estable, fue el Tbilisi (Tb). A partir de entonces se han aislado otros con tipos similares. Han sido clasificados en seis grupos, sobre la base de la especificidad de huésped (López & Contreras, 2004).
Todos los fagos de Brucella, hasta ahora estudiados, contienen DNA y pertenecen al grupo Pedoviridae. Todos están íntimamente relacionados y son similares en su morfología general y en la resistencia a agentes físicos y químicos.
La utilidad que se les ha dado es la de emplearlos como un método sencillo para diferenciar las especies de Brucella. Sin embargo, hay poca información disponible en cuanto a la naturaleza de los receptores en la superficie de la célula. La capacidad que presentan las células de Brucella para adsorber bacteriófagos varía entre las diferentes especies y entre las fases coloniales del organismo. Por lo que, probablemente los receptores se ubiquen en alguna proteína (s) asociadas al LPS. A la fecha se ha concluido el análisis de las secuencias de los genomas de B. melitensis M16 y de B. suis y está en proceso la secuenciación de B. abortus. Entre los genes de importancia en la virulencia se pueden mencionar los siguientes:
que es el ChvG/ChvI requerido para la formación de tumores en plantas. Y el homólogo ExoS/ChvI de S. meliloti que regula la producción de succinoglicana, cruciales para el desarrollo de la endosimbiosis (López & Contreras, 2004).
- Región VirB que contiene 12 genes muy similares a los de A. tumefaciens, que es esencial para la multiplicación intracelular y la virulencia en el ratón. Los genes VirB codifican para un sistema de secreción tipo IV ambos genes fueron identificados en B. suis y B. abortus. El sistema de secreción tipo IV, es un factor dominante en la virulencia de Brucella. Los 12 genes de la región forman un operon que es inducido específicamente por la acidificación del fagosoma en células después de la fagocitosis. Se especula que el sistema sirve para secretar moléculas efectoras desconocidas, que permiten que Brucella cambie las rutas endosomicas de la célula huésped y que cree un compartimiento intracelular original en el cual pueda replicarse.
La región virB es esencial para la supervivencia intracelular y multiplicación en B. suis, B. abortus y B. melitensis (O´Callaghan et al., 1999; Sieira et al., 2000; Hong et
al., 2000; Delrue et al., 2001). Se han construido o aislado mutantes en todos los genes de la región y todos han perdido la capacidad de multiplicarse intracelularmente (O´Callghan et al., 1999; Foulongne et al., 2000; Boschiroli et al., 2002). Hong et al. (2000) encontró que mutantes virB de B. abortus son incapaces de establecer infecciones crónicas en el modelo del ratón y resultados similares se obtuvieron en B. suis.
Diferentes estímulos inducen la trascripción de virB. Cuando la bacteria crece en medios mínimos se detecta un mensaje del virB. La trascripción depende de la fase de crecimiento de la bacteria, con inducción máxima en la fase exponencial temprana y bajos niveles de inducción en la fase estacionaria.
que un choque ácido de 3 horas con pH 4 reduce enormemente los niveles de síntesis de proteínas en Brucella, induciendo fuertemente la trascripción del operon virB. La acidificación es esencial para la multiplicación intracelular de B. suis. Si el pH del fagosoma es neutralizado con cloruro de amonio o la acidificación es inhibida con drogas durante las primeras horas después de la infección, la multiplicación de Brucella se bloquea (Porte et al., 1999). Puesto que el choque ácido es una de las
señales in vitro que inducen el virB, se presume que la acidificación del fagosoma es la señal que induce intracelularmente al virB (Boschiroli et al., 2002).
El rol exacto del sistema virB en la virulencia de Brucella sigue siendo confuso. Dos estudios han demostrado que mutantes virB de B. abortus y B. melitensis han perdido su habilidad de modular el tráfico intracelular. Brucella ha demostrado tener la habilidad de modular la ruta endosomal en células HELA y crear un nicho intracelular único en el cual se multiplican (Pizarro-Cerda et al., 2000) además de inhibir la fusión fagosoma-lisosoma de una manera activa (Naroeni et al., 2001). - Proteína BacA, transportador de la membrana citoplasmática que es requerida para mantener la infección crónica en el modelo ratón y para la simbiosis de S. meliloti con alfalfa (Glazebrook et al., 1993; LeVier & Walker, 2001).
- Grupo que contiene 18 genes flagelares, que no se expresan en condiciones normales, ya que Brucella ha sido tradicionalmente inmóvil.
- Gen hfq, requerido para la resistencia al estrés en la fase estacionaria y multiplicación intracelular, importante en la virulencia. En E. coli (Muffler et al., 1997) y S. typhimurium (Brown-Elliott, 1996), hfq codifica una pequeña proteína del RNA conocida como factor del huésped – I (HF- I). Esta proteína facilita la transducción del mRNA que codifica el factor σ alterno RpoS. El RpoS se requiere para la expresión de >50 genes necesarios para hacer la transición en la fisiología de la fase estacionaria en E. coli y S. typhimurium (Loewen et al., 1998).
absolutamente dependiente de la presencia de HF- I es sodC, el gen codifica la Cu-Zn superoxido dismutasa periplásmica. La cual contribuye a la resistencia de la bacteria a la ruta de la muerte oxidativa por los macrófagos. Otro gen que exhibe la expresión dependiente de HF-I en B. abortus durante las fase estacionaria es un gen homólogo del HdeA de E. coli. El HdeA es una proteína periplásmica que tiene actividad chaperona dependiente de bajo pH y se piensa que esta proteína desempeña un papel crítico en la resistencia de éste organismo a las condiciones ácidas (Gajiwala & Burley, 2000). Si el homólogo de HdeA de Brucella realiza una función similar a la de E. coli, entonces potencialmente desempeña un papel importante en permitir que Brucella se adapte al ambiente de bajo pH del compartimiento fagosomal.
- HtrA proteína de choque térmico semejante a proteasas de serina.
Las especies de Brucella deben ser consideradas como poblaciones clonales que han evolucionado en forma independiente para sobrevivir en su correspondiente animal huésped.
La organización del genoma se ha visto que es característica para cada especie de Brucella y que en ciertos genes existe polimorfismo que permite distinguir las seis especies por diferentes procedimientos.
La comparación de los genomas de B. melitensis y B. suis ha definido un grupo de diferencias que podrían ser responsables de la virulencia y preferencia entre estos organismos; las dos especies de brucelas difieren en sólo 74 genes: 42 en B. suis y 32 en B. melitensis exclusivos para cada genoma.
Basados en las semejanzas genómicas y funcionales entre B. suis y organismos del grupo Rhizobium y Agrobacterium parece probable que Brucella haya evolucionado a partir de una bacteria ancestral del suelo asociada a plantas y que especulativamente podría ser metabólicamente activa fuera del huésped mamífero.
8. Patogenicidad
Las especies de Brucella son patógenas intracelulares facultativas, su virulencia está relacionada con la capacidad que poseen para:
- Adherirse, penetrar y multiplicarse en una gran variedad de células eucarióticas, tanto fagocíticas como no fagocíticas.
La localización intracelular las mantiene protegidas de los antibióticos y de factores bactericidas del plasma como complemento y anticuerpos, lo que determina la naturaleza crónica de la infección.
favoreciendo de esta manera que la bacteria se localice finalmente en el retículo endoplásmico. Este mecanismo parece estar regulado por el sistema de secreción tipo IV. Se ha postulado un modelo de tránsito celular empleando células HeLa; una vez fagocitada la bacteria, aparentemente por un proceso de fagocitosis tipo “cremallera”, los eventos, se suceden de la siguiente forma: el fagosoma que contiene la bacteria, interactúa con endosomas tempranos (tanto en células HeLa como en macrófagos peritoneales de ratón) (López & Contreras, 2004).
Este suceso ya había sido observado durante la fagocitosis de Mycobacterium tuberculosis y avium. Después, de una estancia transitoria en los endosomas tempranos, pasa a otro compartimiento, el endosoma tardío, de ahí se dirige a otro compartimiento con características de vesícula autofágica. La autofagia es una vía ampliamente usada para mantener la homeostasis celular. Bajo ciertas circunstancias la célula secuestra organelos o citoplasma en autofagosomas nacientes, que adquieren enzimas degradativas al fusionarse con lisosomas, con lo que se degrada su contenido. Los autofagosomas con brucelas entran a un proceso de maduración, que entre otros eventos produce una acidificación al interior de la misma; las bacterias no se replican en los autofagosomas. Del autofagosoma transita al retículo endoplásmico de las células huésped en donde se replica. Su localización intracelular corresponde al área perinuclear de las células infectadas. La ubicación de Brucella en el RE de la célula huésped, pudiera ser una estrategia que le permitiría obtener metabolitos sintetizados o translocados al RE, en forma de péptidos pequeños, esenciales para su crecimiento.
estímulo ambiental por autofosforilación en un residuo de histidina. El grupo fosforil se transfiere a un residuo de aspartato en la proteína reguladora kinasa, lo cuál genera una cascada de eventos que conducen a factores de transcripción cuya afinidad por secuencias específicas del DNA son moduladas por fosforilación (Stock et al., 1995). Por estos medios, el sistema bacteriano de dos componentes media la respuesta a una variedad de señales físicas y químicas y controla funciones como división celular, fisiología, comunicación, desarrollo, esporulación, respuestas a estrés y virulencia. Bacterias intracelulares facultativas como Brucella deben sobrevivir en diversas condiciones al pasar de ambientes abiertos al medio intracelular de fagocitos profesionales y no profesionales. Para esto, la bacteria debe coordinar una red intrincada de factores para generar una respuesta apropiada a las diversas señales. Por consiguiente, el sistema regulador de dos componentes es necesario para controlar la transición de un ambiente a otro y en consecuencia algunos de ellos también están implicados en virulencia (Mekalanos, 1992; Dziejman & Mekalanos, 1995). Este sistema regulador de dos componentes BvrS-BvrR de Brucella es esencial para la invasión de la célula huésped y para la virulencia in vivo. El sistema también percibe los estímulos intracelulares y una de sus funciones es que la bacteria llegue al autofagosoma.
Mutantes en el sistema BvrR/BvrS no sólo son más susceptibles a substancias bactericidas, sino también exhiben una superficie de membrana externa más hidrofóbica con respecto a la cepa B. abortus 2308 (Landa et al., 1998; Sola-Landa, 2000). Puesto que estas dos características han mostrado estar relacionadas con la integridad de la membrana externa, es probable que el sistema BvrR/BvrS regule de alguna manera la estructura de esta.
mutante bvrS- ata en números más altos a las células que la cepa B. abortus virulenta, la GTPasa Cdc42 es directamente activada sólo por la última cepa, indicando que el sistema BvrR/BvrS se requiere para reclutar los determinantes moleculares necesarios para la invasión (Guzmán-Verri et al., 2001).
Mutantes de bvrS- y bvrR- internalizados por macrófagos son rápidamente destruidos dentro de los fagolisosomas, mientras que los tipos silvestres de Brucella siguen su tráfico intracelular desde los primeros compartimentos vacuolares a los autofagosomas y finalmente al retículo endoplasmático, donde se replican ampliamente. Esto significa que, una vez dentro de las células los mutantes de bvrS- y bvrR- son incapaces de inhibir la fusión del lisosoma, indicando que el sistema BvrR/BvrS está involucrado no solo en la invasión celular, sino también en la maduración de la vacuola y el tráfico intracelular.
Cuando las brucelas son fagocitadas por células polimorfonucleares (PMN) o por células fagocíticas mononucleares, las brucelas se multiplican dentro de fagosomas, en el interior de los cuales, despliegan diversos mecanismos que bloquean o suprimen la respuesta bactericida de estas células (López & Contreras, 2004).
El lipopolisacárido liso (S-LPS) posiblemente juega un papel importante, ya que de forma natural las cepas lisas son más patógenas que las cepas rugosas, las cuales poseen virulencia reducida, sin embargo, existen en la naturaleza cepas rugosas que son patógenas, como B. ovis y B. canis y cepas lisas con virulencia reducida como B. neotomae. Lo anterior sugiere que el LPS no es la única molécula involucrada en la
virulencia y que existen otros factores como las proteínas superficiales que pueden participar en la interacción de Brucella con su célula huésped.
Dentro del macrófago, la bacteria debe enfrentarse a condiciones adversas como el pH, falta de nutrientes y presencia de intermediarios reactivos del oxígeno. Brucella debe resistir estas condiciones de estrés, para poder establecerse en el retículo endoplásmico. La supervivencia de Brucella dentro del macrófago, se ha asociado con la síntesis de enzimas antioxidantes (KatE y SodC). Estudios empleando mutantes de B. abortus catalasa-deficiente (katE) y Cu-Zn superoxido dismutasa-deficiente (sodC) indicaron que estas enzimas juegan un papel fundamental en la protección de estos organismos contra la exposición a H2O2 y O2- in vitro (Kim et al.,
2000; Gee et al., 2001). De igual forma se han asociado proteínas de variados pesos moleculares: 17, 24, 28, 60 y 62 kDa. La de 62 kDa, corresponde a la GroEL de choque térmico; las de 24 y 60 kDa se inducen en medio ácido y su producción se relaciona con la supervivencia de Brucella en condiciones ácidas (pH<4). Las proteínas de 17 y 28 kDa se han relacionado también con la supervivencia intracelular. La proteína HtrA, inducida por el estrés, está involucrada en la inducción de una respuesta granulomatosa temprana hacia B. abortus en el ratón. El papel de otras proteínas en la patogénesis de Brucella se desconoce, tal es el caso de las proteínas secuestradoras de hierro y de otros sideróforos. En general, a concentraciones bajas de hierro, se restringe el crecimiento microbiano y a elevadas se promueve la muerte de la Brucella.
replicación de Brucella. Es difícil imaginar como una replicación masiva de una bacteria intracelular parece no interferir con sus funciones fisiológicas importantes. En este sentido, se especula que Brucella produce una colección de determinantes moleculares que promueven la supervivencia de la célula huésped y la proliferación celular para su propio beneficio (Gorvel & Moreno, 2002). Aunque los mecanismos que emplea Brucella spp para producir daño al huésped, aún no se conocen con detalle, se acepta, que están muy relacionados con la permanencia intracelular de las bacterias. Esta ubicación intracelular, que la mantiene alejada de los antibióticos y de los componentes plasmáticos bactericidas como el complemento y los anticuerpos, probablemente determina la naturaleza crónica de la enfermedad (López & Contreras, 2004).
9. Respuesta Inmune.
Como resultado de una infección por bacterias Gram negativas, las células del huésped se exponen principalmente a dos diferentes categorías estructurales de antígenos, el lipopolisacárido (LPS) y las proteínas, los que ejercen diferentes formas de activación del sistema inmune. Las proteínas bacterianas antigénicas inducen una respuesta inmune específica tanto celular como humoral con células de memoria funcionales. La primera es más importante porque se le relaciona con la inmunidad protectora. Una vez que la bacteria es ingerida, muerta, y procesada sus antígenos proteicos se localizan en compartimientos dentro de las células presentadoras de antígeno y se procesan hasta pequeños péptidos (de 8 a 12 residuos), y quedan listos para asociarse con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de clase II. Estas moléculas presentadoras, que son heterodímeros, se translocan desde el retículo endoplásmico al aparato de Golgi antes de alcanzar la vía endocítica a través de la cual serán presentados en la superficie de la célula. Los linfocitos T CD4+ reconocen péptidos asociados al MHC clase II y los T CD8+ interaccionan con péptidos asociados al MHC clase I.
muestran que estas moléculas son capaces de activar linfocitos B, que inducen la producción de anticuerpos sin la aparente participación de las células T. El LPS no induce una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado como las proteínas (López & Contreras, 2004).
Los antígenos proteicos se presentan a células T cooperadoras (Th) con fenotipo CD4+, en general. Sin embargo, algunos antígenos de Brucella se expresan en el contexto del MHC de clase I, que provoca la activación de células T citotóxicas (Tc), con fenotipo CD8+. Las células Th incluyen a dos subpoblaciones que se distinguen entre ellas por sus funciones.
Las Th1 que controlan la respuesta de tipo celular, por medio de ciertas citocinas, en cambio las Th2, controlan la respuesta de anticuerpos por el mismo mecanismo. Las células Th1 participan en forma directa en la protección hacía patógenos intracelulares, produciendo IL-2 e IFN-g que induce la activación de macrófagos con mayor capacidad bactericida. Ambas subpoblaciones regulan la producción de los diferentes isotipos de anticuerpos en forma selectiva al producir distintas citocinas (López & Contreras, 2004).
La respuesta inmune celular de tipo ThI, es la que controla la infección y la eliminación completa de las bacterias.
9.1 Respuesta Inmune Innata.
et al., 1989). Se ha sugerido que la cadena O del LPS es un factor esencial de este patógeno para la sobrevivencia en ratones (Godfroid et al., 2002). Una vez la bacteria ha sido fagocitada, es expuesta al medio hostil de los compartimentos fagolisosomales dentro de la célula fagocítica. El ensamblaje de esta estructura puede ser inhibido por cepas virulentas de B. abortus, mediante extractos de superficie (proteínas, azúcares, aminoácidos y carbohidratos) no relacionados con los LPS, que inhiben la fusión fagosoma-lisosoma (Frenchick et al., 1984). La explosión respiratoria juega un papel muy importante en el proceso antibacterial de las células fagocíticas. Sólo las cepas de Brucella opsonizadas son capaces de inducir la liberación de cantidades significativas de radicales de oxígeno en macrófagos derivados de bovinos resistentes a la infección por B. abortus, comparado con macrófagos derivados de animales susceptibles (Harmon et al., 1985; Harmon et al., 1989). In vitro, líneas celulares de macrófagos y macrófagos peritoneales murinos, producen especies derivadas del nitrógeno reactivo, como el óxido nítrico, después de la activación con interferón gamma (IFNg) y la infección con diferentes especies de Brucella (Gross et al., 1998, 2000; Jiang et al., 1993).
protectora cuando la bacteria se expone a la actividad digestiva de los fagocitos (Freer et al., 1996; Martínez et al., 1995).
El gen Nramp1, que codifica la proteína del macrófago asociada con resistencia natural a patógenos intracelulares como Mycobacterium, Salmonella y Leishmania (Saldarriaga et al., 2002), ha sido ubicado en el cromosoma 2 bovino (Feng et al., 1996). Macrófagos derivados de bovinos seleccionados por la resistencia in vivo a la infección por B. abortus, restringieron la replicación intracelular, a Brucella abortus, Mycobacterium tuberculosis (BCG) y Salmonella dublin, significativamente mejor que macrófagos derivados de animales susceptibles (Qureshi et al., 1996). Estos mismos autores encontraron asociación significativa entre un polimorfismo del 3' UTR de gen Nramp1 bovino y la resistencia natural de ganado a la Brucelosis. La sobrevivencia de esta bacteria dentro de células fagocíticas y no fagocíticas, puede ser también aumentada por la expresión de proteínas como la enzima superóxido dismutasa Cu-Zn (SOD) (Tatum et al., 1992 Kim et al., 2000; Gee et al., 2001) y la proteasa de respuesta a temperaturas aumentadas (HtrA) (Elzer et al., 1996; Gajiwala & Burley, 2000). Estas proteínas juegan un papel importante en la patogenicidad inducida por la B. abortus ya que son importantes componentes de defensa contra la respuesta oxidativa generada por el hospedero.
Cuando un macrófago ingiere una bacteria, inicia una cascada de armas seleccionadas que pueden inducir la muerte del invasor. Sin embargo, la bacteria patogénica tiene desarrollados mecanismos moleculares para evitar el ataque del fagocito (Köhler et al, 2002). Cuando el ataque falla, un resultado común con las bacterias patogénicas, los macrófagos algunas veces pueden inducir su propia apoptosis para evitar la multiplicación bacteriana intramacrofágica (Monack et al., 1997; Müller et al., 1996; Ruckdeschel et al., 1998; Weinrauch & Zychlinsky, 1999). La inducción o prevención de la apoptosis de la célula huésped parece ser un paso crítico en la determinación del resultado de la infección.
dentro de las células infectadas. Las células invadidas y no invadidas están protegidas, indicando que mediadores solubles emanados durante la infección están envueltos en este fenómeno (Dornand et al., 2002).
En la inducción de la respuesta inmune humoral. El LPS es el primer antígeno frente al cual aparecen anticuerpos (Winter et al., 1989; Corbel, 1997) de tipo IgM e IgG, después de la infección natural o de la vacunación con la cepa 19. Ya que los anticuerpos pueden opsonizar las cepas patógenas, nuevas células fagocíticas podrían ser invadidas, potenciando la infección y promoviendo el establecimiento de la brucelosis bovina (Baldwin & Parent, 2002; Hofmann & Houle, 1983). Los anticuerpos tipo IgG también pueden proteger al huésped contra la liberación de grandes cantidades de endotoxinas (Hofmann & Houle, 1995). También se ha demostrado la producción de anticuerpos contra proteínas de membrana, como las OMPII (Gómez et al., 1995; Villamil et al., 1995). Si bien es cierto que la respuesta humoral ante estas proteínas no es tan fuerte como la observada contra el LPS, estos anticuerpos son importantes para el diagnóstico, cuando se utilizan cepas vacunales rugosas. De esta manera, otros antígenos, probablemente proteicos, podrían estar involucrados en la protección contra cepas lisas virulentas, ya que bovinos vacunados con cepas rugosas (RB51), aunque no producen anticuerpos contra el LPS de cepas lisas (2308), sí producen anticuerpos que reaccionan contra proteínas de estas cepas virulentas (Stevens & Steven CO, 1996).
9.2 Respuesta Inmune Específica.
demostrada por ensayos con ratones knockout para las moléculas del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) clase I y II (Oliveira & Splitter, 1996; Oliveira et al, 2002).
Algunas citocinas proinflamatorias y derivadas de la célula T han sido detectadas en sobrenadantes de esplenocitos derivados de animales sensibilizados, reestimulados con antígenos de Brucella. El papel de estas citocinas en el control de la infección ha sido investigado por el uso de citocinas recombinantes o por la inhibición especifica de sus funciones, utilizando anticuerpos monoclonales. Se ha demostrado que monocitos humanos (Zaitseva et al., 1996) y células adherentes derivadas de bazo murino (Olivera et al., 1998), expresan la IL-12, después de una estimulación in vivo con B. abortus y LPS derivados de esta bacteria. Esta inducción puede ser suprimida por anticuerpos monoclonales anti CD14, lo cual sugiere que los monocitos reconocen a B. abortus por medio de su receptor LPS. Esta producción rápida de IL-12 durante la infección con B. abortus, es de vital importancia para activar las células Th1 productoras de IFNg y de esta manera contribuir a la inducción de la resistencia celular adquirida. La supresión de la IL-12 endógena antes de la infección de ratones con B.abortus aumenta significativamente la infección por Brucella, probablemente por la disminución en la producción de IFNg por las células T de bazo, observada en estos ratones. Bajos niveles de IFNg no alcanzaron a estimular adecuadamente los macrófagos derivados de bazo, quienes a su vez mostraron una disminución en la producción de oxido nítrico (Zhan & Cheers, 1995b). La IL-12 inducida por B. abortus, también ha mostrado un gran efecto sobre células NK, ya que en éstas se
demostrando de nuevo la capacidad de esta bacteria para promover el patrón Th1 de diferenciación de la célula T (Zaitseva et al., 1995; Murphy et al., 2001). Sin embargo, aunque es conocido que la B. abortus induce el patrón Th1 de las células TCD4 (Zhan, Kelso & Cheers, 1993), las cepas 19 y 2308 de B. abortus pueden persistir en los bazos de ratones BALB/c infectados, entre 6 semanas y 6 meses respectivamente (Ho & Cheer, 1982; Montaraz & Winter, 1986). Adicionalmente, una respuesta Th1 con producción de IFNg puede promover la secreción de anticuerpos; como por ejemplo, en ratones los isotipos Ig G3 e Ig G2a, dirigidos contra el LPS de la cepa lisa de Brucella, han mostrado ser protectores.
De igual manera el factor de necrosis tumoral (TNFa.), una citocina proinflamatoria producida durante la fase temprana de la infección intracelular, también está involucrada en la resistencia a la Brucella abortus (Zhan, Liu & Cheers, 1996). Sin embargo, se ha demostrado que algunos subproductos proteicos de alto peso molecular derivados de la Brucella inhiben específicamente la expresión de TNFa. Y por lo tanto se han considerado como factores de virulencia (Caron et al., 1996). La inducción de TNFa y de los patrones Th1 y Th2 por cepas vivas y muertas de Brucella es diferente. Así, cantidades sustanciales de TNFa, fueron detectadas en los sobrenadantes de macrófagos peritoneales bovinos, después del reto con la Brucella viva. Por el contrario, estas células estimuladas con bacterias muertas por calor, no produjeron TNFa (Zhan & Cheers, 1995b).
determinación de la respuesta inmune. La IL-10 es una citocina involucrada en la regulación negativa de la respuesta inmune protectora contra B. abortus, mediante la inhibición de patrón Th1 o bloqueando las citocinas inducidas por la activación del macrófago (Fernandes & Baldwin, 1995). La inmunización de ratones con B. abortus inactivada, induce un incremento simultáneo de la expresión de genes de IL-10 y de IFNg en células TCD4+, independiente de la IL-2, sugiriendo que en la respuesta inmune primaria ambos patrones de citocinas son producidos. Además, aquí probablemente se está presentando un mecanismo de regulación fisiológica donde la respuesta inflamatoria es regulada negativamente por la IL-10 producida endógenamente (Svetic et al., 1993). De igual manera ratones deficientes en CMH clase I, donde no hay activación de células TCD8+, produjeron mayor cantidad de IL-10 que esplenocitos derivados de ratones con deficiencia en CMH de clase II. Los altos niveles de IL-10 se correlacionaron con un incremento de la susceptibilidad a la infección por brucelosis en ratones deficientes de CMH de clase I. Se sugiere entonces que las células TCD8+ pueden inhibir la producción de IL-10; por esto la brucelosis murina es más grave en ratones defectuosos para CMH de clase I (Olivera et al., 1998).
La identificación de antígenos derivados de esta bacteria, que puedan inducir una inmunidad mediada por células protectoras (Th1) ha sido el objetivo de varios estudios. El uso de una proteína ribosomal L7/L 12, producida por tecnología recombinante en E. coli, estimuló un perfil Th1 (IFNg e IL-2) en ratones infectados con B. abortus (Oliveira & Splitter, 1996). Además la inmunización de ratones con esta proteína, confiere protección contra la infección producida por B. abortus (Oliveira & Splitter, 1996). Otros componentes proteicos derivados de esta bacteria, como las proteínas de la membrana externa (OMP II) y la superóxido dismutasa (SOD Cu/Zn), han mostrado inducir una inmunidad mediada por células en bovinos (Montaña et al., 1998; Oñate & Folch, 1995).
interacciones de las células presentadoras de antígeno (CPA) con las células T, sugiriendo el potencial uso de esta cepa inactivada como una vacuna que favorece una amplia respuesta inmune celular (Zaitseva et al., 1996).
Ya que los linfocitos T derivados de diferentes hospederos como humanos, ratones y bovinos, proliferan mostrando un perfil de citocinas Th1 de manera análoga en respuesta a la infección por Brucella (Olivera et al., 1998), las vacunas deberían preferencialmente inducir un patrón Th1, para generar una óptima resistencia contra la infección inducida por esta bacteria. La inducción de una respuesta Th2 parece ser contraproducente para el control de la infección causada por estas bacterias (Saldarriaga et al., 2002).
10. Resistencia y Supervivencia.
Las especies del géneroBrucella a diferencia de otras bacterias patógenas posee una gran capacidad para sobrevivir y persistir en el ambiente bajo condiciones apropiadas, comparable a la resistencia de bacterias esporuladas. Bajo condiciones de baja temperatura, humedad moderada, Ph cercano a la neutralidad y protección contra el sol, las brucelas pueden sobrevivir por largos períodos aunque no existe evidencia de que los organismos se repliquen significativamente bajo estas condiciones en el suelo, agua o estiércol. En los restos de animales congelados, las bacterias sobreviven por muchos años. En materiales desecados que contengan materia orgánica y protegidos de la luz solar, pueden retener su infectividad por muchos años (López & Contreras, 2004).
otras bacterias, la susceptibilidad se reduce en presencia de materia orgánica o a bajas temperaturas. El etanol, isopropanol, iodóforos, hipoclorito diluido y el fenol al 1% son eficaces para desinfectar la piel expuesta a Brucella.
En general, Brucella es susceptible a la mayoría de los antibióticos, como lo muestran los trabajos publicados en los que se realizaron ensayos in vitro empleando diferentes métodos. Las sulfonamidas, los aminoglicósidos como la estreptomicina, gentamicina, kanamicina, amikacina, tobramicina; las tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina, novobiocina, rifampicina y quinolonas como norfloxacina, ciprofloxacina, esparfloxacina y moxifloxacina, todos ellos son activos contra Brucella in vitro a concentraciones mínimas inhibitorias bajas. Los antibióticos beta lactámicos son los menos efectivos. Las cepas muestran alguna variación en la susceptibilidad a los antibióticos en función de su origen geográfico (López & Contreras, 2004).
11. Brucelosis En el Humano
Al ser la brucelosis una zoonosis, la fuente de infección la constituyen los animales infectados que, en su mayoría son aquellas especies productoras de alimento. B. abortus está más extendida en el mundo, sin embargo, se aísla poco de casos humanos. La infección en el hombre es a menudo subclínica, y cuando presenta alguna sintomatología es, en general, menos severa que la causada por B. melitensis o B. suis. Las vacas y sus productos son la fuente de infección más común, aunque los
perros también pueden jugar un papel importante en la epizootiología de la enfermedad en nuestro medio rural. B. melitensis es la que más se notifica como causa de enfermedad, se aísla con mayor frecuencia de los casos humanos, casi en un 90%. Es la especie más virulenta y está asociada a una enfermedad aguda severa. La bacteria infecta principalmente a cabras y ovejas, pero otras especies no quedan exentas.
abrevan. En consecuencia, todas las especies mencionadas contribuyen en diferente medida a la contaminación del suelo, los traspatios, corrales, la paja de las camas, el agua de arroyos, canales y pozos. También Brucella se excreta en la leche y el calostro. En repercusión, el hombre puede adquirir la bacteria por: exposición ocupacional, contacto con medios ambientes contaminados, consumo de agua y alimentos contaminados, y menos frecuente por transmisión de persona a persona. El predominio de un mecanismo de infección u otro dependerá de las condiciones socioeconómicas y de los hábitos del individuo así como de las características del medio social que se considere. En los países que tienen un mejor nivel sanitario, la enfermedad es de carácter casi exclusivamente profesional, mientras que en los menos desarrollados, una parte importante de los casos corresponde a la población general, que adquiere la infección a través de la ingesta de productos lácteos no controlados, principalmente leche y queso fresco (Dornand, et al., 2002; López & Contreras, 2004; Richey & Harrel, 1997).
Las personas se infectan al inhalar polvo o pelo contaminado, por salpicaduras en la conjuntiva, por ingestión accidental, a través de abrasiones o cortaduras de piel o por auto inoculación accidental de sangre del animal infectado o de vacunas vivas.
Es difícil determinar hasta que grado el paso de los animales por ciertos caminos o rutas pobladas puede producir contaminación de calles, patios mercados, etc. Brucella spp puede sobrevivir por períodos prolongados en el polvo, estiércol, agua, fetos, suelo, vísceras y productos lácteos (Dornand et al., 2002) .
cantidad de brucelas. En cambio las vísceras, la ubre y los testículos contienen cantidades importantes de bacterias. La sangre fresca es potencialmente peligrosa para aquellos individuos que acostumbran consumirla natural o mezclada. La transmisión de persona a persona es muy rara, en los casos reportados solo existe evidencia circunstancial que sugiere que la transmisión se produjo por vía sexual. De mayor importancia es la infección como resultado de una transfusión de sangre o de un transplante de tejido, la médula ósea es la de mayor riesgo. Otra forma de transmisión es de la madre con brucelosis aguda al hijo a través de la leche materna o de la placenta produciendo aborto o brucelosis en el recién nacido.
El periodo de incubación suele ser variable, en general, de 2 a 3 semanas, aunque puede prolongarse hasta algunos meses. De algún modo, éste depende de: la virulencia de la cepa de Brucella, la dosis y del estado nutricional e inmune del individuo (López & Contreras, 2004).
La brucelosis humana ha sido clasificada en forma arbitraria en varias categorías: subclínica, subaguda, bacterémica, aguda, recurrente, crónica, etc. Dichos términos reflejan el espectro de las manifestaciones clínicas pero complican el diagnóstico. La mayoría de los autores coinciden en considerar solo las fases aguda y crónica.
Por otro lado, la brucelosis típica en la etapa aguda, no siempre se identifica con facilidad, ya que los signos y síntomas podrían ser la expresión de otras enfermedades febriles comunes en nuestro medio. En consecuencia, se tienen que descartar enfermedades como: salmonelosis, tifoidea, dengue, paludismo, tuberculosis, leptospirosis y otras que sean prevalentes en las zonas donde se presenten los casos. Las manifestaciones clínicas de la brucelosis son diversas y el curso de la enfermedad es variable. Pacientes con brucelosis pueden presentar una enfermedad febril aguda, sistémica; una infección crónica; o un proceso inflamatorio localizado (Rodríguez, et al., 2002).
infecciones focales de huesos, articulaciones, o de la zona genitourinaria pueden causar dolor local. Tos, dolor de pecho, y dispepsia también pueden ser observados. Los pacientes con infecciones crónicas pierden con frecuencia de peso. Los síntomas duran a menudo por 3 a 6 meses y de vez en cuando por un año o más. Los exámenes físicos son generalmente normales, aunque puede ocurrir hepatomegalia, esplenomegalia y linfoadenopatía. La brucelosis no causa generalmente leucocitosis, y algunos pacientes pueden presentarse moderadamente neutropenicos.
Aunque las manifestaciones de la enfermedad no se pueden relacionar terminantemente con la especie que causa la infección, B. melitensis tiende a causar una enfermedad más severa y más sistémica que las otras brucelas; B. suis causa principalmente una enfermedad supurativa localizada.
La infección con B. melitensis produce enfermedad ósea y articular en aproximadamente el 30% de pacientes; la sacroileitis se convierte en el 6% al 15%, particularmente en adultos jóvenes. La sacroileitis e infecciones comunes periféricas y la destrucción del hueso es inusual (Rodríguez, et al., 2002).
La espondilitis, otra manifestación osteoarticular importante de la brucelosis, tiende a afectar a pacientes de mediana edad o mayores, causando dolor (generalmente lumbar) y de vez en cuando síntoma radicular.
Las infecciones del pulmón también se han descrito, particularmente antes del advenimiento de antibióticos eficaces. Aunque hasta un cuarto de pacientes puede quejarse de síntomas respiratorios, sobre todo de tos, disnea, dolor pleurítico, exámenes de rayos X del pecho son generalmente normales, aunque se pueden observar infiltraciones locales o difusas, efusión pleural, abscesos y granulomas. La hepatitis y, raramente, abscesos en el hígado pueden ocurrir. Elevaciones leves en suero de lactato deshidrogenasa y fosfatasa alcalina son comunes. La biopsia puede demostrar granulomas bien formados o hepatitis no específica con colecciones de células mononucleares.
La infección del sistema nervioso central se manifiesta generalmente como meningoencefalitis crónica, pero también se pueden presentar la hemorragia subaracnoide y mielitis (Rodríguez, et al., 2002; López & Contreras, 2004).
Para un tratamiento efectivo, ya que Brucella en una bacteria intracelular facultativa, se recomienda seleccionar aquellos antibióticos, que tengan la propiedad de penetrar dentro de las células blanco y que la dosis y duración del tratamiento sean las más adecuadas. De acuerdo a la Organización Mundial de la Salud se debe establecer un tratamiento con doxicilina 200 mg/día más rifampicina 600/900 mg/día por un periodo de seis semanas para lograr la eliminación de Brucella (López & Contreras, 2004).
El diagnóstico de la brucelosis en el humano debe considerar aspectos clínicos, y contar con una historia clínica detallada que incluya alguna información de tipo epidemiológico. Es muy recomendable practicar un estudio bacteriológico, complementado con la búsqueda de anticuerpos en el suero.
El cultivo de la bacteria es la única evidencia contundente de que se trata de una infección por Brucella. Aunque se puede aislar de varias fuentes, la sangre es el material que se emplea con mayor frecuencia para realizar el cultivo bacteriológico. Existen algunas recomendaciones que deben tomarse en cuenta para lograr el cultivo con éxito, en primer lugar el paciente no debe encontrarse bajo terapia antibiótica al momento de tomar la muestra y de preferencia se debe practicar durante la fase aguda de la enfermedad, por la tarde, antes de que se alcance el pico febril. Una vez que se tenga el crecimiento de colonias sospechosas, se recomienda realizar una identificación presuntiva (López & Contreras, 2004; Rodríguez, et al., 2002).
comunes como Rosa de Bengala, Fijación de Complemento y ELISA entre otras (López & Contreras, 2004).
12. Transmisión de la Brucelosis Bovina.
La forma principal de contagio es la vía digestiva, esta se produce cuando los animales lamen fetos abortados, terneros recién nacidos y/o los genitales de otros animales, y si estos están brucelosos se produce una ingestión masiva de bacterias. También es importante la ingestión de pastos, forrajes y aguas contaminados con secreciones vaginales y leche de hembras enfermas. Algunos autores consideran que el contagio por vía cutánea tiene por lo menos, la misma importancia, por ejemplo: se pueden producir infecciones mediante las camas infectadas, cuando haya lesiones en las tetillas o en los extremos de los miembros o en el espacio interdigital que faciliten la penetración del agente patógeno en capas profundas de la piel, al ordeñar, quizás puedan introducir Brucella en la piel de los pezones las manos humedecidas con leche infectada (Rodríguez et al., 2005). La vía genital puede ser importante solo si se realiza inseminación artificial con semen infectado, de lo contrario, la brucelosis bovina no es una enfermedad venérea. El semen de un toro infectado puede contener grandes cantidades pero sin embargo no contagia a la vaca. La razón es que la acidez de la vagina contribuye a destruir a las brucelas.
